专利名称：一种食品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的合检方法
技术领域：
本发明涉及一种食品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的合检方法。
背景技术：
海产品中主要微生物污染的弧菌包括副溶血弧菌、霍乱弧菌等。国内对于副溶血弧菌和霍乱弧菌的传统检验方法是依据各自的标准进行单独检验，检验工作繁琐而且效率较低。现在虽已有比较先进的快速分子生物学检测方法，但该方法的检测要求比较高，检测成本昂贵，一般不适合在基础检测实验室中应用。现有一种申请号为200610068561. 0名称为《食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法》中国发明专利公开了一种检测方法，其特征在于其检测步骤为待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、 染色、漂洗，最后用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。该发明的优点在于可同时检测食品中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量。但其缺点是检测工艺复杂，操作难度大，且检测成本高，所以该检测方法还有待于改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种检测工艺简单、 操作方便、通过利用弧菌的共性能同时对副溶血弧菌和霍乱弧菌两种弧菌合检的方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为本食品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的合检方法，其特征在于依次包括以下步骤一、配制测试液对固体或半固体被检物的测试液配制步骤为在无菌操作下称取固体或半固体被检物的样品，放入到装有氯化钠和蛋白胨水混和液的无菌容器中，样品的质量与混和液的体积比为1比9，然后加入试剂调节混和液的PH值至8. 4，摇勻后备用； 如果被检物是液体，对液体被检物测试液配制步骤为用无菌吸管吸取样品，放入到装有氯化钠和蛋白胨水混和液的无菌容器中，样品的体积与混和液的体积比为1比9，然后加入试剂调节混和液的PH值至8. 4，摇勻后即制成测试液；所述氯化钠和蛋白胨水的混和液配比为每IOOml的蒸馏水中含蛋白胨为2g，含氯化钠为2. Ig ；所述样品的质量与混和液的体积比为1比9，是指质量以克为单位，体积以毫升为单位。二、增菌培养测试液中的样品为冻品的，将测试液放置于温度为35 37°C中进行增菌培养6 M小时；如果测试液中的样品为新鲜的，将测试液放置于温度为40. 5 42. 5°C中进行增菌培养6 M小时；三、分离培养将增菌培养至6 对小时的测试液接种至弧菌显色反应培养基中， 在温度为35 37°C中培养18 M小时，检查显色反应培养基上是否呈现有可疑的副溶血弧菌颜色的菌落或/和霍乱弧菌颜色的菌落；四、鉴定结论选取可疑颜色的菌落，用无菌的生理盐水制备成菌悬液，通过生化鉴定物对该样品是否带有副溶血弧菌和霍乱弧菌作出鉴定，如果鉴定结果没有发现副溶血弧菌和霍乱弧菌的，给出未检测出副溶血弧菌或霍乱弧菌的结论；如果鉴定结果发现有副溶血弧菌或/和霍乱弧菌的，给出检测到副溶血弧菌或/和霍乱弧菌的结论，并进入血清学试验即将检测到的副溶血弧菌或/和霍乱弧菌各自进行血清学检验，然后给出检验结果。
作为改进，所述步骤一中对固体或半固体被检物的测试液配制步骤为对固体或半固体样品在无菌操作下称取25g样品，放入到装有225ml氯化钠和蛋白胨水混和液的无菌容器中，然后将无菌容器在8000转/分勻速摇动1 2分钟或者以每秒6 9次轻拍无菌容器的方式拍击1分钟，接着加入碱性或酸性试剂调节混和液的PH值至8. 4，即制成测试液。 再改进，所述碱性试剂可优选为氢氧化钾或氢氧化镁。再改进，所述酸性试剂可优选为盐酸、稀硫酸或磷酸。