专利名称：一种用于快速诊断牛副流感病毒3型的rt-pcr检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学检测领域，涉及微生物分子生物学检测方法。具体涉及一种用于快速诊断牛副流感病毒3型的RT-PCR检测方法。更涉及快速诊断牛副流感病毒3型的RT-PCR试剂盒的应用。
背景技术：
牛副流感由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3，BPIV_3)感染引起，可分为犊牛型和成牛型。犊牛型又称犊牛地方性肺炎，是侵袭2周至数月龄犊牛的一种接触性传染病，以发热、呼吸困难、流浆液、粘液性或脓性鼻漏和咳嗽为特征。因该病多发生于运输后的牛，该病毒又称运输热病毒。牛副流感病毒3型属于副黏病毒科副黏病毒属成员，为单链负股有囊膜的RNA病毒。自从1959年Reisinger等在美国的牛体中分离到BPIV-3以来，法国、前苏联、日本、丹麦、加拿大、澳大利亚、巴拿马和意大利等国也相继分离出该病毒。由于多种病原导致的呼吸道症状与该病相似，该病的准确诊断方法显得非常重要。国际上有关BPIV-3的诊断研究报道不多，涉及主要方法有(一 )血清学诊断技术包括补体结合实验、中和实验、凝集实验、免疫扩散、沉淀实验、免疫电泳技术、免疫荧光染色、双抗体夹心ELISA和免疫电镜技术等。在这些方法中得到普遍认同和广泛应用的有补体结合实验、间接血凝试验。琼脂扩散实验、中和实验。但由于反应时间长，材料多，准备周期长，检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性较差。( 二 )生物学实验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在敏感不高、耗时较长等问题，而且有些样品中存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本高，且耗费大量人力物力，经济效益较低。相比之下，分子生物学方法具有明显优势，如RT-PCR方法特异性好，灵敏度高，不但可以检测活细胞内的病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段；样品可来源于鼻拭子、喉拭子、呼吸道分泌物等，并可与不同的流感株相区别，这是免疫学方法无法替代的。其他分子生物学方法有荧光定量RT-PCR试剂盒专利号O00910062399. 5)，针对的靶基因有HN基因、M基因或F基因等。
发明内容
首先针对目前养牛业健康发展的产业需求，本发明的第一个目的是利用RT-PCR 技术建立了一种针对牛副流感病毒3型的快速核酸检测方法，该方法更灵敏，更易于操作。 以期为牛副流感的快速诊断和流行病学调查监测和防控提供技术支持；本发明的另一个目的在于通过系统优化反应条件与工艺，制备出相应的诊断试剂盒为临床病原检测和牛副流感防控提供产品。
实现本发明的具体技术方案，在于所述的检测牛副流感病毒3型的RT-PCR方法， 步骤包括样品的采集，病毒RNA的提取，特异性引物的设计优化，RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳和结果判定；其特征在于所述特异性引物是针对牛副流感病毒3型核蛋白基因(NP) 的特异性区段设计的，其上下游序列分别为Pl :5，-GGATGTTTGGGAGTGATCTTGAGTA-3，；P2 :5， -TGTGTTGAAAAATGAAGCAAGACCT-3，；所述的RT-PCR扩增采用两步法，反转录时加入长度为9bp的随机引物 5’-NNNNNNNNN-3’，PCR反应时在反应管内加入上述牛副流感病毒3型的特异性上下游引物 Pl和P2，RT-PCR反转录反应体系为20 μ L，包括8 μ L RNA, 3 μ L DEPC处理去离子水，1 μ L 随机引物，65°C 5min后，迅速放冰上。随后加入5XRT 4yL缓冲液、ΙΟμΜ dNTPs 2 μ L、 0. 5μΜ RNA 酶抑制剂 lyL、25U/yL M-MLV 1 μ L，继续反应条件是30°C 30s，99°C 5min， 42°C 20min，4°C 5min，获得 cDNA ；PCR体系为 20 μ L，包括灭菌去离子水 12. 5 μ L，10 X PCR buffer2 μ L, 5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，dNTPs 1 μ L，牛副流感病毒3型上下游引物Pl，P2各1 μ L，cDNA样品 2μ L0 PCR 反应程序为94°C 预变性 5min ;94°C 30s，58°C 62°C 30s, 72 °C lmin，循环 30 次；72°C延伸5min,16°C lOmin，取PCR产物6 μ L进行1 %琼脂糖电泳，阳性样本和阳性对照品均出现大小为的PCR产物条带，阴性样本和阴性对照品无扩增产物条带。