专利名称：一种检测猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的多重pcr方法
技术领域：
本发明涉及一种同时检测猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的多重PCR方法，属于核酸检测领域。
背景技术：
猪链球菌(Str印tococcus suis, SS)呈世界性分布，多年来一直困扰养猪业的健康发展，猪急性感染猪链球菌常表现为出血性败血症和脑膜炎，慢性感染则表现为关节炎、 心内膜炎、淋巴结化脓。猪链球菌还是重要的人兽共患病病原，威胁人类的生命安全，人感染链球菌患中毒性休克和脑膜炎。猪链球菌血清型众多。根据兰氏(Lancefield)血清学分类，链球菌可分成A、B、C、 D、E、F、G、H、K、L、M、N、0、P、Q、R、S、T、U 等 19 个血清型，其中 C、D、E、L、R、S 等群链球菌可引起猪链球菌病，如C群的兽疫链球菌(S. zooepidemicus)和类马链球菌(S. epuisimilis)、D 群的猪链球菌(S. suis)、R群的猪2型链球菌(S. suis subtype 2，SS2)。20世纪80年代我国流行的猪链球菌病临床上多表现为关节炎和脑膜炎，90年代由于C群链球菌疫苗免疫使病情有所缓解。1990年在我国广东省首次发现猪群中有类似2型链球菌病，但未见人感染发病。1998-999年，江苏省和浙江省先后两次爆发猪2型链球菌病，上万头猪发病，几十位从业人员发生脑膜炎、关节炎及中毒性出血性休克征、多脏器功能损害，从病人和病猪中分离出猪链球菌2型菌株，人源分离株与猪源分离株为同源株。2005年6月，四川省资阳、 内江等地近80例患者急性SS2感染，其中12例重症患者死亡。目前我国流行的猪链球菌病以SS2为主。SS2存在复杂的致病机制。SS2菌株的致病性强弱与是否具有毒力因子密切相关。 已经发现SS2产生多种毒力因子，如溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)、溶血素 (SLY)、荚膜多糖(CPS)、纤连蛋白结合蛋白(FBPS)、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、IgG结合蛋白(IBP)、精氨酸脱亚氨酶(AD)、二肽肽酶IV(DPP IV)等等。其中MRP、EF、SLY为三个最重要的毒力因子。我国两次爆发的SS2均为MRP+EF+SLY+表型。报道的检测SS2毒力因子的方法有PCR和多重PCR方法。Smith等利用荚膜生物合成基因CPS的基因序列建立了针对1、2、9型猪链球菌的型特异性PCR鉴定方法。马清霞、 何孔旺、陆承平等设计并合成引物，建立了能同时检测SS2的CPS、MRP、EF的多重PCR方法， 该法特异性强、敏感性高，可直接从临床病料中检测出SS2并能鉴定其毒力因子表型。何孔旺等用PCR方法检测SS2的MRP和EF，敏感度可达100个细菌。EF、SLY两种毒力因子为分泌性蛋白，分泌到胞外，可随宿主的血液扩散到宿主全身，可能对SS2自身的扩散、对宿主全身性损伤、与其它病原微生物间的相互作用方面起到一定作用，有必要针对这两个毒力因子的分子流行病学和遗传变异情况加强监测。本发明根据公开的SS2的EF和SLY基因序列设计引物，建立多重PCR方法，通过一个PCR反应可以同时检测SS2的EF和SLY基因。
发明内容
本发明提供了一种同时检测猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的多重PCR 方法，用于猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的快速、鉴别检测。通过对Genbank中公开的SS2的EF和SLY基因序列比对，选取SS2的EF和SLY基因序列中的保守序列，用I^emier Primers 5.0软件和Oligo 6. 0软件设计引物。EF上游引物为5 ‘ -GAAGAAGAACCCAAGGAACC-3 ‘ ；EF 下游引物为5 ‘ -ACATTCTGACCACTCGCATC-3 ‘； 扩增的SS2的EF片段大小为158bp ；SLY上游引物为5 ‘ -TTCCGATTTCGTATTCAACC-3 ‘； SLY下游引物为5' -AACTGTTCTCCACCACTCCC-3‘；扩增的SLY片段大小为33^ρ。引物由上海生工生物工程有限公司合成。本发明的PCR反应体系为25ul体系，按顺序加入以下试剂