再改进，所述权利要求1步骤三中的分离培养的具体方法为将增菌6 8小时和18 M小时的测试液分别接种于弧菌显色反应培养基中，并在温度为35 37°C中培养 18 M小时；副溶血弧菌在弧菌显色反应培养基上呈现粉红色菌落，霍乱弧菌在弧菌显色反应培养基上呈现蓝色或者蓝绿色菌落，如果在显色反应培养基上发现有粉红色菌落或蓝色或蓝绿色颜色的菌落，则说明所述样品中带有可疑的副溶血弧菌或霍乱弧菌，如果在显色反应培养基上均发现有粉红色菌落和蓝色的菌落、或者发现有粉红色菌落和蓝绿色颜色的菌落时，则说明所述样品中既带有可疑的副溶血弧菌又带有可疑的霍乱弧菌。再改进，所述权利要求1步骤四中所述生化鉴定物对该样品是否带有副溶血弧菌和霍乱弧菌作鉴定的方法是挑取可疑菌落，用无菌的生理盐水制备成浊度适当的菌悬液， 然后采用API生化鉴定试剂盒或采用VITEK全自动微生物生化鉴定系统作出鉴定结果。再改进，所述无菌的生理盐水配制方法为在每IOOOml的蒸馏水中加入8. 5g氯化钠，然后使氯化钠在蒸馏水的容器中完全溶解，再将容器放置于温度为120 122°C中灭菌 14 16分钟，即完成无菌生理盐水的配制。与现有技术相比，本发明的优点在于将氯化钠和蛋白胨水混和液的pH值控制为 8. 4和盐度控制每IOOml中氯化钠为2. Ig,并通过弧菌显色反应培养基，能方便对副溶血弧菌和霍乱弧菌的两种弧菌同时进行培养并检测，不仅检测工艺简单、操作方便，而且具有检测成本低，检测结果准确的优点。
图1为本发明实施例的检测工艺流程式示意图。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。如图1所示，本实施例的食品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的合检方法，其特征在于 依次包括以下步骤一、配制测试液对固体或半固体被检物的测试液配制步骤为在无菌操作下称取固体或半固体被检物的样品，放入到装有氯化钠和蛋白胨水混和液的无菌容器中，样品的质量与混和液的体积比为1比9，然后加入试剂调节混和液的PH值至8. 4，摇勻后备用；如果被检物是液体，对液体被检物测试液配制步骤为用无菌吸管吸取样品，样品的体积与混和液的体积比为1比9，然后加入试剂调节混和液的pH值至8. 4，摇勻后即制成测试液； 所述氯化钠和蛋白胨水的混和液配比为每IOOml的蒸馏水中含蛋白胨为2g，含氯化钠为 2. Ig ；所述样品的质量与混和液的体积比为1比9，是指质量以克为单位，体积以毫升为单位；上述的半固体是指介于固体和液体之间的一类物品。二、增菌培养测试液中的样品为冻品的，将测试液放置于温度为35 37°C中进行增菌培养6 M小时；如果测试液中的样品为新鲜的，将测试液放置于温度为40. 5 42. 5°C中进行增菌培养6 M小时；三、分离培养将增菌培养至6 对小时的测试液接种至弧菌显色反应培养基中， 在温度为35 37°C中培养18 M小时，检查显色反应培养基上是否呈现有可疑的副溶血弧菌颜色的菌落或/和霍乱弧菌颜色的菌落；四、鉴定结论选取可疑颜色的菌落，用无菌的生理盐水制备成菌悬液，通过生化鉴定物对该样品是否带有副溶血弧菌和霍乱弧菌作出鉴定，如果鉴定结果没有发现副溶血弧菌和霍乱弧菌的，给出未检测出副溶血弧菌或霍乱弧菌的结论；如果鉴定结果发现有副溶血弧菌或/和霍乱弧菌的，给出检测到副溶血弧菌或/和霍乱弧菌的结论，并进入血清学试验即将检测到的副溶血弧菌或/和霍乱弧菌各自进行血清学检验，然后给出检验结果。上述步骤一中的对固体或半固体被检物的测试液配制步骤为对固体或半固体样品在无菌操作下称取25g样品，放入到装有225ml氯化钠和蛋白胨水混和液的无菌容器中，然后将无菌容器在8000转/分勻速摇动1 2分钟，或者以每秒6 9次轻拍无菌容器的方式拍击1分钟，然后加入氢氧化钾碱性试剂或盐酸的酸性试剂调节混和液的PH值至 8. 4，即制成测试液。当然，上述碱性试剂也可以氢氧化镁等试剂，所述酸性试剂也可以为稀硫酸或磷酸等试剂，具体可按要求而定。上述步骤三中所述分离培养的具体方法为将增菌6 8小时和18 M小时的测试液分别接种于弧菌显色反应培养基中，并在温度为35 37°C中培养18 M小时；副溶血弧菌在弧菌显色反应培养基上呈现粉红色菌落，霍乱弧菌在弧菌显色反应培养基上呈现蓝色或者蓝绿色菌落，如果在显色反应培养基上发现有粉红色菌落或蓝色或蓝绿色颜色的菌落，则说明所述样品中带有可疑的副溶血弧菌或霍乱弧菌，如果在显色反应培养基上均发现有粉红色菌落和蓝色的菌落、或者发现有粉红色菌落和蓝绿色颜色的菌落时，则说明所述样品中既带有可疑的副溶血弧菌又带有可疑的霍乱弧菌。