本发明所述的检测牛副流感病毒3型的RT-PCR快速诊断试剂盒包括样品病毒RNA提取试剂，反转录试剂，PCR试剂，阳性对照品和阴性对照品；其特征在于所述反转录试剂由5倍RT缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、M-MLV, DEPC处理水、和随机引物组成， 保存温度-20°C。反转录反应体系为8yL RNA,4yL 5XRT缓冲液、3yL DEPC处理去离子水，10 μ M dNTPs (Takara) 2 μ L、0. 5 μ MRNA 酶抑制剂(Toyoba) 1 μ L、25U/ μ LM-MLV lyLCToyobahlyL随机引物；所述PCR试剂是由灭菌去离子水、10XPCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、和cDNA模板，保存温度为-20°C。PCR反应体系包括灭菌去离子水 12. 5 μ 1，10 X PCR 缓冲液(Fermantas) 2 μ L, 5U/ μ LTaq DNA 聚合酶(Fermantas) 0. 5 μ 1， 2. 5mmol/L dNTPs (Fermantas) 1 μ L，牛副流感病毒3型特异性上下游引物Pl禾Π P2各1 μ L。本发明与现有技术相比较，具有明显的优越性。首先，本发明本研究以BPIV-3的核蛋白基因(NP)为靶基因，NP的一个重要功能是包裹着病毒的基因组，与病毒的RNA及多聚酶结合形成复合体(ribonucleoprotein complexes，RNPs)，以利于病毒的转录与复制另外NP具有核转运功能，对于病毒的RNA进入细胞核来说作用十分重要，可通过受体介导的细胞内吞作用进入宿主细胞，经包膜与宿主细胞膜的融合，RWs被释放进入细胞浆，再运输到细胞核。因此，本发明选取NP基因作为BPIV-3的RT-PCR主要候选基因，建立了该病毒的RT-PCR检测方法，并证实该方法灵敏、特异，具有应用前景。本发明以BPIV-3的核蛋白基因NP建立了该病毒的RT-PCR快速诊断试剂盒，由于该试剂盒灵敏、特异、快速，能够为病原的检测节省时间，降低检测成本，减少不必要的经济损失，非常适用于牛副流感病毒3型的实验室快速诊断和流行病学研究。
图1 本发明的特异性检测结果琼脂糖凝胶电泳检测图
图1中RT-PCR检测了牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎、 牛合胞体病毒和猪瘟病毒、牛支原体、大肠埃希氏菌、牛巴氏杆菌荚膜A型、鼠伤寒沙门氏菌以及MDBK细胞RNA。从左至右各泳道依次为M. DL2000 ladder ；1.牛副流感病毒3型； 2.牛病毒性腹泻/粘膜病病毒；3.牛传染性鼻气管炎病毒；4.牛合胞体病毒；5.猪瘟病毒； 6.牛支原体；7.牛多杀性巴氏杆菌；8.鼠伤寒沙门氏菌；9.大肠杆菌；10. MDBK细胞阴性对照；11.空白对照。只有牛副流感病毒3型能扩增出预期大小G25bp)的目的条带，表明本发明特异性良好。图2 本发明的灵敏度检测结果通过琼脂糖凝胶电泳检测2中将牛副流感病毒3型参考毒株从109TCID5(1/0. ImL开始10倍递增稀释，进行RT-PCR扩增。从左至右泳道依次为M. DL2000 Ladder ；1. 109TCID50A). ImL ； 2. 108TCID50/0. ImL ；3. 107TCID50/0. ImL ；4. 106TCID50/0. ImL ；5. 105TCID50/0. ImL ； 6. 104TCID50/0. ImL ；7. 103TCID50/0. ImL ；8. 102TCID50/0. ImL ；9. IOiTCID50ZO. ImL ； 10. 10°TCID50/0. ImL ；11. I(T1TCID50A). ImL ；12. I(T2TCID50A). ImL ；13. I(T3TCID50A). ImL ； 14.细胞RNA阴性对照；15.牛副流感病毒3型阳性对照；16.空白对照。结果显示，该方法的模板最低检出浓度为10_3TCID5(1/0. lmL。图3 阳性对照管与阴性对照管PCR产物的电泳结果中从左至右泳道依次为M.DL2000 ladder ；2.阳性对照；3.阴性对照；4.空白对照。图4 试剂盒PCR反应过程中不同退火温度扩增效果中从左至右泳道依次为M.DL2000 ladder ;1 10退火温度分别为56. 5°C， 57. 3°C, 58. 1°C,58. 9°C，59. 7°C，60. 5°C，61. 3°C，62. 1°C，62. 9°C，63. 7°C。图5 :试剂盒PCR反应过程中特异性引物最适浓度中从左至右泳道依次为M. DL2000 ladder ;1 5引物浓度分别1 μ mol/L， 0. 8 μ mol/L,0. 6 μ mol/L,0. 5 μ mol/L,0. 4 μ mol/L。
