专利名称：基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及果实采后病害防治技术领域，更具体的是涉及一种用于防治柑橘果实病害的生物防腐保鲜技术。
背景技术：
柑橘栽培历史悠久，是重要的水果之一。但柑橘产区一般均地处亚热带地区，温湿度均较适合果实病原菌的生长，每年由于病理性腐烂导致的采后损失巨大。目前，化学杀菌剂是控制果实采后腐烂的主要和最有效方法。但是，随着国家经济发展和消费水平的提高， 人们对食品安全和环境保护意识的增强，化学类杀菌剂的使用范围越来越受限制。此外由于长期使用杀菌剂，病原菌能进化产生了大量抗药性菌种。因此从可持续发展的角度出发， 开发新型、高效且安全的有机、绿色的保鲜剂具有重大的社会意义和广阔的应用前景。近年来利用安全且有拮抗病原菌活性的酵母防治果实病害的研究受到了国内外广泛的重视，被认为是最有希望的替代化学杀菌剂的方法之一。但现有生防酵母对病害的控制效力与化学杀菌剂相比仍有较大差距，例如即使是已经商业化生产的产品(Aspire，基于酵母Candida oleophila，美国)也只有在与低剂量杀菌剂(thiabendazole，TBZ)联合使用时才能达到对柑橘或葡萄等果实病害的完全控制。酵母菌株Rhodosporidium ρ aludigenum Fell & Tallman 是一株从我国近东海海水中分离得到的新型果实病害生防酵母。该酵母对柑橘酸腐、樱桃番茄和冬枣等果实采后病害的控制已有报道(王一非等，2008，2009，2010abc，2011 ；刘霞等，2010)。中国发明授权专利《一株水果蔬菜的生物保鲜剂及其制备方法》，专利号200610155209. 0，公开了一种基于红冬孢酵母和尼泊金乙酯钠或尼泊金丁酯钠制备水果蔬菜的生物杀菌剂的方法。中国发明授权专利《用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途》， 专利号 ZL200610155062. 5，公开了一种用海洋酵母菌株 Rhodosporidium ρ aludigenum Fell & Tallman抑制链格孢、灰葡萄孢、扩展青霉、指状青霉、多毛孢等多种果蔬采后主要真菌病害的生物防治方法。中国发明授权专利《一种海洋酵母的用途和相应微生物燃料电池及制备方法》。授权公告号CN101552340B，公开了一种利用红冬孢酵母制备微生物燃料电池的方法。中国发明申请专利《一种防治果蔬病害的生物保鲜剂及其制备方法》，申请号200910095643. 8，公开了一种基于红冬孢酵母和羧甲基纤维素钠等物质防治果蔬病害的生物保鲜方法。中国发明申请专利《海洋酵母Miodosporidum paludigenum Fell & Tallman的专用甘蔗糖蜜培养基》，申请号2010101485270，公开了一种海洋酵母Rhodosporidumpaludigenum Fell & Tallman液体培养的方法。中国发明申请专利 《海洋酵母Iihodosporidumpaludigenum Fell & Tallman的真空冷冻干燥制》，申请号 2010101400817，公开了一种红冬孢酵母活性干粉制备的方法。中国发明申请专利《一种诱导提高海洋红冬孢酵母对果实病害防治效力的方法》，申请号2010105517M. 8，公开了一种利用几丁质物质诱导提高红冬孢酵母生防效力的方法。诱导抗性是当前国内外关注的新型采后病害控制方法之一。研究表明，植物包括采后果蔬，经过预先接种或采用一些物理的、化学的因子处理后，可诱导产生抗病性，从而减少病害发生。能引起植物产生抗病性的因素根据其来源分为生物型和非生物型激发子。 其中水杨酸是研究最为广泛的激发子之一，而细胞分裂素、生长素、赤霉素等植物激素对果实抗性影响的研究尚少。参考文献1、Wang Yifei, Bao Yihong, Shen Danhong, Feng ffu, Yu Ting, Zhang Jia and Zheng XiaoDong. 2008. Biocontrol of Alternaria alternata on cherry tomato fruit by use of marine yeastRhodosporidium paludigenum Fell & Tallman. International Journal of Food Microbiologyl23 :234-239.(王一非等，2008，海洋 Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman对樱桃番茄链格孢生物防治的研究，国际食品微生物，123 : 234-239)。