Dgge法在微生物快速分类中的应用的制作方法

专利名称：Dgge法在微生物快速分类中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速区分不同微生物种类方法在生物领域中的应用，尤其涉及在益生菌产品、传统乳制品、葡萄酒、动物微生态制品及人体内DGGE法在微生物快速分类中的应用。
背景技术：
微生物研究中，经常需要对混合样品中分离出的诸多单菌进行分类和鉴定，以期了解该菌的生理特点和发酵性质，为进一步的实验奠定基础。一般而言，菌种鉴定主要包括形态学、分子生物学、生理学和生物化学、次级代谢产物、泛醌系统、脂肪酸组成、细胞壁组成和蛋白质组成等。通常，我们利用多种培养基(常用培养基或者选择性培养基)对样品中的微生物进行培养，根据其菌落形态和革兰氏染色将其进行大略判断，之后利用以上介绍的鉴定方法进行菌种鉴定。为了尽可能多地鉴定出样品中的不同菌株，我们一般会对所有筛选菌进行鉴定，工作量大，耗时长，金钱消耗甚巨。16S rDNA指纹图谱技术——变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)可以直接利用细菌rDNA或者rRNA对微生物进行表征，不但避免了传统方法中耗时的菌种分离，而且可以鉴定出无法利用传统方法分离出的菌种。DGGE技术最先是用于检测DNA突变的一种电泳技术，与基于分子量大小进行分离的琼脂糖电泳和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳不同，它是基于PCR扩增子的序列特异性熔解温度进行分离的， 并且可以检测出序列中一个核苷酸的差异。1985年Muzyers et al]首次在DGGE中使用 “GC夹子”和异源双链技术，使该技术日臻完善。1993年Muzyers et al首次将DGGE技术应用于分子微生物生态学研究领域，并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和菌群差异方面具有独特的优越性。 由于DGGE技术避免了分离培养的缺陷，直观地显现微生物区系菌群多样性，目前已经成为微生物菌群多样性和动态变化分析的常用工具。

发明内容
本发明的目的在于一种DGGE法在微生物快速分类中的应用，该技术可以将益生菌产品、传统乳制品、葡萄酒、动物微生态制品及生物体内分离的多株菌进行分类，使用方便快捷、准确且重复性好，为后继实验节约大量时间和金钱。DGGE重现性强、可靠性高、速度快、能够弥补传统方法分析微生物群落的不足，已成为现代微生物学领域一种重要研究手段。本发明利用DGGE技术灵敏度高、重复性强的特点，对单菌进行DNA提取，PCR扩增和DGGE检测，从而快速、准确地将同种微生物与其它微生物区别开来。而且，我们以原样品中微生物为标准，可以判断出样品中的优势菌和弱势菌。因为DGGE技术是一种半定量技术，如果想获得具体菌的名称，则需对特征性的片断进行割胶回收、测序，最终确定其归属。本发明是一种微生物分类鉴定前期处理技术，可以将同种菌划为一类，从而为后面菌种鉴定节约大量时间和金钱。本发明的成功，为DGGE技术在微生物生态学领域的应用提供了新思路。本发明是这样来实现的，DGGE法在微生物快速分类中的应用，其特征是该应用分别包括DGGE法在区分不同益生菌中的应用、DGGE法在区分传统发酵乳viili中不同微生物的应用、DGGE法在区分葡萄酒中不同微生物的应用和DGGE法在区分动物微生态制剂中不同微生物的应用。所述DGGE法在区分不同益生菌中的应用利用细菌通用引物，乳酸菌和双歧杆菌特异性引物对4株乳酸菌标准菌和3株双歧杆菌标准菌株保守区片段PCR扩增并进行 DGGE检测，结果表明，相同标准菌株优势条带在DGGE胶上出现的位置和条带数一致，不同标准菌株优势条带在DGGE胶上位置和条带数不一致，所述4株乳酸菌标准菌分别为鼠李糖乳杆菌ATCC53103、植物乳杆菌ATCC8014、唾液乳杆菌FBC05、嗜酸乳杆菌ATCC4356 ；所述3株双歧杆菌标准菌株分别为婴儿双歧杆菌ATCC15697、青春双歧杆菌Bi07、长双歧杆菌 NCC2705，其中长双歧杆菌NCC2705设置3个重复。