Buffer2.5ul
Mg2+1.5ul
dNTPIul
EF上下游引物(10 X )各0.5ul
SLY上下游引物(IOX)各0.5ul
模板Iul
酶0.25ul
灭菌水补足至25ul以上操作均在冰上进行，所有试剂加完后，盖盖，低速离心(1500gXaiiin)，置PCR 仪上进行PCR反应。本发明的PCR反应条件为
95°C预变性 5min
94。C变性 lmin，55°C退火1 min; 72。C延伸40s;扩增35个循环 72°C 延伸 IOmin
4°C 冷却 forever电泳检测条件为用0. 5X的TBE缓冲液配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳液，将电泳样品与溴酚蓝上样缓冲液按5 1比例混合后将样品依次加入加样孔中，上样量6ul。打开电泳仪，180V恒压电泳，使核酸样品向正极泳动。电泳结束后将凝胶置紫外-可见光凝胶成像仪中观察电泳结果。本发明的步骤包括(1)冰上操作，按顺序加入一定量的H20、Buffer、Mg2+、dNTP、引物、模板、酶等，盖盖，低速离心。(2)将上述25ul的反应体系放到PCR仪上，设定PCR反应程序，进行PCR扩增。(3)琼脂糖电泳检测用0. 5 X的TBE缓冲液配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳液，将电泳样品与溴酚蓝上样缓冲液按5 1比例混合后将样品依次加入加样孔中，上样量6-lOul。打开电泳仪，180V恒压电泳，使核酸样品向正极泳动。 电泳后置紫外-可见光凝胶成像仪中观察电泳结果。(4)判定标准如果电泳检测出现158、338bp的目的条带，则判定为EF和SLY基因检测均为阳性；如果没有目的条带，则判定为阴性。本发明具有灵敏度高、检测效率高、通过一个PCR反应即可快速检测出猪链球菌2 型的EF、SLY基因。本发明的检测灵敏度可达0. lng/ul。由于PCR仪的普及推广，本发明具有实用性强、检测成本低的优点。
附图1多重PCR扩增产物电泳检测结果。目的条带分子量分别为338bp和158bp， 分别对应SLY和EF基因片段。泳道1为DNA Marker,泳道2为多重PCR扩增结果，泳道3 为SLY基因PCR扩增结果，泳道4为EF基因PCR扩增结果，泳道5为阴性对照。附图2多重PCR扩增的灵敏度。泳道1-7的模板浓度依次为1、0. 1,0. 01,0. 001、 0.0001、0.00001、0.000001ng/ul，泳道8为阴性对照。泳道1、2中的目的条带分子量分别为338bp和158bp，分别对应SLY和EF基因片段。扩增产物电泳检测结果表明多重PCR检测SLY和EF基因的灵敏度为0. lng/ul。
具体实施例方式实施例1引物的设计与合成根据GenBank中公开的猪链球菌2型的EF、SLY基因序列，通过基因序列比对，选取保守序列，选取的EF、SLY的公开序列的GeneBank登录号分别为DQ417121. 1、 DQ443530. 1。使用 Primer Premiers 5.0 和 Oligo 6 软件自行设计 EF、SLY 基因 PCR 引物， 引物由上海生工生物技术公司合成。EF 上游引物为5 ‘ -GAAGAAGAACCCAAGGAACC-3 ‘ ；EF 下游引物为 5' -ACATTCTGACCACTCGCATC-3‘。扩增的 EF 片段大小为 158bp。SLY 上游引物为5 ‘ -TTCCGATTTCGTATTCAACC-3 ‘ ；SLY 下游引物为 5' -AACTGTTCTCCACCACTCCC-3‘。扩增的 SLY 片段大小为 338bp。实施例2细菌DNA的提取以猪链球菌2型HA9801株接种灭菌Todd-Hewitt肉汤培养基，37°C过夜培养，取细菌液ImL, 12000rpm离心2min,沉淀用567 μ L的TE缓冲液(ρΗ8· 0)重悬，加入30 μ L 的10% SDS和3yL的20mg/mL的蛋白酶K，充分混勻，37 °C水浴lh，加入IOOyL 5mol/ L的NaCl，充分混勻再加入80 μ L CTAB/NaCl溶液，混勻，65°C水浴lOmin，加入等体积的酚氯仿异戊醇05 24 1)混勻，12000rpm离心lOmin，吸取上清加入等体积的氯仿异戊醇04 1)混勻，12000rpm离心lOmin，吸取上清，加入0. 