2、Wang Yifei, Yu Ting, Li Y.，Cai D.，Liu X.，Lu H. and Zheng X. D. . 2009. Postharvestbiocontrol of Alternaria alternata in Chinese winter jujube by Rhodosporidium paludigenum. Journal of Applied Microbiology 107:1492-1498.(王一非等，2009，海洋 Rhodosporidiumpaludigenum Fell & Tallman 对冬枣链格孢生物防治的研究，应用微生物杂志，107 :1492-1498.)。3、Liu Xia. , Fang ffeiwen. , Liu L, Yu Ting. , Lou Bingan. and Zheng Xiaodong. . 2010. Biological control of postharvest sour rot of citrus by two antagonistic yeasts. Letters in AppliedMicrobiology 51 :30-35.(刘霞等，2010, 2 禾中拮抗菌对柑橘酸腐病的生物控制，应用微生物学报，51 30 35.)。4、Wang Yifei, Yu Ting，Xia Jindan, Yu Dasheng，Wang Jun，Zheng Xiaodong. 2010a. Biocontrol of Postharvest Gray Mold of Cherry Tomatoes with the Marine YeastRhodosporidium paludigenum，Biological Control 53 :178 182.(王一非等，2010a，海洋 Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman 对樱桃番茄釆后灰霉病的生物防治，生物控制，53 178 182.)。5、Wang Yifei, Wang Peng，Xia Jindan，Yu Ting，Lou Binggan, Wang Jun，Zheng XiaoDong. 2010b. Effect of water activity on stress tolerance and biocontrol activity in antagonisticyeast Rhodosporidium paludigenum. International Journal ofFood Microbiology 143 :103-108.(王一非等，2010b，水分活度对海洋 Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman逆境和生防效力的影响，国际食品微生物，143 :103-108.)。6、Wang Yifei Fei，Ren X.，Song X，Yu Ting.，Lu Huangpin.，Wang Peng.，Wang J. andZheng Xiao. Dong. . 2010c. Control of postharvest decay on cherry tomatoes by marine yeastRhodosporidium paludigenum and calcium chloride. Journal of Applied Microbiology 109 :651-656.(王一非等，2010c.，海洋Rhodosporidium paludigenum Fell & fTallmm和氯化钙对樱桃番茄釆后病害的防治研究，应用微生物杂志，107 :1492-1498.)。7、Wang, Yifei Fei Tang, Jindan Xia, Ting Yu, Jun Wang, Remila Azhati, Xiao DongZheng. 201IA combination of marine yeast and food additive enhances preventive effects onpostharvest decay of jujubes (Zizyphus jujuba). Food Chemistry，125 :835-840.(王一非等，2011.，海洋 Rhodosporidium paludigenum Fell &Tallman和食品添加剂对冬枣采后病害的防治研究，食品化学，107 :1492-1498.)