专利名称：用于发酵生产l-缬氨酸的重组dna、菌株及方法
技术领域：
本发明涉及L-缬氨酸的生产方法，特别涉及一种用于发酵生产L-缬氨酸的DNA、 菌株及方法，属于微生物工程技术领域。
背景技术：
发酵法生产L-缬氨酸，大多采用从自然环境分离的微生物菌株或者由此微生物菌株得到的人工突变株。已知的高产人工突变株大多为α-氨基丁酸(α-ΑΒ)、α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)和2-噻唑丙氨酸(2-ΤΑ)等抗性，并且属于棒杆菌属、短杆菌属和
埃希氏属等。就棒杆菌或短杆菌来说，目前已有公开载体质粒，这些质粒在细菌中是可以自主复制的，并具有药物抗性标记基因(参见US4514502)，并有公开用于把基因引入细菌细胞的方法(例如JP2207791)，以及公开了通过利用前述的技术培养L-缬氨酸产生菌的可能性 (例如 W00050624)。乙酰羟酸合成酶AHAS是L-缬氨酸合成途径上的第一个共用酶也是关键酶，催化2 分子丙酮酸脱羧合成1分子乙酰乳酸，即缬氨酸的前体。AHAS受三种支链氨基酸中的任何一种反馈抑制。三种支链氨基酸的半抑制浓度(IC5tl)分别为缬氨酸0.9mmol/L、异亮氨酸 3. lmmol/L和亮氨酸6. Ommol/L，缬氨酸的抑制能力最强；当某一支链氨基酸浓度达5mmol/ L时，该酶受抑制程度分别为56% (缬氨酸)、49% (异亮氨酸)和48% (亮氨酸)；需要指出的是，任意两种支链氨基酸组合，甚至全部三种支链氨基酸协同抑制，AHAS被抑制程度不超57%。对谷氨酸棒杆菌AHAS调节亚基进行定点突变，获得了解除反馈抑制的突变体。 对谷氨酸棒杆菌IlvN上3个相连的氨基酸残基进行替换，得到一不受任何支链氨基酸抑制的突变体。这些结果说明在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) IlvN上三种支链氨基酸的结合位点为同一个变构位点，但该位点对三种氨基酸的亲和性不同。二羟酸还原异构酶AHMR是L-缬氨酸合成途径上的第二个酶，催化乙酰乳酸生成2，3-二羟基异戊酸。反应包括烷基的异构和还原；发生该反应还需要Mg2+(激活剂)和 NADPH (氢供体)。二羟酸脱水酶DHAD是L-缬氨酸合成途径上的第三个酶，催化2，3_ 二羟基异戊酸生成2-酮异戊酸。支链氨基酸转氨酶TA是支链氨基酸合成途径上的最后一个共用酶。转氨酶B、转氨酶C和芳香转氨酶(编码基因分别为ilvE、avtA和tyrB)在支链氨基酸的合成中具有催化活性，但主要由转氨酶B催化三种支链氨基酸合成的最后一步反应。由于L-缬氨酸生产菌株通常通过多次诱变和逐级筛选而获得，耐热性缺失，L-缬氨酸发酵生产一般采用低于35°C发酵，如传统的31°C 7 发酵。然而L-缬氨酸生物合成途径的酶的最适温度却在:35°C 以上，TA :30-35°C,DHAD 37°C,AHAIR 45°C,AHAS :50°C。传统发酵的温度低于L-缬氨酸生物合成途径的酶的最适温度。相反，野生型菌株却能在高温下生长良好，具有较高的代谢强度。
在野生型菌株中表达L-缬氨酸生物合成途径的酶的基因，并采用高温短时发酵的方法并没有建立。高温短时发酵不仅能缩短发酵周期、节约成本和提高设备利用率，而且也能节省大量冷却水，而使用大量冷却水是在传统发酵中必需的，特别是在夏季、热带和亚热带地区。
发明内容
本发明的目的之一是克隆L-缬氨酸产生菌L-缬氨酸生物合成途径的酶的基因， 并解析其序列。本发明的另一目的是获得解除三种支链氨基酸对乙酰羟酸合成酶AHAS。本发明的又一目的是表达L-缬氨酸生物合成途径的酶的基因，提高L-缬氨酸的产量。本发明的再一目的是根据L-缬氨酸生物合成途径的酶反应的最适温度，构造高温短时发酵模型。本发明的目的还在于提供一种耐高温的缬氨酸产生菌株。此外，本发明的目的还包括提供一种缬氨酸产生菌株，其中如下L-缬氨酸生物合成途径的酶的活性得到增强a) ilvBN基因编码的乙酰羟酸合成酶AHAS ；b)ilvC基因编码的乙酰羟酸还原异构酶AHMR ；c)ilvE基因编码的支链氨基酸转氨酶TA。