专利名称：一种耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体是涉及一种耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株Cl (荧光假单胞菌，/^Wi/OMWM fIuorescens^以及选育方法和产酶条件初步优化。
背景技术：
脂肪酶(Lipase，EC 3. 1. 1. 3)，又称三酰基甘油酰基水解酶，广泛存在于动植物和微生物中，它可将脂肪分解成甘油和脂肪酸，是一类特殊的酯键水解酶。它主要催化酯类化合物的水解、醇解、酯化、酯交换及合成等，反应不需要辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶作为一种重要的生物催化剂，已经被广泛应用于食品加工、医药研制、环境保护、造纸工业和生物产油的生产等领域。微生物来源的脂肪酶具有比植物动物脂肪酶更广的作用PH、 作用温度范围和对底物的专一性类型，生产条件易于控制，成本低，便于进行工业生产，获取高纯度制剂，以及加上微生物脂肪酶在酶学理论研究和实际应用中的作用而得到广泛研究。据文献报道，自然界中的许多微生物都产脂肪酶，包括有黑曲霉、白地霉、毛霉、巢子须霉、假单胞菌等。近年来，非水相酶学的研究又进一步拓展了脂肪酶的应用领域，在水相中，脂肪酶通常只能催化水解反应的进行，而在有机相中，它却能催化各种合成反应如酯化、酯的醇解、酯的氨解和酯的酸解等。然而有机溶剂会使酶变性或使酶活力下降，因此寻找耐有机溶剂的脂肪酶，使其在有机溶剂或含有机溶剂的环境中具有较高的催化活性，利用脂肪酶在有机相催化的各种反应合成许多高价值产品，已成为脂肪酶研究领域的一个重要方向。至今，分离得到的耐有机溶剂的脂肪酶产生菌为数不多，其中包括有feciBm sphaericus !^,Bacillus sp. , Yarrowia^-等，它们大部分是来自于土壤、深海以及沿岸沉积物中。与国外相比，我国对脂肪酶的研究和开发较晚，而且工业化的微生物脂肪酶制剂种类有限，因此，筛选具有新特性的活力高、产量高及成本低的脂肪酶菌种，同时开发脂肪酶新的应用领域是十分必要的。随着遗传工程的应用，酶的固定化技术及界面酶学和非水酶学的研究与应用，微生物脂肪酶将使诸多的传统产业面临新的挑战。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株及其产酶条件初步优化。 该脂肪酶高产菌株Cl可以产生能耐受多种有机溶剂的高活力脂肪酶，对于工业上生物柴油的制备以及利用有机相催化的各种反应合成许多高价值产品，对筛选具有新特性的活力高、产量高及成本低的脂肪酶菌种，同时开发脂肪酶新的应用领域具有十分重要的意义。本发明的耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株Cl，所述耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株 Cl为荧光假单胞菌(/^ei/i/offloaas /^/Ore1SceaS),于2011年4月7日，保藏于中国武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO :M2011110，其16SrDNA序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示。本发明的耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株Cl的形态学特征是该菌株属于革兰氏阴性弯曲短杆菌，两端钝圆，无芽胞，大小为约0. 8-1. 2 μ m ；在普通固体LB培养基表面生成淡黄色半透明菌落，表面光滑隆起，湿润，边缘整齐，较粘稠，易挑取，菌落大小均一，平均直径为1.5-2mm;在含有甘油三酯的固体培养基表面培养48_72h，菌落周围可形成透明圈；在肉汤中增菌培养72h出现均勻浑浊菌落生长，沿管壁表面有明显的菌膜或璧环。本发明的耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株Cl用于生产能耐受多种有机溶剂的高活力脂肪酶。上述所说的生产能耐受多种有机溶剂的高活力脂肪酶的方法步骤是将耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株Cl接种至种子培养基培养，将培养获得的种子液按1%转接于发酵培养基，28-30°C、pH7. 