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种在不使用化学杀菌剂前提下能有效控制柑橘果实采后病害的生物保鲜剂。为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂，该保鲜剂由红冬孢酵母悬浮液、赤霉素(GA4+7)/激动素(6-BA)、水杨酸 (SA)、生长素(IBA)和水组成，每IL保鲜剂中含有IX 101° IX IO12个红冬孢酵母细胞、 50 150mg的赤霉素或者50 150mg的激动素、8 IOOmg的水杨酸和10 500mg生长素，其余为水；红冬孢酵母是保藏号为IMI 394084的海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell &Tallman。作为本发明的基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂的改进 每IL保鲜剂中含有IX IOltl个红冬孢酵母细胞、IOOmg的水杨酸、IOOmg生长素和赤霉素 (GA4+7)100mg，其余为水。作为本发明的基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂的另一种改进每IL保鲜剂中含有1 X 101°个红冬孢酵母细胞、IOOmg的水杨酸、IOmg生长素和激动素 (6-BA)100mg，其余为水。本发明所选用的海洋酵母(Rhodosporidiumpaludigenum Fell & Tallman) 被保藏于英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心(International Mycological Institute, CABI Genetic Resource Collection)，保藏地址英国 TW209TY 萨里郡艾格镇贝克汉姆路国际农业与生物中心英国中心，保藏日期2006. 4. 19，保藏编号 IMI 394084。该菌株已经在申请号为200610155209. O的专利中被公开。在本发明中，水杨酸为邻羟基苯甲酸，生长素为吲哚丁酸，激动素为6-苄氨基嘌呤。本发明的生物保鲜剂，是将果实用红冬孢酵母(lihodosporidium paludigenum Fell &Tallman，英国国际真菌研究所国际农业与生物中心基因资源保藏中心保藏编号 IMI394084)悬浮液和果实抗性激发子复合进行处理而得；其可以进行常温或低温贮藏。本发明的生物保鲜剂只有在确保酵母活性的基础上才能发挥最佳的防腐效应，因此所用的红冬孢酵母悬浮液是指经过菌种活化、并配制成的具有抑菌效果且浓度适宜的酵母菌悬液，其有效浓度为IXIO7细胞/毫升 IX IO9细胞/毫升。红冬孢酵母和果实抗性激发子的复合处理是指将果实抗性激发子成分直接添加到酵母菌菌悬液中而制成的生物保鲜剂。本发明所设定的果实抗性激发子的有效浓度是指其使用量确保不抑制拮抗酵母的生长和繁殖，并能发挥果实抗性激发子特定生理功能的浓度。本发明的生物保鲜剂有效整合了生防酵母、果实抗性激发子的活性，从而能显著抑制柑橘果实病害的发生和发展；由于能根据具体情况大幅度降低拮抗酵母的使用量，从而显著降低成本。本发明的生物保鲜剂具有安全高效、环境友好、病害防治效果突出等优点。使用本发明的生物保鲜剂，能转变长期以来依赖化学杀菌剂为主的果实真菌病害控制方法，对确保食品安全、环境保护和农业增效、农民增收和经济社会可持续的发展等具有重要意义。实际使用时，可任选以下任意一种处理方式对果实进行处理处理方式一选择无机械损伤、未感染、大小和成熟度等外观品质基本一致的果实，用自来水冲洗、并在室温(25°C左右)下放干。将果实在本发明的生物保鲜剂中浸泡3 分钟后，取出放干，然后放入保鲜薄膜袋中在室温(25°C左右)下保持20 M小时，接着将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。处理方式二 采前采用喷壶喷洒的处理方法，将本发明的生物保鲜剂溶液喷在果实表面(湿润即可)，待干后取下果实放入保鲜薄膜袋中在室温(25°C左右)下保持20 24小时，再将果实从薄膜袋中取出，装箱贮藏。