以及，本发明的目的是提供一种高温短时发酵L-缬氨酸的方法。为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案一种用于发酵生产L-缬氨酸的重组DNA，其特征在于该重组DNA包括解除了三种支链氨基酸对乙酰羟酸合成酶的反馈抑制的编码乙酰羟酸合成酶的DNA序列、编码二羟基还原异构酶的DNA序列以及编码支链氨基酸转氨酶的DNA序列。具体而言，所述解除了三种支链氨基酸对乙酰羟酸合成酶的反馈抑制的乙酰羟酸合成酶从N端开始计算，该乙酰羟酸合成酶催化亚基的第30位的赖氨酸突变为谷氨酰胺， 第156位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，第233位的缬氨酸突变为异亮氨酸，其序列见SEQ ID NO :10，且该乙酰羟酸合成酶调节亚基的20位的甘氨酸突变为天冬氨酸，21位的异亮氨酸突变为天冬氨酸，22位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，42位的丙氨酸突变为缬氨酸，47位的组氨酸突变为亮氨酸，其序列见SEQ ID NO=Il ；所述二羟酸还原异构酶是来源于棒杆菌或短杆菌的二羟酸还原异构酶，其具有与 SEQ ID NO 12实质相同的氨基酸序列；所述支链氨基酸转氨酶是来源于棒杆菌或短杆菌的支链氨基酸转氨酶，其具有与 SEQ ID NO 14实质相同的氨基酸序列。一种棒杆菌或短杆菌，其特征在于，它包含如上所述的重组DNA。进一步的讲，该棒杆菌或短杆菌是导入如权利要求1所述重组DNA而转化过的。如上所述棒杆菌或短杆菌在发酵生产L-缬氨酸工艺中的应用。一种生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，该方法为在发酵培养基中对如上所述的棒杆菌或短杆菌进行培养，生产L-缬氨酸，所述培养温度在31°C 40°C。
优选的，所述培养温度为31°C，培养时间72h。优选的，所述培养温度为34°C 40°C，培养时间在4 左右。根据本发明，在黄色短杆菌中表达L-缬氨酸产生菌种的L-缬氨酸合成基因，根据 L-缬氨酸生物合成酶的最适温度，采用高温短时发酵，菌株的代谢强度得到提高，L-缬氨酸生物合成酶的活性提高，L-缬氨酸的产量和糖酸转化率提高。本发明可被运用于采用黄色短杆菌的L-缬氨酸的生产。为达到上述目标，本案发明人进行了长期研究和大量实践，并发现与现有技术相比，本发明采用表达L-缬氨酸产生菌L-缬氨酸生物合成基因，能大大提高L-缬氨酸的产量；且根据L-缬氨酸生物合成酶的最适温度，构建发酵模型，尤其是高温短时发酵模型，菌株的代谢强度得到提高，L-缬氨酸生物合成酶的活性提高，L-缬氨酸的产量和糖酸转化率可得到进一步提高。
图1是L-缬氨酸生物合成路线图，其中TD-苏氨酸脱氨酶、AHAS-乙酰羟酸合成酶、AHAIR- 二羟酸还原异构酶、DHAD- 二羟酸脱水酶、TA-支链氨基酸转氨酸和IPMS-异丙基苹果酸合成酶。图 2 是 pDXW-8-iIvraNrC 图谱；图3是L-缬氨酸产生菌和工程菌在不同温度下生长情况的照片；图4A-4H是在不同发酵条件L-缬氨酸的发酵参数，其中㈧干重DCW，⑶比生长速率μ，(C)残糖浓度，(D)比耗糖速率qs，(E) L-缬氨酸产量，(F) L-缬氨酸比生产速率 qval，(G)AHAS活性，(H)副产物，并且□和曲线 1 黄色短杆菌 Brevibacteriumflavum ATCC1406731°C >72h 发酵；Δ和曲线 2 黄色短杆菌 B. flvumATCC14067/pDXff-8-iIvEBNrC 31°C>72h 发酵；■和曲线 3 黄色短杆菌 B. f lavum ATCC14067/pDXff-8-iIvEBNrC 34°C>48h 发酵；▼和曲线 4 黄色短杆菌 B. flavum ATCC14067/pDXff-8-iIvEBNrC 37°C、48h 发酵；* 和曲线 5 黄色短杆菌 B. flavum ATCC14067/pDXff-8-iIvEBNrC 40°C、48h 发酵。