0-8. 5，200_220rpm摇床培养ll_24h，获得发酵液离心留上清。所述的种子培养基按组分重量(g) /培养基体积(mL)的百分比计，成分和比例如下葡萄糖 2%，蛋白胨 2. 5%，(NH4)2SO4O. 5%，K2HPO4 0. 1%，MgSO4 · 7H20 0. 05%，橄榄油 1. 0%， PH自然。在菌株发酵培养的过程中，培养基的组成和成分(碳源、氮源、碳氮比)，培养的条件(温度、时间、PH、转速)都对菌株发酵生产脂肪酶有显著影响。通过优化，确定最佳培养条件是发酵培养基中，碳源为葡萄糖；氮源为复合氮源蛋白胨和硫酸铵；其中培养基按重量 (kg)/体积(L)的百分比计，葡萄糖的使用量为1%，蛋白胨的使用量为2%，硫酸铵的使用量为0. 5% ；培养时间为15h，培养温度为30°C、初始pH为8. 0、接种量为1%、转速为200rpm。本发明的的耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株Cl采用常规的斜面传代保藏法，此方法是将本发明菌种接种于PDA斜面培养基表面，30°C恒温培养箱倒置培养1-2天，再于4°C 下低温保藏，可存放3个月左右；其PDA斜面培养基成分如下去皮马铃薯20%，葡萄糖2%， 琼脂2%，pH自然。本发明采用对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)法来测定脂肪酶的活力大小，主要以对硝基苯棕榈酸酯为反应底物，通过脂肪酶的催化反应，以产生的有色产物对硝基苯酚(P-NP) 在410nm波长下的吸收值来计算酶的活力。1个活力单位定义为标准实验条件下，每分钟催化每毫升p-NPP释放lymol ρ-ΝΡ所需的酶量。该法为国外测定脂肪酶活力的常用方法，操作简便、反应快、灵敏度高，能够进行连续的定性和定量的检测，是一种精确而且高效的活力测定方法。本发明的显著优点本发明的荧光假单胞菌iPseudomorms fluorescens ) Cl分离来自于汽车修理厂的含油污泥，具有良好的培养脂肪酶的生态环境，其生产的脂肪酶具有活力高，产量大的优点，并且可以耐受高浓度的甲醇、乙醇、正己烷等多种有机溶剂，对利用有机相催化反应生产多种高价值的产品，特别是工业上生物柴油的制备具有深远的意义。
图1是本发明菌株Cl经革兰氏染色后在显微镜下的菌体形态。图2是本发明菌株Cl以16SrDNA同源性为基础的系统发育树。图3是本发明菌株Cl的生长曲线和产酶曲线。图4是氮源对产酶的影响，其中1 尿素2 硫酸铵3 蛋白胨4 酵母膏+硫酸铵 5 牛肉膏+硫酸铵6 蛋白胨+硫酸铵。图5是碳源对产酶的影响，其中1 麦芽糖2 葡萄糖3 蔗糖4 乳糖5 可溶性淀
4粉6:环糊精。 图6是转速对产酶的影响。
图7是初始pH对产酶的影响。图8是接种量对产酶的影响。图9是温度对产酶的影响。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。除特别说明外，本发明中培养基组分都按组分重量(g) /培养基体积(mL)的百分比计。实施例一菌种的筛选 (1)样本采集
来自于南京金陵石化炼油厂附近土壤、南京雨润生肉销售点含油污泥、中国药科大学食堂长期积油土壤、粮油食品站油桶上油垢、汽车维修厂含油污泥等，共30个样本，用来分离选育耐有机溶剂的脂肪酶高产菌。(2)富集培养
称取2g 土壤样本悬浮于20mL无菌水中，振荡制成土壤悬液，充分混勻并静置IOmin 后，吸取3mL上清移入含有30mL富集培养基(富集培养基酵母膏0.02% ,Na2HPO4 0.35%， K2HPO4 0. 15%, MgSO4 · 7H20 0. 05%, NaCl 0. 05%，橄榄油 1. 0%, pH 7. 0)的无菌三角瓶中， 30°C、220rpm下，摇床培养72h后，无菌操作转接300 μ L浑浊菌液到新鲜的富集培养基中， 连续富集3次。(3)平板初筛和复筛