所述DGGE法在区分传统发酵乳viili中不同微生物的应用利用通用引物或种属特异性引物对传统发酵乳中筛选出的11株微生物进行PCR扩增，同时以传统发酵乳中微生物总菌DNA的PCR产物为对照，进行DGGE检测，结果表明，筛选得到的11株微生物属于 5 禾中不同菌，分另Ij为 Lacio办plantarum ATCC8014> Streptococcus thermophilus CICC6038> Lactobacillus paracasei ATCC25302> Bacillus cereus ATCC14579 禾口 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCCl 1842 ；与 viili 、菌所代表的DGGE 条带相比可知，份re/^ococciAs thermophilus CICC6038为viili中细菌中的优势菌，而 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCC11842 为 viili 中乳杆菌属中的优势乳杆菌。所述DGGE法在区分葡萄酒中不同微生物的应用利用通用引物或种属特异性引物对葡萄酒中筛选出的7株微生物进行PCR扩增，同时以葡萄酒中微生物总菌DNA的 PCR产物为对照，进行DGGE检测，结果表明，筛选得到的7株微生物属于4种菌，分别为 Saccharomyces cerevisiae ATCC9763^Baci11us megaterium ATCC19213>Paenibacillus pasadenensis SAFN—007T 禾口如eier sp. ATCC 33308 ；与葡萄酒总菌所代表的 DGGE条带相比可知，SaccAarofflJ^e1S cerevisiae ATCC9763为葡萄酒中的优势菌。
DGGE法在区分动物微生态制剂中不同微生物的应用利用细菌通用引物对动物微生态制剂中筛选出的6株微生物进行PCR扩增，同时以动物微生态制剂中微生物总菌DNA的 PCR产物为对照，进行DGGE检测，结果表明，筛选得到的6株微生物都属于Lacto如 plan tarum ATCC8014，且其为葡萄酒中细菌属的优势菌。本发明的优点是本发明方便快捷，可于菌种鉴定前将相同微生物归于一类，大大减少了后继工作量，节省大量时间和金钱。此外，本发明尚可判断所区分菌在混合样品中是否占优势。


图1为特异性引物扩增得到乳杆菌、双歧杆菌PCR产物的琼脂糖电泳结果。图2为V3区通用引物扩增得到乳杆菌、双歧杆菌PCR产物的琼脂糖电泳结果。图3为特异性引物扩增得到的乳杆菌、双歧杆菌PCR产物的DGGE电泳结果。
图4为V3区通用引物扩增得到的乳杆菌、双歧杆菌PCR产物的DGGE电泳结果。图5为V3区通用引物和乳杆菌特异性引物扩增得到PCR产物的琼脂糖电泳结果。图6为V3区通用引物PCR-DGGE结果。图7为乳杆菌特异性引物PCR-DGGE结果。图8为葡萄酒中通用引物PCR-DGGE结果。图9为动物微生态制剂中通用引物PCR-DGGE结果。图1中:L1,嗜热链球菌；L2,鼠李糖乳杆菌；L3,植物乳杆菌L4，唾液乳杆菌L5， 嗜酸乳杆菌Mla。乳杆菌Marker; Mbif，双歧杆菌Marker ；Bi,长双歧杆菌；B2，青春双歧杆菌；B3,婴儿双歧杆菌。图2中L1，嗜热链球菌；L2，鼠李糖乳杆菌；L3，植物乳杆菌；L4，唾液乳杆菌； L5,嗜酸乳杆菌；Mla。，乳杆菌Marker; Mbif，双歧杆菌Marker ；Bi,长双歧杆菌；B2，青春双歧杆菌；B3，婴儿双歧杆菌。图3中Ll 嗜热链球菌；L2 鼠李糖乳杆菌；L3 植物乳杆菌；L4 唾液乳杆菌； L5 嗜酸乳杆菌；Mla。，乳杆菌DGGE Marker; Mbif，双歧杆菌DGGE Marker ;B1，长双歧杆菌； B2:青春双歧杆菌；B3 婴儿双歧杆菌。图4中嗜热链球菌；L2 鼠李糖乳杆菌；L3 植物乳杆菌；L4 唾液乳杆菌；L5 嗜酸乳杆菌；Mla。，乳杆菌DGGE Marker; Mbif，双歧杆菌DGGE Marker ；Bi:长双歧杆菌；B2:青春双歧杆菌；B3 婴儿双歧杆菌。图5中，注A，V3区通用引物扩增结果；B，乳杆菌特异性引物扩增结果；M，DL2000 DNA Marker ； 1，villi ；2-16，菌株 1- 15。图 6 中注1_7，菌株 1-7 ；8，villi ；9-16，菌株 8-15。图 7 中，注1, villi ；2-11，菌株 1、4、5、6、7、9、11、13、14、15。图8 中，注- ，葡萄酒总菌·Λ_ ,W^ 1、2、3、4、5、6、7。图9中，注- ，微生态制剂总菌Λ-m 1、2、3、4、5、6。
具体实施例方式实施例1