上述步骤四中所述生化鉴定物对该样品是否带有副溶血弧菌和霍乱弧菌作鉴定的方法是挑取可疑菌落，用无菌的生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，然后采用API生化鉴定试剂盒或采用VITEK全自动微生物生化鉴定系统作出鉴定结果。无菌的生理盐水配制方法为在每IOOOml的蒸馏水中加入8. 5g氯化钠，然后使氯化钠在蒸馏水的容器中完全溶解，再将容器放置于温度为120 122°C中灭菌14 16分钟，即完成无菌生理盐水的配制。以下对本发明作进一步说明；一、样品的处理(时指配制测试液)固体或半固体样品以无菌操作称取25g样品，放入装有225ml2. 氯化钠蛋白胨水(ph8. 4)的灭菌均质杯(无菌均纸袋)内，于8000 转/min (转/min指每分钟转数)均质Imin ^iin或用拍打式均质器以每秒6 9次，拍击lmin，制成1 10样品勻液。液体样品用灭菌吸管吸取25ml样品，放入装有225ml2. 氯化钠蛋白胨水(Ph8. 4)的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇制成 1 10样品勻液。二、增菌培养将上述样品勻液进行增菌培养他 Mh，冻品于36°C 士 1°C进行培养，新鲜样品与41. 5°C 士 1°C。三、分离培养将增菌他 8h以及1 24h的样液分别接种于弧菌显色平板上 (课题研制)，也可以用等同的显色平板，36°C 士 1°C培养1 Mh。副溶血弧菌在弧菌显色平板上呈现粉红色菌落，霍乱弧菌呈现蓝色或者蓝绿色菌落。(某些弧菌，如创伤弧菌也可能会产生与霍乱弧菌相似的蓝色或者蓝绿色菌落)。四、鉴定结论挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒(如API)或全自动微生物生化鉴定系统(VITEK)或生化反应进行鉴定。五、血清学试验用副溶血弧菌和霍乱弧菌多价血清进行血清学试验。报告根据生化鉴定是否符合副溶血弧菌以及霍乱弧菌，直接报告检出或者未检出副溶血弧菌或霍乱弧菌。培养基及试剂1、氯化钠和蛋白胨水混和液的配制方法为组成蛋白胨20g ；氯化钠21g ；蒸馏水IOOOml ；制法混勻后，用KOH或HCl调节pH值至8. 4，根据试验需要分装于广口瓶或者试管中，于121°C灭菌15min。2、无菌生理盐水成分氯化钠8. 5g ；蒸馏水IOOOml制法称取8. 5g氯化钠溶于IOOOml蒸馏水中，121°C灭菌15min。1、蛋白胨是由蛋白质经酶、酸、碱水解而获得的一种胨、胨肽氨基酸组成的水溶性混合物，它是微生物培养最主要的基础成分，在培养基中的主要作用是为微生物生长提供氮源。种类很多包括肉胨、骨蛋白胨、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨等。2、上述的弧菌显色反应培养基的制备请见专利号为200680016852. 3的本联合公司申请的专利资料。3、上述中血清学试验为常用检测方法的公知技术。4、主要技术参数PH值和盐度的研究和弧菌显色培养基的开发，完成此方法，除了基础培养基以外，最重要的就是设定增菌液的条件，既要找到副溶血弧菌和霍乱弧菌生长最佳条件(PH，和盐度)，又要通过曲线交叉的方法来找到副溶血弧菌和霍乱弧菌共同生长最佳条件(PH，和盐度)，通过实验和验证，最后找出实际检测过程所需要的增菌液的条件(PH和盐度)。5、上述中所述的菌落为公知名称，即指分布于培养基上不同位置的菌种。
权利要求
1.一种食品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的合检方法，其特征在于依次包括以下步骤一、配制测试液对固体或半固体被检物的测试液配制步骤为在无菌操作下称取固体或半固体被检物的样品，放入到装有氯化钠和蛋白胨水混和液的无菌容器中，样品的质量与混和液的体积比为1比9，然后加入试剂调节混和液的PH值至8. 4，摇勻后备用；如果被检物是液体，对液体被检物测试液配制步骤为用无菌吸管吸取样品，放入到装有氯化钠和蛋白胨水混和液的无菌容器中，样品的体积与混和液的体积比为1比9，然后加入试剂调节混和液的PH值至8. 