专利名称：以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/登革嵌合病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/登革嵌合病毒及其应用。
背景技术：
登革病毒(Dengue virus, DENV)属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，该属还包括流行性乙型脑炎病毒(简称乙脑病毒)，也称日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus, JEV)、西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)、蝶传脑炎病毒(Tick-borne Encephalitis virus, TBEV)和黄热病毒(Yellow Fever virus, YFV)等，其中大多数病毒为重要的人畜共患病病原体，主要通过蚊、蜱等媒介传播。 登革病毒分为4个血清型，每个血清型病毒感染均可导致登革热(dengue fever,DF)、登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合征(dengue shocksyndrome, DSS)。全球有约30亿人受到登革病毒感染的威胁，每年大约有近I亿人感染登革热。其中登革出血热病例达50万，死亡约2万余人，对人类健康和公共卫生安全构成重要威胁。登革热与登革出血热的流行区起初主要分布于热带和亚热带地区，尤以东南亚最为严重。但是随着全球气候变暖和国际交往的日益频繁，近年来登革热发病范围已在全球逐渐扩大，爆发频率也不断增加。登革病毒是有包膜的单股正链RNA病毒，其基因组含有一个单一开放读码框，依次编码3种结构蛋白衣壳蛋白(capsid protein,C)、膜蛋白及其前体(membrane proteinand its precursor,M/prM)及包膜蛋白(envelope protein,E),和 7 种非结构蛋白(NS1、吧2&、吧213、吧3、吧4&、吧413和吧5)。登革病毒的抗原蛋白主要是包膜蛋白E、膜蛋白M和非结构蛋白NS1。其中，E蛋白具有多种B细胞和T细胞表位，能诱导产生血凝抑制抗体和中和抗体。PrM蛋白见于未成熟的病毒颗粒，可能在病毒颗粒成熟过程中作为分子伴侣来协助包膜E蛋白的正确折叠，在此过程中进一步经宿主细胞的蛋白酶切割后成为M蛋白。非结构蛋白NSl是一种可溶性补体蛋白，可诱导产生中和抗体。疫苗接种是预防病毒性疾病的最有效途径，但目前仍无安全有效的登革疫苗用于临床。登革疫苗研制主要面临以下挑战。第一，登革病毒感染导致登革出血热以及登革休克综合征等病症的具体致病机制尚不清楚，抗体依赖的感染增强作用(antibody-dependentenhancement,ADE)被认为在登革发病机制中起重要作用。该观点认为，当已被登革感染的机体再次感染不同血清型的登革病毒时，其体内的非中和或亚浓度中和抗体可与该异型病毒形成抗原抗体复合物，进而增强病毒对靶细胞的感染，最终导致病情加重。基于上述理论，登革疫苗要求能同时诱导针对登革病毒4个血清型的均衡的免疫应答，且应答水平需足够高。另一方面，无论是小鼠还是非人灵长类动物，其感染登革病毒后仅能出现与人感染后相似的免疫应答，但其发病特征与人感染后的病症相去甚远。因此，缺乏合适的动物模型使得登革疫苗的研制较为缓慢。然而，随着病毒学、分子生物学及相关学科技术的发展，登革疫苗的研究已经取得了很大进展。登革疫苗的研制始于20世纪二十年代，当时尝试采用登革热患者的灭活血清作为疫苗。由于此类疫苗免疫原性差，且需多次免疫，安全性亦未完全明确，因此难以应用于临床。近些年来，一些新型的登革疫苗，如重组亚单位疫苗、DNA疫苗和复制子疫苗进展迅速。登革病毒prM-E和NSl蛋白是重组亚单位疫苗和DNA疫苗的重要靶标。大量的研究显示，重组亚单位疫苗和DNA疫苗均能诱导小鼠和猴体产生有效的免疫应答，并能提供部分或完全的免疫保护。美国夏威夷生物科技公司利用果蝇表达系统开发了一种重组亚单位疫苗，在小鼠和猴模型中均可诱导高水平的免疫应答和完全的免疫保护。与上述疫苗类型相比，减毒活疫苗因其具有完整的病毒感染过程，进而能全面诱发机体产生体液和细胞免疫应答而更具优势。起初通过传代法制备减毒活疫苗，但该方法效率低，减毒效果差，获得的减毒株也易发生回复突变；特别是针对登革病毒4种血清型的免疫效力并不均衡，因此该项尝试业已终止。上世纪八十年代以来，随着反向遗传学技术的兴起，基因突变和嵌合减毒技术逐渐取代了传统减毒方法。目前在登革病毒结构和非结构蛋白中已发现多个可能的毒力相关位点，对其进行定点诱变后获得了诸 多减毒疫苗候选株。其中较为成功的是美国国立卫生研究院(NIH)NIAID传染病实验室构建的登革4型病毒3'-非编码区(UTR)缺失30个核苷酸的突变株，其在小鼠模型和猴体中均产生减毒，并可诱导产生中和抗体及免疫保护。黄病毒属成员具有相似的基因结构和功能相近的病毒蛋白，因此可以通过反向遗传学技术将不同黄病毒进行相互嵌合，最终可获得具有感染性的嵌合黄病毒颗粒。由于嵌合基因间存在功能的不协调，进而会影响病毒增殖的各个环节而使其毒力减弱，因此基因嵌合也是构建减毒株的有效途径。当嵌合区段为PrM-E而骨架为减毒株时，即可获得针对外源病毒的减毒疫苗候选株。乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2是由野毒株SA14通过在细胞和动物中不断传代和多轮空斑纯化最终获得。