专利名称：人GSK-3β基因的小干扰RNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸技术领域，具体地说涉及RNA干扰技术，更具体地涉及具有抑制人GSK-3P基因表达的小分子干扰核糖核酸及其应用。
背景技术：
RNA干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing),是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing,PTGS)。最早有关RNA干扰的报道出现在 1990 年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的RNA干扰现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了 RNA干扰现象。1999年,HamiIton和Baulcombe在发生RNA干扰的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片断被证明是RNA干扰所必需的，称为小分子干扰RNA(siRNA)。双链siRNA与细胞源性的相关酶和 蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)。在RNA干扰过程中，双链siRNA中的正义链被排除出复合体，反义链指导RISC结合到靶mRNA的相应位点，然后由复合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNA，从而关闭靶基因的表达。研究表明，长度为21_23nt 的小 RNA分子(small interfering RNA, siRNA)是引起RNA 干扰的直接原因(Tuschl T, Zamore PD, Sharp PA, Bartel DP. RNAi double-strandedRNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23nucleotide intervals.Cell 2000,101 :25-33. )。RNA干扰在抑制基因表达方面具有高效性、简单性和特异性，目前在基因功能研究和疾病治疗中发挥了重要作用。近几年来，RNA干扰已经在肿瘤治疗方面取得了一些成果(Uprichard, Susan L. The therapeuticpotential of RNA interference.FEBS Letters 2005,579 :5996-6007) 糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，最初研究发现GSK-3是参与糖代谢的主要限速酶之一，GSK-3可使糖原合成酶磷酸化而抑制糖原合成。但近年来的研究表明，GSK-3除参与糖代谢外，还参与细胞内其他重要生理过程，如细胞分化、增殖和凋亡等。GSK-3主要有两种亚型GSK-3 a和GSK-3 ^，其中GSK-3 ^是细胞内多种信号传导通路的重要成分，不仅参与胰岛素信号通路调节，还参与Wnt信号通路和NF-kappa B信号通路等的调节。GSK-3 P在体内调节机制很复杂，主要的调节方式包括磷酸化调节、蛋白复合体形成、细胞内分布和一些抑制剂调节，其调节的底物有酶、结构蛋白和转录因子等。人类多种疾病如糖尿病、肿瘤、神经退行性疾病、情感障碍和炎症等疾病的发生都与GSK-3P活性调节异常有关，因此GSK-3P已经成为多种疾病治疗的潜在靶点。研究GSK-3P功能活性，开发GSK-3P抑制剂已经成为新药开发热点，目前研究发现至少有50多个有效抑制GSK-3 ^的化合物。目前开发的GSK-3 ^抑制剂在化学结构上差异很大，在作用机制上主要以小分子ATP竞争性抑制剂为主。目前，GSK-3P抑制剂临床应用面临的一个重要问题是其选择性低，容易引起副作用。因此，临床还需要开发选择性更高、特异性更好的GSK-3P的抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够高效、特异性抑制人GSK-3 ^基因表达的小干扰核
糖核酸。为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种分离的人GSK-3 ^基因小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列，其中所述靶序列为SEQ ID NO 1-10中任意一条序列。本发明第二方面提供了一种小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含SEQ ID NO 1-10的序列编码的RNA序列，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段能形成双链RNA，该双链RNA能抑制人GSK-3 P基因的表达。对于上述小分子干扰核糖核酸来说，所述正义RNA片段和反义RNA片段可以存在于两条不同的RNA链上，也可以存在于同一条RNA链上。