4，摇勻后即制成测试液；所述氯化钠和蛋白胨水的混和液配比为每 IOOml的蒸馏水中含蛋白胨为2g，含氯化钠为2. Ig ；所述样品的质量与混和液的体积比为1 比9，是指质量以克为单位，体积以毫升为单位。二、增菌培养测试液中的样品为冻品的，将测试液放置于温度为35 37°C中进行增菌培养至6 M小时；如果测试液中的样品为新鲜的，将测试液放置于温度为40. 5 42. 5°C中进行增菌培养至6 M小时；三、分离培养将增菌培养至6 M小时的测试液接种至弧菌显色反应培养基中，在温度为35 37°C中培养18 M小时，检查显色反应培养基上是否呈现有可疑的副溶血弧菌颜色的菌落或/和霍乱弧菌颜色的菌落；四、鉴定选取可疑颜色的菌落，用无菌的生理盐水制备成菌悬液，通过生化鉴定物对该样品是否带有副溶血弧菌和霍乱弧菌作出鉴定，如果鉴定结果没有发现副溶血弧菌和霍乱弧菌的，给出未检测出副溶血弧菌或霍乱弧菌的结论；如果鉴定结果发现有副溶血弧菌或/和霍乱弧菌的，给出检测到副溶血弧菌或/和霍乱弧菌的结论，并进入血清学试验即将检测到的副溶血弧菌或/和霍乱弧菌各自进行血清学检验，然后给出检验结果。
2.根据权利要求1所述的合检方法，其特征在于所述步骤一中对固体或半固体被检物的测试液配制步骤为对固体或半固体样品在无菌操作下称取25g样品，放入到装有 225ml氯化钠和蛋白胨水混和液的无菌容器中，然后将无菌容器在8000转/分勻速摇动 1 2分钟或者以每秒6 9次轻拍无菌容器的方式拍击1分钟，接着加入碱或酸试剂调节混和液的PH值至8. 4，即制成测试液。
3.根据权利要求2所述的合检方法，其特征在于所述碱试剂为氢氧化钾或氢氧化镁。
4.根据权利要求2所述的合检方法，其特征在于所述酸试剂为盐酸、稀硫酸或磷酸。
5.根据权利要求1所述的合检方法，其特征在于所述权利要求1步骤三中的分离培养的具体方法为将增菌6 8小时和18 M小时的测试液分别接种于弧菌显色反应培养基中，并在温度为35 37°C中培养18 M小时；副溶血弧菌在弧菌显色反应培养基上呈现粉红色菌落，霍乱弧菌在弧菌显色反应培养基上呈现蓝色或者蓝绿色菌落，如果在显色反应培养基上发现有粉红色菌落或蓝色或蓝绿色颜色的菌落，则说明所述样品中带有可疑的副溶血弧菌或霍乱弧菌，如果在显色反应培养基上均发现有粉红色菌落和蓝色的菌落、 或者发现有粉红色菌落和蓝绿色颜色的菌落时，则说明所述样品中既带有可疑的副溶血弧菌又带有可疑的霍乱弧菌。
6.根据权利要求1所述的合检方法，其特征在于所述权利要求1步骤四中所述生化鉴定物对该样品是否带有副溶血弧菌和霍乱弧菌作鉴定的方法是挑取可疑菌落，用无菌的生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，然后采用API生化鉴定试剂盒或采用VITEK全自动微生物生化鉴定系统作出鉴定结果。
7.根据权利要求1或6所述的合检方法，其特征在于所述无菌的生理盐水配制方法为在每IOOOml的蒸馏水中加入8. 5g氯化钠，然后使氯化钠在蒸馏水的容器中完全溶解， 再将容器放置于温度为120 122°C中灭菌14 16分钟，即完成无菌生理盐水的配制。
全文摘要
一种食品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的合检方法，其特征在于依次包括以下步骤1、配制测试液2、增菌培养测试液中的样品为冻品的，将测试液放置于温度为35～37℃中进行增菌培养6～24小时；如果测试液中的样品为新鲜的，将测试液放置于温度为40.5～42.5℃中进行增菌培养6～24小时；3、分离培养将增菌培养至6～24小时的测试液接种至弧菌显色反应培养基中在温度为35～37℃中培养18～24小时，检查显色反应培养基上是否呈现有可疑的副溶血弧菌颜色的菌落或/和霍乱弧菌颜色的菌落；4、鉴定结论。与现有技术相比，本发明的优点在于不仅检测工艺简单、操作方便，而且具有检测成本低，检测结果准确的优点。
文档编号C12Q1/04GK102242182SQ201110134449
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月13日 优先权日2011年4月7日
发明者徐君辉, 汪云泉, 沈飚, 胡兴娟, 贝文联, 陶海波 申请人:中华人民共和国舟山出入境检验检疫局