专利名称：一种快速提取人参叶组织rna的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取RNA的方法。
背景技术：
从植物组织中提取质量高，完整性好的RNA是进行转录组分析、cDNA文库构建、 northern印迹分析，DDRT-PCR、cDNA末端快速扩增、RT-PCR等分子生物学研究领域的工作基础。针对不同的植物材料选择适合的方法至关重要。由于人参植物中含有大量的蛋白质、 糖、多酚以及其他次生代谢物质代谢产物，内源RNase活性较高，严重干扰了 RNA的提取，导致实验失败。以往大多数实验室都采用传统的CTAB法、SDS法提取植物的RNA，或者购买商业试剂盒提取RNA，这些方法操作步骤繁琐，耗时长，所用药品多，成本高。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有提取人参叶组织RNA的方法存在步骤繁琐、耗时长、所用药品多和成本高的问题，而提供一种快速提取人参叶组织RNA的方法。快速提取人参叶组织RNA的方法按以下步骤进行一、将200mg人参叶组织，洗净拭干后在液氮中研磨成粉末，然后加入到装有750 μ L提取缓冲液和75 μ L β -巯基乙醇的离心管中，再加入350 μ L Tris平衡酚和350 μ L氯仿，震荡5min后在13000r/min、4°C的条件下离心5min ；二、离心后取上清，加入350 μ L Tris平衡酚和350 μ L氯仿，震荡5min 后在13000r/min、4°C的条件下离心5min，离心后取上清，加入750 μ L的氯仿，震荡5min 后在13000r/min、4°C的条件下离心5min ；三、离心后取上清，加入等体积的异丙醇，混勻后于_20°C沉淀20min，然后在13000r/min、4°C的条件下离心15min，弃去上清液；四、采用体积浓度为75%、冰浴的乙醇ImL洗涤RNA沉淀一次，空气中晾干沉淀，即完成快速提取人参叶组织RNA ；其中步骤一中提取缓冲液2% (质量)十二烷基硫酸钠、4mol/L尿素、0. Imol/ LNaCl、0. 01mol/L EDTA (pH8. 0)和 0.05mol/L Tris-HCL (pH8. 0)；步骤一中 β-巯基乙醇的体积浓度为10%。本发明与传统的CTAB法等相比，提取效果比较好，时间短，容易操作。比商业试剂盒提取成本低。1、提取缓冲液中多种成分的加入可以增加对RNase活性的抑制。SDS不仅是蛋白质变性剂，同时也是RNase的抑制剂，高浓度的尿素也是RNase的抑制剂。2、在材料提取之前，预先在提取液中加入Tris-平衡酚、氯仿，更能有效的抑制 RNase的活性。同时Tris-平衡酚、氯仿震荡抽提，可以充分的变性RNase，通过离心除去。3、提取液中加入了 10%的β -巯基乙醇，高浓度的β -巯基乙醇用来抑制RNA酶的活性，也可以防止样品氧化，因为酚类化合物很容易被氧化形成以共价键连接的奎宁，更易于绑定核酸，这引起了对RNA不可逆转的破坏。β-巯基乙醇作为强还原剂可以防止多酚的氧化，可以打断多酚氧化酶的二硫键使之失活。
3
4、前3点能很好的解决了 RNAase污染的问题。保护RNA不受污染和降解。5、SDS是阴离子去污剂，可以解离核酸与蛋白质的结合，并且蛋白质与带正电荷的侧链结合，在高盐存在下形成SDS-蛋白质复合物而沉淀。6、传统的CTAB法需要65°C水浴，在SDS法中无65°C水浴，这样也避免了 CTAB法中由于高温而引起RNA降解和水中污染的机会。7、在所有离心的过程中都选择了高速离心(13000r/min)，高速离心，减少离心时
间。提取出来RNA质量也很高。8、在沉淀过程中，在冰箱-20°C内进行20min沉淀，比传统的室温沉淀、冰上沉淀效果好，比过夜沉淀的方法更减少时间，也减少了其他杂质也被沉淀的机会。可以防止RNA 在沉淀过程中不被降解。9、传统提取RNA的方法大约在150分钟左右，过夜沉淀的方法需要的时间更长。在本方法操作过程中，从提取到最后得到样品需要的时间在90-100分钟之内。节省了时间。10、本方法比商业试剂盒方法成本低，国外提取试剂盒提取50次/盒，大约要上千元成本，本方法配制提取50次的各种试剂用量需要500-600元的成本。
图1为具体实施方式
一中总RNA质量检测的琼脂糖凝胶电泳图；图2为具体实施方式
一中RT-PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式快速提取人参叶组织RNA的方法按以下步骤进行 一、将200mg人参叶组织，洗净拭干后在液氮中研磨成粉末，然后加入到装有750 μ L提取缓冲液和75 μ L β-巯基乙醇的离心管中，再加入350 μ L Tris平衡酚和350 μ L氯仿，震荡5min后在13000r/min、4°C的条件下离心5min ；二、离心后取上清，加入350 μ L Tris平衡酚和350 μ L氯仿，震荡5min后在13000r/min、4°C的条件下离心5min，离心后取上清，加入750 μ L的氯仿，震荡5min后在13000r/min、4°C的条件下离心5min ；三、离心后取上清， 加入等体积的异丙醇，混勻后于-20°C沉淀20min，然后在13000r/min、4°C的条件下离心 15min，弃去上清液；四、采用体积浓度为75%、冰浴的乙醇ImL洗涤RNA沉淀一次，空气中晾干沉淀，即完成快速提取人参叶组织RNA ；其中步骤一中提取缓冲液2% (质量)十二烷基硫酸钠、4mol/L尿素、0. Imol/ LNaCl、0. 