具体实施例方式实施案例一1样品的采集和处理采集病牛的鼻拭子或者喉拭子样品，将以上样品加灭菌生理盐水制备1 5悬液， 4000r/min，离心lOmin，取上清备用。 2样品RNA模板的提取(1)取步骤1上清330 μ L加入1. 5mL离心管，加入lmTRIZOL，充分混勻，室温放置 IOmin0(2)按200 μ L氯仿/mL Trizol加入氯仿，剧烈振荡混勻后室温放置15min (注 禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂)；4°C，12，000g离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中(注不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4°C冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相)。(3)按0. 5mL异丙醇/mLTrizol加入异丙醇混勻，室温放置5-10min。4°C，12，000g离心lOmin，弃上清，RNA沉于管底。(4)按ImL 75%乙醇/mL Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4°C， 8，OOOg离心5min，尽量弃上清。(5)室温晾干或真空干燥5-lOmin。注RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。(6)加入40 μ L DEPC处理水，然后准备反转录。3使用本发明所述RT-PCR专用试剂盒进行以下试验(1)反转录反应反应体系为20 μ L，在PCR反应管中依次加入，加入3 μ L DEPC处理水、1 μ L反转录随机引物以及8yL RNA模板。65°C 5min后，迅速放冰上。再依次加入4yL 5XRT缓冲液、2 μ L dNTPs (IOyM)UuL RNA 酶抑制剂(0. 5 μ M) U μ L M-MLV (25U/μ L), 30°C 30s, 99°C 5min，42°C 20min,4°C 5min，获得 cDNA，-20°C保存，以作为进一步 PCR 的模板。同时设一个阳性对照和一个阴性对照，反应体系和反应条件同上，不同的是分别以该试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品代替样品RNA。O) PCR 反应反应体系为20yL，反转录反应后在反转录PCR管中依次加入灭菌去离子水 12. 5 μ L，UOXPCR Dream buffer 2 μ L、Dream Taq DNA 聚合酶(5U/μ L) 0· 5 μ L、 dNTPs (2. 5mmol/L) 1 μ L、牛副流感病毒3型特异性上下游引物Pl和P2各1 μ L。PCR 反应程序为94°C预变性 5min ；94°C 30s，58°C 62°C 30s, 72°C lmin，循环 30 次；72°C延伸 5min, 16°C IOmin0(3)琼脂糖凝胶电泳检测各取6 μ LPCR产物与DL2000 Marker,分别与2 μ L上样缓冲液混勻后1加样于1 % 的琼脂糖凝胶，IOOV电泳30 45min，利用凝胶成像系统照相，分析电泳结果。(4)结果判定首先检查阳性对照管与阴性对照管PCR产物的电泳结果，阳性管PCR产物电泳后应产生一条大小为425bp的条带，而阴性管中没有条带。然后再看样品管的结果，如果产生 425bp的条带，判定为牛副流感病毒3型感染；如果没有任何条带，则判为阴性，没有感染该病毒。以上结果显示，1号点样孔对照的是阳性对照品，2号点样孔对应阴性对照品，3号为空白(去离子水)。实施案例二 牛副流感病毒3型的RT-PCR试剂盒的反应条件优化牛副流感病毒3型特异性上下游引物Pl和P2分别试验选用对其影响较大的退火温度、引物浓度进行试剂盒条件的优化。PCR的退火温度以为起点J4 62. 0°C分别为 56. 5°C, 57. 3°C, 58. 1 °C, 58. 9°C, 59. 7°C,60. 5°C,61. 3°C,62. 1 °C, 62. 9°C,63. 7°C ；引物浓度在 0.2 Ι.ΟμΜ 范围内分别为 lymol/L，0. 8ymol/L，0. 6ymol/L，0. 5ymol/L， 0. 4 μ mol/L,通过逐步增加引物浓度，观察PCR扩增效果。其它反应条件不变。结果图4 从左至右依次为M.DL2000 ladder ； 1 10退火温度分别为56. 5°C，57. 3°C, 58. 1 °C, 58. 9°C, 59. 7°C，60. 5°C，61. 3°C，62. 1 °C,62. 9°C，63. 7°C。图片显示该试剂盒 PCR 最适退火温度是58. 1°C。