6体积的异丙醇，放入-20°C 20min,使DNA充分沉淀，12000rpm离心lOmin，沉淀用70%的乙醇洗涤2次，然后在室温下干燥，使乙醇挥发，沉淀用25 μ LpH8. O的TE (不含DNA酶的胰RNA酶20 μ g/mL) 溶解。测定提取DNA溶液的浓度和纯度。荧光PCR反应时调整DNA的浓度，吸取适量DNA，使25ul的PCR反应体系中模板含量为50-100ng。实施例3PCR方法的建立本发明的PCR反应体系为25ul体系，按顺序加入以下试剂
Buffer2.5ul
Mg2+1.5ul
dNTPIul
EF上下游引物(IOX)各0.5ul
SLY上下游引物(10 X )各0.5ul
模板Iul
酶0.25ul
灭菌水补足至25ul以上操作均在冰上进行，所有试剂加完后，盖盖，低速离心(1500gXaiiin)，置PCR 仪上进行PCR反应。本发明的PCR反应条件为
95°C预变性 5min
94°C变性 lmin，55°C退火1 min; 72°C延伸40s;扩增35个循环 72°C 延伸 IOmin
4°C 冷却 forever电泳检测条件为用0. 5 X的TBE缓冲液配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳液，将电泳样品与溴酚蓝上样缓冲液按5 1比例混合后将样品依次加入加样孔中。 上样量6ul。打开电泳仪，180V恒压电泳，使核酸样品向正极泳动。电泳结束后置凝胶紫外-可见光凝胶成像仪中观察电泳结果。判定标准如果电泳检测出现158、338bp的目的条带，则判定为EF和SLY基因PCR 检测均为阳性；如果没有目的条带出现，则判定为EF和SLY基因PCR检测阴性。实验需设阳性对照和阴性对照。结果见附图1。实施例4灵敏度检测取猪链球菌2型HA9801菌株的菌液lmL，离心，取沉淀，提取细菌DNA。紫外分光光度计测定DNA的纯度和浓度。用灭菌双蒸水将细菌DNA以10倍倍比稀释成10—1、10_2、10_3、 10_4、10_5、10_6、ΙΟ"7,10_8、10_9、10-1°不同浓度梯度。取每个稀释度的DNA作模板，进行PCR扩增。PCR扩增后，用2 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，以PCR法能检测出的最低模板浓度作为本发明方法的灵敏度。检测结果表明，提取的细菌DNA的浓度为2000ng/ul，纯度适合进行PCR检测。当模板浓度大于0. lng/ul时，PCR检测产物电泳检测出现两条目的条带；当模板浓度小于0. lng/ul时，PCR检测产物电泳检测未出现两条目的条带。标明本发明方法的检测灵敏度为0. lng/ul。结果见附图2。实施例5特异性检测分别挑取大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、马链球菌兽疫亚种、鸭疫里默氏杆菌等菌株单菌落，在LB液体培养基中振荡培养Mh，分别取Iml菌液，离心取菌体，提取细菌DNA。以猪链球菌2型HA9801株的细菌DNA为阳性对照，以灭菌双蒸水为阴性对照。用本发明建立的PCR方法扩增上述各菌株的细菌DNA，验证本发明方法的特异性。实验结果表明本发明方法的特异性强。PCR扩增大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、马链球菌兽疫亚种、鸭疫里默氏杆菌等细菌的DNA及双蒸水时，PCR扩增产物的电泳检测均未出现158、338bp的目的条带；而猪链球菌2型的阳性对照PCR扩增后电泳检测到 158、338bp的目的条带，与EF、SLY基因的目的条带大小一致，标明本发明只能特异性地 PCR检测猪链球菌2型的EF、SLY基因。实施例6重复性试验取三个不同培养批次的猪链球菌2型HA9801株37°C 20小时培养菌液1ml，提取细菌DNA。用本发明方法对每个批次的样品重复检测三次，验证本方法的重复性。以猪链球菌2型HA9801株的细菌DNA为阳性对照，以灭菌双蒸水为阴性对照。重复性检测结果表明，三个批次的样品重复检测的结果一致，每个样品重复检测3 次的结果也一致，PCR扩增产物电泳检测都出现出大小与目的条带一致的扩增片段。批间检测的变异系数(CV% )为1. 