具体实施例方式以下实验中的果实为正常商业成熟度的柑橘(Citrus unshiu Marc.)果实，试验品种为早桔。选择无机械损伤、未感染、大小和成熟度等外观品质基本一致的果实，用质量浓度0. 的次氯酸钠溶液浸泡消毒1-2分钟后，用自来水冲洗，在室温下O0-25°C )放干后备用。拮抗酵母为红冬孢酵母(保藏号为IMI 394084的海洋酵母lihodosporidium paludigenum Fell& Tallman)；病原菌为指状青霄(Penecillium digitatum)。 /K杨酸 (SA)，分析纯AR，上海化学试剂采购供应五联化工厂；激动素(6-BA)，生化试剂BR，国药集团化学试剂有限公司；生长素(IBA)，化学纯CP，国药集团化学试剂有限公司；赤霉素 (GA4+7)，生化试剂BR，中国医药(集团)上海化学试剂公司。红冬孢酵母悬浮液的制备方法如下以下所用的NYDA培养基为牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20克，水定容至1000ml，高压(lkg/cm2)12rC灭菌30分钟。所用的NYDB种子培养基为牛肉浸膏8g、 酵母粉5g、葡萄糖10g，水定容至1000ml，高压(lkg/cm2) 121°C灭菌30分钟。红冬孢酵母IMI 394084在低温)下保存在NYDA培养基中。培养程序依次为①、活化红冬孢酵母IMI 394084先在NYDA培养基中培养48小时，然后重复传代培养2次(每次均为在NYDA培养基中培养48小时)；将上述重复传代培养2次所得的活化好的酵母用接种环接到NYDB种子培养基中， 下培养M小时；然后在相同条件下重复培养1次(即将NYDB种子培养基中培养而得
的酵母再次用接种环接到NYDB种子培养基中，28°C下培养M小时)；②、液体培养用步骤①活化所得的酵母按照5% (重量比)的接种量接到NYDB种子培养基中，在200rpmJ8°C条件下培养M小时；③、离心分离将步骤②液体培养后的所得物在3000rpm条件下，离心10分钟，并用灭菌蒸馏水洗2次，以去除培养介质；④、悬浮和确定浓度用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，用血球记数板的方法确定酵母的浓度，并用无菌蒸馏水调整到试验所需要的浓度。实施例1、一种基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂在2升的红冬孢酵母IMI 394084悬浮液(有效浓度为5 X IO7细胞/毫升)中缓慢加入浓度为1000mg/L的SA溶液1000毫升、浓度为1000mg/L的IBA溶液1000毫升和浓度为1000mg/L的赤霉素溶液1000毫升，搅拌混勻5分钟，加水稀释到10升备用。该最终所得的每L生物保鲜剂中含有1 X 101°个红冬孢酵母IMI 394084细胞、SA100mg/L、IBAlOOmg/ L和赤霉素100mg/L，其余为水。实施例2、一种基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂在2升的红冬孢酵母IMI 394084悬浮液(有效浓度为5 X IO7细胞/毫升)中缓慢加入浓度为1000mg/L的SA溶液1000毫升、浓度为1000mg/L的IBA溶液100毫升和浓度为1000mg/L的激动素溶液1000毫升，搅拌混勻5分钟，加水稀释到10升备用。该最终所得的每L生物保鲜剂中含有1 X 101°个红冬孢酵母IMI 394084细胞、SA100mg/L、IBAlOmg/ L和激动素100mg/L，其余为水。为了证明本发明的基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂的实际使用效果，发明人进行了如下的实验柑橘果实生物保鲜剂的效果实验用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和的深度的伤口。将红冬孢酵母 IMI394084细胞悬浮在含有各种不同成分及含量的病害控制物中，从而获得不同的组合试剂；各取50μ 1不同的组合试剂分别添加到不同的果实伤口处。病原菌接种在以上处理2 小时后在每个伤口加入等量(30μ1)的病原菌孢子悬浮液(Penecillium digitatum浓度为104spores/ml)。处理完毕后在常温QO 25°C )下贮藏，并用PE塑料膜密封作保湿处理。每个处理每重复12个果实，每处理重复3次。具体处理安排如下处理1 处理液所含成分浓度为红冬孢酵母IMI 394084细胞悬浮液浓度为 lX107cells/ml ；处理2 处理液所含成分浓度分别为红冬孢酵母IMI 394084细胞悬浮液浓度为 107cells/ml，水杨酸(SA) 10mg/L、生长素(IBA) 10mg/L、赤霉素(GA4+7) 10mg/L。