1.将10株细菌标准菌株(鼠李糖乳杆菌ATCC53103、植物乳杆菌ATCC8014、唾液乳杆菌 FBC05、嗜酸乳杆菌ATCC4356、嗜热链球菌CICC6038、婴儿双歧杆菌ATCC15697、青春双歧杆菌Bi07、长双歧杆菌NCC2705，其中长双歧杆菌NCC2705设置3个重复)接种于MRS液体肉汤中于37°C、厌氧条件下培养M h。2.以上每种菌液各取1 mL提取基因组DNA;为制备具有指示功能的DGGE Marker, 每种菌各1 mL混合，提取基因组DNA，分别制备乳杆菌和双歧杆菌特异性或通用性DGGE Marker03. 向2 mL离心管中加入700 μΙ-的裂解缓冲液[500 mM NaCl, 50 mM
Tris-HCl, pH 8.0，50 mM EDTA, 4% SDS]，300 pL 酚/ 氯仿 /异戊醇(25 :24 :l，Promega) 和0.4 g玻璃珠(0.35 g/0. 1 mm, 0. 05 g/0. 5 mm)，混勻，并将离心管置于涡旋振荡器上振荡10 min，20000Xg离心5 min后，向上清液中加入150 μΕ 10 M乙酸铵，DNA随即使用两次酚/氯仿/异戊醇提取和一次氯仿提取，异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤，风干后，加入100 μΙ TE缓冲液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8. 0)溶解DNA沉淀，加入 2 gL RNase (10 mg/ml)在 37°C 孵育 15min。4.扩增 16S rDNA V3 区引物为 357 f(5 ‘ - GC cIamp-TACGGGAGGCAGCAG -3 ‘ ),519 r (5 ‘ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ‘ ) ； 16S rDNA 乳杆菌引物 Iacl (5 ‘-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3‘ )， lac2 (5' - GC cIamp-ATTYCA
CCGCTACACATG -3' ) ； 16S rDNA 双歧菌引物为 Bif id F (5' - CTCCTGGAA ACGGGTGG-3‘ ), Bifid R-GC (5' - GC cIamp-GGTGTTCTTCCCGATATCT
ACA -3')。扩增体系(50 pL 包括 100 ng DNA 模板，IX EX Taq buffer, 200 μ M
dNTP, 200 nM 各引物，1. 5 mM MgCl2, 670 ng/μ L BSA, 1. 25 U EX Taq DNA 聚合酶) 参照 Muyzer 等方法(GC clamp sequence CGCCCGGGGCG
CGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)。反应条件94°C，5 min; 9，V 30 s;56°C，30 s;72°C，l min, 30 个循环；72°C，7 min。5.使用8 %聚丙烯酰胺凝胶，35 % 65 % [100%变性梯度包含40% (ν/ν)甲酰胺和 7 M尿素]变形梯度。电泳采用 DCode Universal Mutation Detection System (变性梯度凝胶电泳仪，Bio-fcid Laboratories, Hercules, CA, USA)，首先在220 V电压下预电泳10 min，随后在85 V的固定电压下电泳16 h。电泳结束后，进行硝酸银染色。6.图1显示，对嗜热链球菌(Li)用乳酸菌通用引物进行扩增，未得扩增产物， 但该引物对1^2、1^3、1^4、1^5及虬3。扩增均得到所需条带(大约380 bp),说明乳杆菌通用引物特异性好，可以选择性扩增乳酸菌菌属；Mbif、Bl、B2、B3经双歧菌特异性引物扩增后得到的条带位置与预期结果相符(大约为596 bp)。图2表明，嗜热链球菌(Li)可经V3通用引物扩增得到所需目的片段，进一步验证了乳酸菌引物的特异性，其扩增后的条带在217 bp位置，与预结果相符；其他菌经通用引物扩增均得到目的条带(大约217 bp)。图3说明，利用乳酸菌特异引物扩增制备的乳酸菌DGGE Marker (Mla。)