50%，每个样品重复检测3次的变异系数(CV% )为1. 14%。 结果表明本发明方法具有良好的重复性，从而保证了检测数据的可比性。实施例7SS2分离株的EF、SLY基因检测取2008-2010年间本单位自行分离、保存的19株SS2分离菌，挑取固体培养基保存的各菌株的单菌落，T-H肉汤中37°C静置培养对小时，提取细菌DNA。用本发明方法检测各分离株的EF、SLY基因。以HA9801株的DNA为阳性对照，以灭菌蒸馏水为阴性对照。多重PCR检测结果表明，19株SS2分离株及阳性对照的DNA的多重PCR扩增产物电泳检测均呈阳性，而阴性对照未检测到目的条带，19株SS2分离株的EF、SLY基因阳性率均为100%。
权利要求
1.一种同时检测猪链球菌2型胞外蛋白因子EF和溶血素基因SLY的多重 PCR方法，分别针对猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因设计PCR引物，胞外蛋白因子基因EF的上游引物为5 ‘ -GAAGAAGAACCCAAGGAACC-3 ‘，下游引物为 5 ‘ -ACATTCTGACCACTCGCATC-3 ‘，扩增的EF片段大小为；溶血素基因SLY的上游引物为5' -TTCCGATTTCGTATTCAACC-3‘，下游引物为5' -AACTGTTCTCCACCACTCCC-3‘，扩增的SLY片段大小为338bp，引物与Buffer、模板、酶等试剂构成PCR反应体系，PCR仪上进行扩增，本发明用于猪链球菌2型EF和SLY基因的快速、鉴别检测。
2.权利要求1所述的PCR反应体系为25ul体系，按顺序加入以下试剂Buffer2.5ulMg2+1.5uldNTPIulEF上下游引物(IOX)各0.5ulSLY上下游引物(IOX)各0.5ul模板Iul酶0.25ul灭齒水补足至25ul上述操作冰上进行，所有试剂加完后，盖盖，低速离心(1500gX aiiin)，置PCR仪上进行 PCR反应。
3.权利要求1所述的PCR反应条件为 95°C预变性 5min94°C变性 1 min, 55°C退火1 min; 72°C延伸40s;扩增35个循环 72°C 延伸 IOmin 4°C 冷却 forever
4.本发明的步骤包括(1)冰上操作，按顺序加入一定量的吐0、8吐作1~、1%2+、(1^1\引物、模板、酶等，盖盖，低速离心；(2)将上述25ul的反应体系放到PCR仪上，设定PCR反应程序，进行PCR扩增；(3)琼脂糖电泳检测用0.5 X的TBE缓冲液配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳液，将电泳样品与溴酚蓝上样缓冲液按5 1比例混合后将样品依次加入加样孔中。上样量6ul。打开电泳仪，180V恒压电泳，使核酸样品向正极泳动。电泳后置紫外-可见光凝胶成像仪中观察电泳结果；(4)判定标准如果电泳检测出现158、338bp的目的条带，则判定为EF和SLY基因检测均为阳性；如果没有目的条带，则判定为阴性。PCR实验需设阳性对照和阴性对照；本发明方法的灵敏度高(达0. lng/ul)，检测效率高，通过一个PCR反应即可快速检测出猪链球菌2型的EF、SLY基因。由于PCR仪的普及推广，本发明具有实用性强、检测成本低的优点。
全文摘要
本发明涉及一种检测猪链球菌2型胞外蛋白因子EF和溶血素基因SLY的多重PCR方法。根据GenBank公开的猪链球菌2型EF、SLY基因保守序列，分别设计、合成1对特异引物，优化多重PCR反应体系和反应条件，建立了同时检测猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的多重PCR方法。利用建立的多重PCR方法能够快速、鉴别检测出猪链球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因。
文档编号C12R1/46GK102242195SQ20111012307
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月13日 优先权日2011年5月13日
发明者张琳, 张秀美, 朱丽萍, 杨少华, 胡北侠, 许传田, 陆承平, 陈正涛, 颜世敢 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所