具体实施例方式如下详细说明本发明的实现途径用于提供L-缬氨酸生物合成基因的L-缬氨酸产生菌株的筛选"L-缬氨酸产生菌株”是指在培养基中培养该菌株时，在培养基中有积累L-缬氨酸的能力。L-缬氨酸产生菌株大多为从自然环境分离的微生物菌株或者由此微生物菌株诱变选育得到的人工突变株，如营养缺陷型突变株、结构类似物抗性株或者代谢调节突变株等，且营养缺陷型突变、结构类似物抗性或者代谢调节突变等特性可以单独赋予或者两项或多项联合赋予。已知的高产人工突变株大多为L-亮氨酸渗透缺陷型、α-氨基丁酸 (a-AB)、α -氨基-β -羟基戊酸(AHV)和2_噻唑丙氨酸(2_ΤΑ)等抗性。L-缬氨酸产生菌大致有谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)禾口乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)。L-缬氨酸产生菌L-缬氨酸生物合成途径的酶的基因的解析和制备
L-缬氨酸生物合成途径的酶来源于上述L-缬氨酸产生菌，具有营养缺陷型突变、 结构类似物抗性和代谢调节突变的特性。(1)用于本发明方法中编码突变体乙酰羟酸合成酶AHAS的ilvBN用于本发明方法中的编码突变体乙酰羟酸合成酶AHAS具有突变(a)从N端开始计算，乙酰羟酸合成酶催化亚基的第30位的赖氨酸突变为谷氨酰胺，第156位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，第233位的缬氨酸突变为异亮氨酸；(b)从N端开始计算，乙酰羟酸合成酶调节亚基的42位的丙氨酸突变为缬氨酸，47 位的组氨酸突变为亮氨酸。(2)用于本发明方法中编码突变体乙酰羟酸合成酶AHAS的ilvBf用于本发明方法中的编码突变体乙酰羟酸合成酶AHAS具有突变，解除了三种支链氨基酸对AHAS的反馈抑制从N端开始计算，乙酰羟酸合成酶调节亚基的20位的甘氨酸突变为天冬氨酸，21位的异亮氨酸突变为天冬氨酸，22位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸。 iIvBNr编码的AHAS的催化亚基序列如SEQID NO :10，AHAS的调节亚基序列如SEQ ID NO 11。ilvf是通过体外定点突变获得的，突变体通过采用突变引物PCR和Dpn I处理获得的，方法参照《Molecular Cloning :ALaboratory Manual》，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，2001。(3)用于本发明方法中编码乙酰羟酸还原异构酶AHMR的ilvC编码乙酰羟酸还原异构酶AHMR的ilvC与编码乙酰羟酸合成酶AHAS的iIvBN在基因组上形成一个操纵子。iIvBNlrC序列如SEQ ID NO :9。乙酰羟酸还原异构酶AHMR序列如 SEQ ID NO :12ο(4)用于本发明方法中编码支链氨基酸转氨酶TA的ilvE用于本发明方法中的编码支链氨基酸转氨酶TA的ilvE具有突变，消除了 1082位的EcoR I位点，但支链氨基酸转氨酶TA得序列没有改变。消除了 ilvEEcoR I位点的序列如SEQ ID NO 13，支链氨基酸转氨酶TA序列如SEQ IDNO :14。消除ilvE EcoR I位点是通过体外定点突变获得的，突变体通过采用突变引物PCR 和 Dpn I 处理获得的，方法参照《Molecular Cloning :A LaboratoryManual》，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,2001。表达质粒的构造将上述获得的L-缬氨酸产生菌L-缬氨酸生物合成途径的酶的基因与合适的棒杆菌或短杆菌表达载体相连，如pDXW-8(参阅
发明者侯小虎, 张伟国, 钱和 申请人:江南大学