上的条带 B1与鼠李糖乳酸菌优势条带a —致，Id1与植物乳酸菌优势条带b —致，C1与唾液乳酸菌优势条带c 一致，Cl1与嗜酸乳酸菌优势条带d优势条带一致；利用双歧菌特异性引物制备的双歧菌DGGE Marker (Mbif)上的条带θι与婴儿双歧优势条带e —致，与长双歧优势条带 f 一致，gl与青春双歧优势条带g —致。图4表明，利用细菌V3区通用引物扩增制备的乳酸菌DGGE Marker (Mlac)其条带al、bl、Cl、dl、el分别与嗜热链球菌、鼠李糖乳酸菌、植物乳酸菌、唾液乳酸菌、嗜酸乳酸菌上的优势条带a、b、c、d、e —致；而同样利用细菌V3通用引物扩增制备的双歧菌DGGE Marker (Mbif )其上条带f 1、gl、hi与青春双歧、婴儿双歧、长双歧上的优势条带f、g、h —致。实施例2 =DGGE法在区分传统发酵乳viili中不同微生物的应用
1.将分离自viili中的15株菌接种于相应的培养液中，于37°C培养16-20 h，使活菌数达到最大。2.按实施例1中的方法提取viili中所有分离菌和总菌的DNA，利用通用引物和菌属特异性引物扩增DNA，将得到的PCR产物进行DGGE电泳。3.图5表明，利用V3区总细菌通用引物可以对所有分离菌株扩增出193 bp左右条带，而利用乳杆菌特异性引物扩增后，泳道3、4、9、11、13在380 bp无目的条带出现，说明其代表的菌株2、3、8、10、12不属于乳杆菌
图6表明，菌株1、7在DGGE胶上优势条带一致，为同一种菌；同样，菌株2、3在DGGE 胶上优势条带一致，为同一种菌；菌株4、5、9、11、13、14、15为同一种菌；菌株8、10、12为同一种菌；菌株6与其它菌优势条带不同，单独为一种细菌。此外，viili在DGGE胶上优势条带与菌株8、10、12所代表的菌条带一致，说明菌株8、10、12所代表的菌为viili中的优势菌。图7表明，菌株1、6在DGGE胶上优势条带一致，为同一乳杆菌；同样，菌株4、5、9、 11、13、14、15为同一乳杆菌；菌株6与其它菌优势条带不同，单独为一乳杆菌。泳道1代表的viili其优势条带与菌株6 —致，说明菌株6为viili中乳杆菌中的优势乳杆菌。将克隆测序得到的序列在Genbank中进行Blastn，分离株分别为Lactobacillus plantarum> Streptococcus thermophilus、Lactobacillus paracasein Bacillus cereus 禾口 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 5 禾中不同细菌。
实施例3 利用DGGE法在区分葡萄酒中不同微生物的应用
1.将分离自葡萄酒中的7株菌接种于相应的培养液中，于37°C培养16-20 h，使活菌数达到最大。2.按实施例1中的方法提取葡萄酒中所有分离菌和总菌的DNA，利用通用引物和菌属特异性引物扩增DNA，将得到的PCR产物进行DGGE电泳。3.图8表明，菌株1-4属于同一种菌，测序结果表明其为feccAarfM^M cerevisiae^-Ι分别为不同菌，测序结果表明其分别为Bacillus megaterium, Paenibacillus pasadenensis私Acinetobacter sp.。与葡萄酒总菌条带相比较，我们可 1^^3 , Saccharomyces cerevisiae 为葡萄酒中的优势菌。
实施例4 :DGGE法在区分动物微生态制剂中不同微生物的应用 1.将分离自动物微生态制剂中的6株菌接种于相应的培养液中，于37°C培养16-20 h， 使活菌数达到最大。2.按实施例1中的方法提取动物微生态制剂中所有分离菌和总菌的DNA，利用通用引物和菌属特异性引物扩增DNA，将得到的PCR产物进行DGGE电泳。3.图9表明，菌株1-6属于同一种菌，测序结果表明其为Lacto如CiBm plantarum ATCC8014 ；与动物微生态制剂总细菌条带相比较，我们可以发现， Lactobacillus plantarum ATCC8014为动物微生态制剂中细菌的优势菌。
实施例5 :DGGE法在区分土壤、食品、水体、空气、人体内不同微生物的应用
1.将分离土壤、食品、水体、空气、人体内的微生物接种于相应的培养液中，于适宜条件下进行培养，使活菌数达到最大。2.按实施例1中的方法提取土壤、食品、水体、空气、人体内所有分离菌和总菌的 DNA,利用通用引物和菌属特异性引物扩增DNA，将得到的PCR产物进行DGGE电泳。3.如单菌所在泳道上的条带数目和位置与其他单菌一致，说明其为相同菌；如单菌优势带在与总菌优势带位置一致，说明该单菌在混合样品中为优势菌。