处理3 (即实施例1)处理液所含成分浓度分别为红冬孢酵母IMI 394084细胞悬浮液浓度为 107cellS/ml，水杨酸(SA) 100mg/L、生长素(IBA) 100mg/L、赤霉素(GA4+7) IOOmg/ L0处理4 处理液所含成分浓度分别为红冬孢酵母IMI 394084细胞悬浮液浓度为 107cells/ml，水杨酸(SA) 100mg/L、激动素(6-BA) 10mg/L、赤霉素(GA4+7) 10mg/L。处理5 处理液所含成分浓度分别为红冬孢酵母IMI 394084细胞悬浮液浓度为 107cells/ml，激动素(6-BA) 10mg/L、生长素(IBA) 10mg/L、赤霉素(GA4+7) 100mg/L。处理6 处理液所含成分浓度分别为红冬孢酵母IMI 394084细胞悬浮液浓度为 107cells/ml，激动素(6-BA) 10mg/L、生长素(IBA) 100mg/L、水杨酸(SA) 10mg/L。处理7 处理液所含成分浓度分别为红冬孢酵母IMI 394084细胞悬浮液浓度为 107cells/ml，激动素(6-BA) 100mg/L、赤霉素(GA4+7) 100mg/L、水杨酸(SA) 10mg/L。处理8 (即实施例2~)处理液所含成分浓度分别为红冬孢酵母IMI 394084细胞悬浮液浓度为 107cellS/ml，激动素(6-BA)100mg/L、生长素(IBA) 10mg/L、水杨酸(SA)IOOmg/ L0处理9 处理液所含成分浓度分别为红冬孢酵母IMI 394084细胞悬浮液浓度为107cells/ml，激动素(6-BA) 100mg/L、生长素(IBA) 100mg/L、赤霉素(GA4+7) 10mg/L。处理10 对照，处理液所含成分浓度为108ells/ml红冬孢酵母单独使用对照。处理11 对照，处理液所含成分浓度为109ells/ml红冬孢酵母单独使用对照。处理12 对照，处理为水，即空白对照。处理13 处理液所含成分浓度为水杨酸(SA) 100mg/L单独使用。处理14 处理液所含成分浓度为激动素(6-BA) 100mg/L单独使用。处理15 处理液所含成分浓度为生长素(IBA) 100mg/L单独使用。处理16 处理液所含成分浓度为赤霉素(GA4+7) 100mg/L单独使用。处理17 处理液所含成分浓度分别为水杨酸(SA) 100mg/L、(6-BA) 100mg/L、生长素(IBA) 100mg/L、赤霉素(GA4+7) 100mg/L 混合使用。实验结果如表1所示表1.实验结果
权利要求
1.基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂，其特征是所述保鲜剂由红冬孢酵母悬浮液、赤霉素/激动素、水杨酸、生长素和水组成，每IL保鲜剂中含有1 X 101° 1 X IO12个红冬孢酵母细胞、50 150mg的赤霉素或者50 150mg的激动素、8 IOOmg的水杨酸和10 500mg生长素，其余为水；所述红冬孢酵母是保藏号为IMI 394084的海洋酵母Iihodosporidium paludigenum Fell& Tallman。
2.根据权利要求1所述的基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂，其特征是所述每IL保鲜剂中含有1 X 101°个红冬孢酵母细胞、IOOmg的水杨酸、1OOmg生长素和赤霉素lOOmg，其余为水。
3.根据权利要求1所述的基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂，其特征是所述每IL保鲜剂中含有1 X 101°个红冬孢酵母细胞、IOOmg的水杨酸、1Omg生长素和激动素lOOmg，其余为水。
全文摘要
本发明公开了一种基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂，该保鲜剂由红冬孢酵母悬浮液、赤霉素/激动素、水杨酸、生长素和水组成，每1L保鲜剂中含有1×1010~1×1012个红冬孢酵母细胞、50~150mg的赤霉素或者50~150mg的激动素、8~100mg的水杨酸和10~500mg生长素，其余为水；红冬孢酵母是保藏号为IMI394084的海洋酵母RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman。本发明的生物保鲜剂，能在不使用化学杀菌剂的前提下有效控制柑橘果实的采后病害。
文档编号A23B7/154GK102160572SQ201110112540
公开日2011年8月24日 申请日期2011年5月3日 优先权日2011年5月3日
发明者余挺, 努尔哈音, 朱瑞瑜, 蓝天演, 郑晓冬, 钱成济 申请人:浙江大学