与野毒株SA14相比，SA14-14-2的毒力明显减弱，对成鼠和猴等动物的致病性几乎完全丧失。使用该减毒株研制的乙脑减毒活疫苗在我国使用人群超过3亿，未见因疫苗接种而引发疾病的报告，安全性可靠。同时，SA14-14-2遗传特征稳定，基因组序列明确，与登革病毒基因组具有十分类似的结构特征，非常适合作为基因骨架用于嵌合疫苗的构建。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA分子。本发明所提供的DNA分子，是将乙脑病毒的基因组RNA对应的cDNA中的蛋白质A的编码基因替换为蛋白质B的编码基因得到的重组DNA ；所述蛋白质A为由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述蛋白质B为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。所述蛋白质A的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因I)序列表中序列3所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)所不的DNA分子杂交且编码所述蛋白质A的DNA分子；3)与I)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白质A的DNA分子。所述蛋白质B的编码基因为如下I)-3)中任一所述的基因
I)序列表中序列4所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)所不的DNA分子杂交且编码所述蛋白质B的DNA分子；3)与I)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白质B的DNA分子。所述乙脑病毒为乙脑病毒SA14-14-2减毒株；所述重组病毒的基因组RNA对应的cDNA序列如序列表中序列6所示。所述重组DNA的核苷酸序列如序列表中序列5所示。含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于 本发明的保护范围。所述重组载体为是在pANCR-Ll载体的多克隆位点间插入所述DNA分子得到的重组载体；所述pANCR-Ll载体的构建方法，包括以下步骤I)以克隆质粒pSP64为模板，扩增得到第2757位-2982位的phage sp6区的DNA片段；2)以克隆质粒pACYC177为模板，扩增得到第I位-2335位的DNA片段；3)将步骤2)得到的DNA片段和步骤I)中得到的DNA片段顺次连接后，即得到pANCR-Ll 载体。所述重组病毒为将所述重组载体导入离体的哺乳动物细胞中得到的病毒。本发明的另一个目的是提供一种重组病毒。本发明所提供的重组病毒，其基因组RNA对应的cDNA的核苷酸序列如序列表中序列5所示。本发明的另一个目的是提供一种疫苗。本发明所提供的疫苗，其活性成分为所述重组病毒。所述重组病毒在制备疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。所述疫苗为预防登革病毒感染的疫苗。本发明提供的乙脑/登革2型嵌合病毒具有如下多方面优点(I)所述乙脑/登革2型嵌合病毒是充分减毒的，因此安全性很高；(2)所述乙脑/登革2型嵌合病毒减毒特征稳定，回复为野生型病毒的可能性极低；(3)所述乙脑/登革2型嵌合病毒只在细胞质中复制(即RNA病毒基因组的复制、病毒的组装、成熟释放等过程均在细胞质中进行)，其携带的病毒基因组无整合到宿主细胞基因组中的危险；(4)所述乙脑/登革2型嵌合病毒能诱导产生针对所述乙脑/登革2型嵌合病毒包膜蛋白所来源的黄病毒的良好的免疫应答；
(5)所述乙脑/登革2型嵌合病毒能够在动物模型中保护动物免受致死剂量的所述外源黄病毒的攻击。本发明所提供的乙脑/登革2型嵌合病毒作为登革疫苗用于预防登革病毒感染也具有良好的应用前景。
图I为乙脑/登革2型嵌合病毒全长cDNA克隆的构建示意图。图2为从乙脑/登革2型嵌合病毒RNA中扩增乙脑和登革2型病毒特异序列的RT-PCR 结果。图3为检测乙脑/登革2型嵌合病毒表达乙脑和登革病毒特异蛋白的IFA结果。。
图4为乙脑/登革2型嵌合病毒RNA的分段RT-PCR扩增结果。图5为乙脑/登革2型嵌合病毒的空斑形态和直径大小。图6为乙脑/登革2型嵌合病毒在不同温度下的生长特征。图7为乙脑/登革2型嵌合病毒(CJD2)在不同细胞系中的增殖特征。图8为乙脑/登革2型嵌合病毒(CJD2)免疫血清对乳鼠的保护试验结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例I、构建以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/登革嵌合病毒该实施例以乙脑病毒SA14-14-2减毒株为基因骨架构建乙脑/登革嵌合病毒，其中乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2的基因组RNA对应的cDNA序列如序列表中序列6所示，自5'端第I位-95位为5' UTR ;第96-476位为衣壳蛋白C的编码基因(C);第477-2468位为缺失了 E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prM-E蛋白的编码基因(prM-E A3);第2469-2477位为E蛋白羧基末端的3个氨基酸残基的编码基因(E3);第2478位-10394位为非结构蛋白NS的编码基因(NS);第10395-10977位为3' UTR(图I)。