01mol/L EDTA (pH8. 0)和 0.05mol/L Tris-HCL (pH8. 0)；步骤一中 β-巯基乙醇的体积浓度为10%。本实施方式步骤一中人参叶组织为鲜样。本实施方式中提取的人参叶组织RNA，加入40 μ L的DEPC即可保存备用。本实施方式中提取的人参叶组织RNA，进行RNA质量检测1、总RNA质量检测与分析1. 的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度法进行纯度检测；结果如图1所示，其中^S、18S条带清晰可见，28S与18S荧光亮度比接近2 1，说明RNA比较完整；取适量的总RNA经紫外分光光度计进行纯度测定，RNA的A26tZA28tl值为1. 98，证明RNA 质量好。2、RT-PCR 检测将提取的总RNA用RQl RNase-Free DNase消化DNA ；消除可能的DNA污染；根据clontech公司提供RT-PCR操作体系说明书进行；将总RNA使用反转录酶和SMART IV Oligonucleotide反转录成单链cDNA，单链cDNA通过LD-PCR扩增生成dscDNA ；所提供的引物序列SMART IV Oligonucleotide(IOuM) 5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGC CGGG-3，；CDSIII/3，PCR Primer(IOuM) :5，-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)3(^_#_3，( N = A，G，CorT ；N^1 = A, G, orC) ；5，PCRPrimer(IOuM) :5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，； PCR程序反应参数如下95°C预变性Imin ；95°C变性15s，68°C延伸6min，共23个循环；至 4°C结束反应。取5μ L反应产物进行1. 的琼脂糖电泳鉴定产物。结果如图2所示，经1. 1 %琼脂糖凝胶电泳检测，SDS法提取的RNA经过RT-PCR得到ds cDNA片段条带弥散分布大小在0. 2-3. 01Λ，进一步表明本实施方式提取的总RNA质量合格，降解量少，cDNA的长片段较多；说明能够用于进行下一步cDNA文库构建、转录组测序等分子生物学研究。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中离心管的规格为1. 5ml或2. Oml0其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中异丙醇在使用前要进行预冷，预冷温度为-20°C。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
权利要求
1.一种快速提取人参叶组织RNA的方法，其特征在于快速提取人参叶组织RNA的方法按以下步骤进行一、将200mg人参叶组织，洗净拭干后在液氮中研磨成粉末，然后加入到装有750 μ L提取缓冲液和75 μ Li3 -巯基乙醇的离心管中，再加入350 μ L Tris平衡酚和 350 μ L氯仿，震荡5min后在13000r/min、4°C的条件下离心5min ；二、离心后取上清，加入 350 μ L Tris平衡酚和350 μ L氯仿，震荡5min后在13000r/min、4°C的条件下离心5min，离心后取上清，加入750 μ L的氯仿，震荡5min后在13000r/min、4°C的条件下离心5min ；三、 离心后取上清，加入等体积的异丙醇，混勻后于_20°C沉淀20min，然后在13000r/min、4°C 的条件下离心15min，弃去上清液；四、采用体积浓度为75%、冰浴的乙醇ImL洗涤RNA沉淀一次，空气中晾干沉淀，即完成快速提取人参叶组织RNA ；其中步骤一中提取缓冲液2% (质量)十二烷基硫酸钠、4mol/L尿素、0. Imo 1/L NaCl, 0. 01mol/L EDTA和0. 05mol/L Tris-HCL ；步骤一中β-巯基乙醇的体积浓度为10%。
2.根据权利要求1所述的一种快速提取人参叶组织RNA的方法，其特征在于步骤一中离心管的规格为1. 5ml或2. Oml0
3.根据权利要求1所述的一种快速提取人参叶组织RNA的方法，其特征在于步骤三中异丙醇在使用前要进行预冷，预冷温度为-20°C。
全文摘要
一种快速提取人参叶组织RNA的方法，它涉及一种提取RNA的方法。它解决了现有提取人参叶组织RNA的方法存在步骤繁琐、耗时长、所用药品多和成本高的问题。方法一、将人参叶组织在液氮中研磨成粉末，加提取缓冲液、β-巯基乙醇、Tris平衡酚和氯仿，震荡后在离心；二、离心后取上清，加Tris平衡酚和氯仿，震荡后离心，离心后取上清，加氯仿，震荡后离心；三、离心后取上清，加异丙醇，沉淀后离心，弃去上清液；四、用乙醇洗涤RNA沉淀，空气中晾干沉淀后即完成。本发明与传统的CTAB法等相比，提取效果比较好，时间短，容易操作；比商业试剂盒提取成本低。
文档编号C12N15/10GK102181435SQ20111013860
公开日2011年9月14日 申请日期2011年5月26日 优先权日2011年5月26日
发明者杨成君 申请人:东北林业大学