吸取ImL富集培养液用无菌水洗涤2次后，按10_4、10_5、10_6、10_7配制不同梯度稀释液，分别取稀释液20 μ L均勻涂布平板初筛培养基(初筛培养基酵母膏0. 1%，蛋白胨0. 2%， (NH4)2SO4 0. 2%，橄榄油乳化液 1. 2%, K2HPO4 0. 1%, KCl 0. 05%,MgSO4 ·7Η20 0. 05%，琼脂 1. 5%, 罗丹明B (0. 1 mg/mL) 10%, pH 7. 0)，倒置恒温培养箱30°C培养72h，挑选有黄色变色圈或透明圈菌落，经划线培养获得单菌落，PDA试管4°C保藏供平板复筛。将初筛菌种取一环接种于LB培养基，30°C、220rpm活化12h，取ImL菌液梯度稀释至10_5，取20 μ L稀释液均勻涂布于平板复筛培养基上(复筛培养基蛋白胨1.0%，蔗糖 0. 5%，橄榄油乳化液 1. 2%，(NH4)2SO4 0. 1%, K2HPO4 0. 1%, KCl 0. 1%，琼脂 1. 5%，pH 7. 0)，倒置恒温培养箱30°C培养72h，挑选透明圈较大的菌株进行摇瓶复筛。(4)摇瓶复筛发酵
从复筛平板上挑选出的透明圈较大的菌株，取一环接种于含有50mL发酵培养基的无菌三角瓶中，30°C、200rpm，摇床培养24h。收集发酵液于4°C、12000rpm,冷冻离心20min，回收上清液测定酶活，以对硝基苯棕榈酸酯为底物，测定对硝基酚的产生量来计算脂肪酶酶活。经过富集，平板初筛、复筛，摇瓶复筛发酵，从30份土样中共分离得到33株有透明圈的
5菌株，经复筛发现有15株产酶特性较佳的菌株(>0. 05U/mL)，其中有3株产酶能力相对最高(> 0.10U/mL)，在复筛培养基中生长快，透明圈较大，经反复培养产酶特性均很稳定，结果见表1。 表1 菌种筛选结果
权利要求
1.一株耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株Cl，其特征在于所述耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株Cl为荧光假单胞菌，其保藏号为CCTCC NO僅2011110，其165劝嫩序列如序列表中SEQ ID NO. 1 所示。
2.耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株Cl在生产耐有机溶剂的脂肪酶中的应用。
3.—种生产耐耐有机溶剂的脂肪酶的方法，其特征在于，将耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株Cl接种至种子培养基培养，将培养获得的种子液按1%转接于发酵培养基，28-30°C、 pH7. 0-8. 5，200-220rpm摇床培养ll_24h，获得发酵液离心留上清。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基按重量(g)/体积(mL) 的百分比计，成分如下葡萄糖2%，蛋白胨2. 5%，(NH4)2SO4O. 5%，K2HPO4 0. 1%，MgSO4 · 7H20 0.05%，橄榄油1. 0%, pH自然。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基中，碳源为葡萄糖；氮源为复合氮源蛋白胨和硫酸铵；其中培养基按重量(g)/体积(HiL)的百分比计，葡萄糖的使用量为1%，蛋白胨的使用量为2%，硫酸铵的使用量为0. 5%。
6.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，发酵温度为30°C，发酵周期为15h，最 pH 为 ρΗ8· 0，转速为 200rpm。
全文摘要
本发明涉及一种耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1及其应用。所述的耐有机溶剂的脂肪酶高产菌株C1为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，保藏号为CCTCC NOM2011110。本发明提供的荧光假单胞菌可用于生产具有耐有机溶剂性质的脂肪酶，能够广泛应用于工业上生物柴油的制备以及利用有机相催化的各种反应合成许多高价值产品，对筛选具有新特性的活力高、产量高及成本低的脂肪酶菌种，同时开发脂肪酶新的应用领域具有十分重要的意义。
文档编号C12N9/20GK102220268SQ20111012616
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月16日 优先权日2011年5月16日
发明者吕炜锋, 姚文兵, 袁玲 申请人:中国药科大学