当正义RNA片段和反义RNA片段存在于同一条RNA链上时，所述核糖核酸优选为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片段和反义 RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。对于上述任一项所述的小分子干扰核糖核酸，其中正义RNA片段和反义RNA片段的长度为15-27个核苷酸，优选为19-23个核苷酸，更优选为19、20或者21个核苷酸。对于任一项所述的小分子干扰核糖核酸，其中双链RNA的互补区域至少有15个碱基对，优选至少有18个碱基对。具体来讲，所述小分子干扰核糖核酸具有GSK-3 ^ SiRNA-I至10所示的核苷酸序列或者具有对GSK-3 ^ siRNA-1至10所示的核苷酸序列进行化学修饰得到的核苷酸序列，其中，GSK-3 P SiRNA-I 正义链 5，-GGACCCAAAUGUCAAACUACC-3 ’反义链 5，-UAGUUUGACAUUUGGGUCCCG-3，GSK-3 ^ siRNA-2 正义链 5，-CCAGAUCAUGAGAAAGCUAGA-3 ’反义链5，-UAGCUUUCUCAUGAUCUGGAG-3，GSK-3 P siRNA-3 正义链 5，-GGAAGCUUGUGCACAUUCATT-3，反义链5，-UGAAUGUGCACAAGCUUCCAG-3，GSK-3 P siRNA-4 正义链 5 ’ -CACUGGUCACGUUUGGAAAGA-3 ’反义链5，-UUUCCAAACGUGACCAGUGTT-3，GSK-3 P siRNA-5 正义链 5，-CUACCAAAUGGGCGAGACATT-3 ’反义链5，-U⑶CUCGCCCAUUUGGUAGIT-3 ’GSK-3 P siRNA-6 正义链 5，-UAUAUCUGUUCUCGGUACUTT-3，反义链 5，-AGUACCGAGAACAGAUAUATT-3，GSK-3 ^ siRNA-7 正义链 5，-AGAAGAAAGAUGAGGUCUATT-3，反义链5’ -UAGACCUCAUCUUUCUUCUIT-3’GSK-3 P siRNA-8 正义链 5，-CUCAAGAACUGUCAAGUAATT-3 ’反义链5’ -UUACUUGACAGUUCUUGAGIT-3，GSK-3 P siRNA-9 正义链 5，-GCAUGAAAGUUAGCAGAGATT-3，反义链5’ -UCUCUGCUAACUUUCAUGCTT-3’GSK-3 P siRNA-10 正义链 5，-GAAGUCUAGCCUAUAUCCATT-3，
反义链5’ -UGGAUAUAGGCUAGACUUCTT-3’上述化学修饰可以为如下修饰中的至少一种(I)对所述siRNA的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；(2)对所述siRNA的核苷酸序列中的核糖的2’ -OH的修饰；(3)对所述siRNA的核苷酸序列中的碱基的修饰。本发明还涉及上述siRNA或者siRNA化学修饰产物在制备抗骨质疏松药物或者降低血糖药物中的应用。另外，本发明还提供了一种药物组合物，包含上述siRNA或者siRNA化学修饰产物。 本发明的有益效果
本发明提供的针对人GSK-3 ^的小干扰核糖核酸分子(siRNA)，能够高效、特异地抑制人GSK-3P基因的表达，同时具有较低的毒副作用。
具体实施例方式本发明提供了一组用于抑制人GSK-3P基因表达的siRNA，所述siRNA具有GSK-3 ^ siRNA 1-10所示的寡聚核酸或者对GSK-3 ^ siRNA 1-10所示的序列进行化学修饰得到的寡聚核酸。根据本发明，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种(I)对所述siRNA的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；(2)对所述siRNA的核苷酸序列中核糖的2’ -OH的修饰；(3)对所述siRNA的核苷酸序列中碱基的修饰。所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式I所示；和硼烷化磷酸盐修饰，如式2所示。两种修饰都能稳定siRNA结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
_ _ 0H9 OH
0^rs.O=^-B-H2
Vf Vr
0HOH
(I)(2)所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’ -OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如，2’ -氟代修饰，如式3所示；2’ -氧甲基修饰，如式4所示；2’ -氧亚乙基甲氧基修饰，如式5所示；2，4’_ 二硝基苯酚修饰，如式6所示；锁核酸(LNA)，如式7所示；2’ -氨基修饰，如式8所示；2’ -脱氧修饰，如式9所示。