一、乙脑SA14-14-2减毒株基因组5'和3'半分子的构建与鉴定乙脑SA14-14-2减毒株病毒基因组5'和3'半分子的构建与鉴定分为如下几个步骤I、乙脑SA14-14-2减毒株基因组cDNA的制备按照RNeasy试剂盒(Qiagen公司产品)说明提取乙脑SA14-14-2减毒株(购自成都生物制品研究所)的基因组RNA(即JEV-RNA)。提取步骤如下将210 U I 病毒悬液与 700 U I RLT (RNeasy Lysis Buffer)和 7 U I P -疏基乙醇(3 -mercaptoethanol)的混合液震荡混勻，加490 U I无水乙醇后剧烈混勻，得到裂解液，将裂解液加入吸附柱，12000rpm离心15s ;700 U I Rffl (RNeasy wash buffer)洗柱一次，12000rpm离心15s ；500 u I RPE (RPE是RNeasy试剂盒中的洗涤液)洗柱2次，IOOOOrpm30s ;空柱 IOOOOrpm 离心 Imin0 加 50 U I 无 RNase 的水，静置 2min, 12000rpm 离心 Imin0加 2 ill RNase inhibitor。混匀后置 _80°C 待用。以测序引物R13为反转录引物进行cDNA的合成。引物R13 :AGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTACA。反转录反应的组分与反应条件如下
__体积(M)
JEV-RNA15R13 (IOnM)1.25
dNTP (2.5 mM each)10
水(RNasefree)6.25将上述反应组分混合均匀，置65°C 5min,冰浴2min。补加如下组分
权利要求
1.一种DNA分子，是将乙脑病毒的基因组RNA对应的cDNA中的蛋白质A的编码基因替换为蛋白质B的编码基因得到的重组DNA ； 所述蛋白质A为由序列表中序列I所不的氣基酸序列组成的蛋白质； 所述蛋白质B为由序列表中序列2所不的氣基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求I所述的DNA分子，其特征在于所述蛋白质A的编码基因为如下I)-3)中任一所述的基因 1)序列表中序列3所示的DNA分子； 2)在严格条件下与I)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白质A的DNA分子； 3)与I)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白质A的DNA分子。
3.根据权利要求I或2所述的DNA分子，其特征在于所述蛋白质B的编码基因为如下I)-3)中任一所述的基因 1)序列表中序列4所示的DNA分子； 2)在严格条件下与I)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白质B的DNA分子； 3)与I)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白质B的DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的DNA分子，其特征在于 所述乙脑病毒的基因组RNA对应的cDNA序列如序列表中序列6所示。
5.根据权利要求1-4中任一所述的DNA分子，其特征在于 所述重组DNA的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
6.含有权利要求1-5中任一所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
7.一种重组病毒，其基因组RNA对应的cDNA的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
8.一种疫苗，其活性成分为权利要求7所述的重组病毒。
9.权利要求7所述的重组病毒在制备疫苗中的应用。
10.根据权利要求8所述的疫苗或权利要求9所述的应用，其特征在于所述疫苗为预防登革病毒感染的疫苗。
全文摘要
本发明公开了以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/登革嵌合病毒及其应用。本发明提供了一个DNA分子，是将乙脑病毒的基因组RNA对应的cDNA中的蛋白质A的编码基因替换为蛋白质B的编码基因得到的重组DNA；所述蛋白质A为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述蛋白质B为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明所提供的以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/登革嵌合病毒为含有所述DNA分子的重组病毒。本发明所提供的乙脑/登革2型嵌合病毒作为登革疫苗用于预防登革病毒感染也具有良好的应用前景。
文档编号C12N1/15GK102796749SQ20111014022
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者秦成峰, 李玉华, 李晓峰, 于学东, 杨会强, 秦鄂德 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所, 成都生物制品研究所