权利要求
1.DGGE法在微生物快速分类中的应用，其特征是该应用分别包括DGGE法在区分不同益生菌中的应用、DGGE法在区分传统发酵乳viili中不同微生物的应用、DGGE法在区分葡萄酒中不同微生物的应用和DGGE法在区分动物微生态制剂中不同微生物的应用。
2.根据权利要求1所述的DGGE法在微生物快速分类中的应用，其特征是所述DGGE法在区分不同益生菌中的应用利用细菌通用引物，乳酸菌和双歧杆菌特异性引物对4株乳酸菌标准菌和3株双歧杆菌标准菌株保守区片段PCR扩增并进行DGGE检测，结果表明，相同标准菌株优势条带在DGGE胶上出现的位置和条带数一致，不同标准菌株优势条带在DGGE 胶上位置和条带数不一致，所述4株乳酸菌标准菌分别为鼠李糖乳杆菌ATCC53103、植物乳杆菌ATCC8014、唾液乳杆菌FBC05、嗜酸乳杆菌ATCC4356 ；所述3株双歧杆菌标准菌株分别为婴儿双歧杆菌ATCC15697、青春双歧杆菌Bi07、长双歧杆菌NCC2705，其中长双歧杆菌 NCC2705设置3个重复。
3.根据权利要求1所述的DGGE法在微生物快速分类中的应用，其特征是所述DGGE 法在区分传统发酵乳viili中不同微生物的应用利用通用引物或种属特异性引物对传统发酵乳中筛选出的11株微生物进行PCR扩增，同时以传统发酵乳中微生物总菌DNA的 PCR产物为对照，进行DGGE检测，结果表明，筛选得到的11株微生物属于5种不同菌，分另Ij 为 Lactobacillus plantarum ATCC8014、Streptococcus thermophilus CICC6038、 Lactobacillus paracasei ATCC25302> Bacillus cerew^ATCC14579 勒 Lactobacillus delbrueckii subsp. BulgaricuskrKCUMl ；与 viili 总菌所代表的 DGGE 条带相比可知， Streptococcus thermophilus CICC6038 为 vii 1 i 中细菌中的优势菌，而 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCCl 1842 为 viili 中乳杆菌属中的优势乳杆菌。
4.根据权利要求1所述的DGGE法在微生物快速分类中的应用，其特征是所述DGGE法在区分葡萄酒中不同微生物的应用利用通用引物或种属特异性引物对葡萄酒中筛选出的 7株微生物进行PCR扩增，同时以葡萄酒中微生物总菌DNA的PCR产物为对照，进行DGGE 检测，结果表明，筛选得到的7株微生物属于4种菌，分别为Saccharomyces cerevisiae ATCC9763> Bacillus mega terium ATCC19213> Paenibacillus pasadenensis SAFN-OO7T 和Acinetobacter sp. ATCC 33308 ；与葡萄酒总菌所代表的DGGE条带相比可知， Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 为葡萄酒中的优势菌。
5.根据权利要求1所述的DGGE法在微生物快速分类中的应用，其特征是DGGE法在区分动物微生态制剂中不同微生物的应用利用细菌通用引物对动物微生态制剂中筛选出的6 株微生物进行PCR扩增，同时以动物微生态制剂中微生物总菌DNA的PCR产物为对照，进行 DGGE检测，结果表明，筛选得到的6株微生物都属于Zacio^ciBttS ρlantarum ATCC8014, 且其为葡萄酒中细菌属的优势菌。
全文摘要
DGGE法在微生物快速分类中的应用，其特征是该应用分别包括DGGE法在区分不同益生菌中的应用、DGGE法在区分传统发酵乳viili中不同微生物的应用、DGGE法在区分葡萄酒中不同微生物的应用和DGGE法在区分动物微生态制剂中不同微生物的应用。本发明的优点是方便、快捷，可于菌种鉴定前将相同微生物归于一类，大大减少了后继工作量，节省大量时间和金钱。此外，本发明尚可判断所区分菌在混合样品中是否占优势。
文档编号C12Q1/68GK102242193SQ20111011853
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月9日 优先权日2011年5月9日
发明者万翠香, 姜淑英, 徐锋, 李祖旭, 汪孟娟, 熊顺强, 许恒毅, 陈廷涛, 魏华 申请人:南昌大学