权利要求
1.一种分离的人GSK-30基因小分子干扰核糖核酸(SiRNA)靶序列，其中所述靶序列为SEQ ID NO 1-10中任意一条序列。
2.一种小分子干扰核糖核酸(SiRNA)，其包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含权利要求I的序列编码的RNA序列，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段能形成双链RNA，该双链RNA能够抑制人GSK-3 ^基因的表达。
3.根据权利要求2所述的小分子干扰核糖核酸，其中，所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于同一条RNA链上。
4.根据权利要求3所述的小分子干扰核糖核酸，其中，所述核糖核酸为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。
5.权利要求2-4任一项所述的小分子干扰核糖核酸，其中正义RNA片段和反义RNA片段的长度为15-27个核苷酸。
6.根据权利要求5所述的小分子干扰核糖核酸，其中正义RNA片段和反义RNA片段的长度为19、20或者21个核苷酸。
7.根据权利要求2-6任一项所述的小分子干扰核糖核酸，其中双链RNA的互补区域至少有18个碱基对。
8.根据权利要求2-7任一项所述的小分子干扰核糖核酸，其特征在于所述小分子干扰核糖核酸具有GSK-3 ^ siRNA-1至10所示的核苷酸序列或者具有对GSK-3 ^ siRNA-1至10所示的核苷酸序列进行化学修饰得到的核苷酸序列，其中，GSK-3 ^ siRNA-1 :正义链 5’ -GGACCCAAAUGUCAAACUACC-3，反义链 5’ -UAGUUUGACAUUUGGGUCCCG-3，GSK-3 ^ siRNA-2 :正义链 5’ -CCAGAUCAUGAGAAAGCUAGA-3，反义链 5’ -UAGCUUUCUCAUGAUCUGGAG-3，GSK-3 ^ siRNA-3 :正义链 5’ -GGAAGCUUGUGCACAUUCATT-3 ’反义链 5’ -UGAAUGUGCACAAGCUUCCAG-3，GSK-3 P siRNA-4 :正义链 5’ -CACUGGUCACGUUUGGAAAGA-3，反义链 5’ -UUUCCAAACGUGACCAGUGTT-3，GSK-3 ^ siRNA-5 :正义链 5’ -CUACCAAAUGGGCGAGACATT-3， 反义链 5’ -U⑶CUCGCCCAUUUGGUAGIT-3’GSK-3 ^ siRNA-6 :正义链 5’ -UAUAUCUGUUCUCGGUACUTT-3 ’反义链 5’ -AGUACCGAGAACAGAUAUATT-3，GSK-3 ^ siRNA-7 :正义链 5’ -AGAAGAAAGAUGAGGUCUATT-3 ’反义链 5’ -UAGACCUCAUCUUUCUUCUIT-3’GSK-3 ^ siRNA-8 :正义链 5’ -CUCAAGAACUGUCAAGUAATT-3，反义链 5’ -UUACUUGACAGUUCUUGAGTT-3，GSK-3 ^ siRNA-9 :正义链 5’ -GCAUGAAAGUUAGCAGAGATT-3，反义链 5’ -UCUCUGCUAACUUUCAUGCTT-3’GSK-3 ^ siRNA-10 :正义链 5’ -GAAGUCUAGCCUAUAUCCATT-3’反义链 5’ -UGGAUAUAGGCUAGACUUCTT-3’。
9.根据权利要求8所述的小分子干扰核糖核酸，其中所述化学修饰为如下修饰中的至少一种 (1)对所述siRNA的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰； (2)对所述siRNA的核苷酸序列中的核糖的2’-OH的修饰； (3)对所述siRNA的核苷酸序列中的碱基的修饰。
10.权利要求2-9任一项所述的小分子干扰核糖核酸(siRNA)在制备抗骨质疏松药物或降低血糖药物中的应用。
11.一种药物组合物，含有权利要求2-9任一项所述的小分子干扰核糖核酸(siRNA)。
全文摘要
本发明涉及一组针对人GSK-3β基因的siRNA以及它们的应用。选取人GSK-3β基因编码区的序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30(优选15-27，更优选19-23)个碱基序列设计siRNA。细胞实验证明，上述siRNA能够序列特异性降低人GSK-3β基因的表达，进而降低GSK-3β蛋白的表达水平。
文档编号C12N15/113GK102776176SQ20111011749
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月9日 优先权日2011年5月9日
发明者于永春, 张戈, 徐倍, 曲伸, 李文君, 李鸿, 王吉影, 盛春君, 盛辉, 秦岭, 程晓芸 申请人:上海市第十人民医院