图5 从左至右依次为M. DL2000 ladder ； 1 5引物浓度分别1 μ mol/L, 0. 8 μ mol/L, 0. 6 μ mol/L, 0. 5 μ mol/L, 0. 4 μ mol/L。图片显示该试剂盒 PCR 反应过程中特异性引物最适浓度为1 μ mol/L。
权利要求
1.一种检测牛副流感病毒3型的RT-PCR方法，步骤包括样品的采集，病毒RNA的提取， 特异性引物的设计，RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，结果判定，其特征在于所述牛副流感病毒3型特异性扩增引物，其序列是Pl :5’ -GGATGTTTGGGAGTGATCTTGAGTA-3’ ；P2 :5’ -TGTGTTGAAAAATGAAGCAAGACCT-3’ ；所述的RT-PCR扩增采用两步法，反转录时加入长度为9bp的随机引物 5’ -NNNNNNNNN-3', PCR反应时在反应管内加入上述牛副流感病毒3型的特异性上下游引物Pl和P2，RT-PCR反转录反应体系为20 μ L，包括8 μ L RNA, 3 μ L DEPC处理去离子水， 1 μ L随机引物，65°C 5min后，迅速放冰上。随后加入4 μ L 5 X RT缓冲液、10 μ M dNTPs2 μ L、 0. 5μΜ RNA 酶抑制剂 lyL、25U/yL M-MLV 1 μ L，继续反应条件是30°C 30s，99°C 5min， 42°C 20min，4°C 5min，获得 cDNA ；PCR 体系为 20 μ L，其中灭菌去离子水 12. 5 μ L，IOXPCRbuffer 2 μ L, 5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 5yL，2. 5mmol/L dNTPs 1 μ L，牛副流感病毒3型上下游引物P1，P2各1 μ L， cDNA样品 2μ L ；PCR 反应程序为94°C 预变性 5min ； 94 °C 30s，58°C 62°C 30s, 72 °C lmin, 循环30次；72°C延伸5min，16°C IOmin0取PCR产物6 μ L进行1 %琼脂糖电泳，阳性样本和阳性对照品均出现大小为42^ρ的PCR产物条带，阴性样本和阴性对照品无扩增产物条带。
2.一种应用权利要求1的牛副流感病毒3型的RT-PCR快速诊断试剂盒，包括样品病毒RNA提取试剂，反转录试剂，PCR试剂，阳性对照品和阴性对照品，其特征在于所述反转录试剂由5倍RT缓冲液、dNIPs、RNA酶抑制剂、M_MLV、DEPC处理水、和随机引物组成，保存温度-20°C，反转录反应体系为8yL RNA,4yL 5XRT缓冲液、3yL DEPC处理去离子水， 10 μ M dNTPs 2 μ L、1 μ L RNA 酶抑制剂，25U/ μ L M-MLV 1 μ L，0. 5 μ M 随机引物 1 μ L ；所述 PCR试剂是由灭菌去离子水、10XPCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNIPs和cDNA模板，保存温度为-20°C。PCR反应体系包括灭菌去离子水12. 5 μ 1，10XPCR缓冲液2 μ L，5U/μ L Taq DNA聚合酶0. 5 μ 1，2. 5mmol/L dNTPs 1 μ L，牛副流感病毒3型特异性上下游引物Pl和P2 各 IyL0
全文摘要
一种用于快速诊断牛副流感病毒3型的RT-PCR检测方法及其试剂盒，本发明属于生物医学检测领域，本发明的具体技术方案，包括样品的采集，病毒RNA的提取，特异性引物的设计优化，RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳和结果判定；所述特异性引物是针对牛副流感病毒3型核蛋白基因(NP)的特异性区段设计的，其上下游序列分别为P15’-GGATGTTTGGGAGTGATCTTGAGTA-3’；P25’-TGTGTTGAAAAATGAAGCAAGACCT-3’；所述的检测牛副流感病毒3型的RT-PCR快速诊断试剂盒包括样品病毒RNA提取试剂，反转录试剂，PCR试剂，阳性对照品和阴性对照品；证实该方法灵敏、特异，具有应用前景。
文档编号C12Q1/70GK102212622SQ201110122089
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者刘晓乐, 张敏敏, 胡长敏, 郭爱珍, 陈焕春, 陈颖玉 申请人:华中农业大学