一种含有loxP-kan^r-loxP片段的重组质粒载体p18-kan^±的构建方法

专利名称：一种含有loxP-kan^r-loxP片段的重组质粒载体p18-kan^±的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种重组质粒载体的构建方法。
背景技术：
在进行真核生物基因敲除、替换等实验过程中，往往会用到karf基因作为筛选标记，应用IoxP位点作为去除抗性标记基因工具位点。在实际应用中，这一功能片段通常是应用融合PCR等互补PCR手段与目的基因重组连接的。但是，在实际操作中往往会因为PCR 错配及引物特异性等不足，使得连接失败或产物基因失活，最终导致实验失败。

发明内容
本发明的目的在于提供一种含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kaf 的构建方法。含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kaf的构建方法按以下步骤进行一、采用PCR技术从pUG6质粒中获得loxP-karf-loxP片段；二、胶回收1.6Kb的 loxP-kanr-loxP片段，然后以2. 7Kb的pMD18_T载体作为骨架，通过T-A末端连接，获得连接产物；三、连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆，接种于氨苄抗性的LB液体培养基中震荡培养后采用碱裂解法提取重组质粒，即完成含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kar^的构建。本发明利用pMDIS-T载体作为模板，向其多克隆位点上引入loxP-karf-loxP基因片段，同时构建出一对连接方向相反的重组质粒，该质粒loxP-karf-loxP位点两端具有多个常用酶切位点，外源基因便于与loxP-karf-ΙοχΡ片段连接，为真核生物基因敲除、替换提供了新的操作途径。本发明PCR获得loxP-karf-loxP基因片段，将其连入到质粒载体pMD18_T多克隆位点中，获得重组质粒，经转化、蓝白筛选后获得含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体 plS-kaf，经PCR及酶切鉴定，结果与预期结果相符，测序结果显示loxP-karf-loxP片段以两个不同方向成功连入质粒中，含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kar^构建成功。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kaf的构建方法按以下步骤进行一、采用PCR技术从pUG6质粒中获得 loxP-kanr-loxP 片段；二、胶回收 1. 6Kb 的 loxP-karf-loxP 片段，然后以 2. 7Kb 的 pMD18_T 载体作为骨架，通过T-A末端连接，获得连接产物；三、连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆，接种于氨苄抗性的LB液体培养基中震荡培养后采用碱裂解法提取重组质粒，即完成含有loxP-karf-loxP 片段的重组质粒载体Pl8-kan±的构建。本实施方式中pUG6质粒、大肠杆菌DH5 α感受态细胞、pMD18_T载体均为购买得到(NewEngland Biolabs Inc. ,MA,USA)；本实施方式在具体操作中涉及使用的各种反应试剂或试剂盒均为购买得到(宝生物工程有限公司)，且使用均按说明书操作。本实施方式步骤二中连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养的具体过程将大肠杆菌DH5ci感受态细胞从-70°C取出，在冰上融化后加入5μ 1连接产物，冰中放置30分钟，然后42°C热休克90秒，再冰浴 2-3分钟，加入37°C预热的S. 0. C培养基900 μ 1，37°C振荡培养1小时(160-200rpm)，然后 4000r/min离心3分钟，弃上清，保留200 μ 1培养基，将沉淀重新混勻后，涂布于氨苄抗性的 LB固体培养基中，37°C培养过夜。本实施方式步骤三中采用碱裂解法提取重组质粒的具体过程随机挑取生长于氨苄抗性的LB固体培养基上的数个白色菌落分别接种于氨苄抗性的LB液体培养基中，37°C 振荡培养过夜；取1. 5ml培养液于微量离心管中，10, OOOg离心30秒，弃上清，将沉淀重悬于100 μ 1冰预冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mMTris_HCI，IOmM EDTA, pH8. 0)中，剧烈振荡以分散沉淀；再加入200 μ 1新配制的溶液II (0. 2Μ NaOH, 1 % SDS)，颠倒混勻几次后置冰浴5分钟，然后加入150 μ 1溶液III (5Μ乙酸钾60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml配制而成)， 颠倒混勻数次，冰浴10分钟后于4°C 12000r/min离心10分钟，取上清加入等体积的酚、氯仿各抽提一次，取上层水相加入1倍体积的异丙醇，-20°C沉淀10分钟；4°C 12000r/min离心15分钟，弃上清，沉淀用70% (体积)乙醇洗涤1次后真空干燥；沉淀用适量含RNA酶 (20 μ g/ml)的 TE(10mM Tris-HCI, ImM EDTA, ρΗ8· 0)(不含 DNA 酶)溶解，37°C作用 30 分钟。本实施方式步骤三中提取的重组质粒进行PCR鉴定PCR的反应体系为18 μ L反应体系，由下列成分组成
成分
模板 DNA pUG6 20pmol/L 引物 1 5'- GTACGCTGCAGGTCGAC -3' 20pmol/L 引物 2 5'- GCCACTAGTGGATCTGATATC -3 10 X扩增缓冲液 2.5mM mmol/L dNTP 混合液 5υ/μ1 U Taq DNA 聚合酶 ddH20
4
用量
Ιμ Ιμ
Ιμ
2.5μL Ιμ 0.5|iL ΙΙμ
PCR 条件为94°C预变性 5min，94°C变性 10s，57°C退火 15s，72°C延伸 2min，共 30 个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。重组质粒进行单酶切鉴定PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定后，进行Hind III单酶切，酶切体系如下
重组质粒2μ1
HindlllΙμ
IOXMBuffer2μ1
ddH20补至终体积为15μ1重组质粒进行序列测定测序工作交由上海美吉生物医药科技有限公司完成。含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体pl8-kan±中kan抗性及两端酶切位点测序结果如下可见同原始序列中沈 1619bp部分相同(原始序列参见pUG6质粒的全长编码序列，见SEQ ID No. 1)，没有变化；测序结果显示loxP-karf-loxP片段以两个不同方向
成功连入质粒中，含有loxP-karf- οχΡ片段的jI组质粒载体Pl8-kan±构建成功。
GTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTA
TTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACAT
GGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGA
CTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTT
TGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGG
AAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATAT
AAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCT
AGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACTCAC
GTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCT
CGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCG
CCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATG
GTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGT
ACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTA
TTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGC
CGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTC
GCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG
CGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCA
CCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGG
AAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTT
GCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAA
AAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAG
TTTTTCTAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTAT
AGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTT
TTCGCCTCGA CATCATCTGC CCAGATGCGA AGTTAAGTGC GCAGAAAGTA ATATCATGCGTCAATCGTAT GTGAATGCTG GTCGCTATAC TGCTGTCGAT TCGATACTAA CGCCGCCATCCAGTGTCGAA AACGAGCTCT CGAGAACCCT TAATATAACT TCGTATAATG TATGCTATACGAAGTTATTA GGTGATATCA GATCCACTAG TGGC。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中PCR的反应体系为18 μ L反应体系，由下列成分组成
成分
用量 Ιμ Ιμ
模板 DNA pUG6 20pmol/L 引物 1 5'- GTACGCTGCAGGTCGAC -3'
20pmol/L 引物 2l|iL
5'- GCCACTAGTGGATCTGATATC -3'
10 X扩增缓冲液2.5|iL
2.5mM mmol/L dNTP 混合液l|iL
5υ/μ1 U rTaq DNA 聚合酶0.5|iL
ddH20ΙΙμ PCR 条件为94°C预变性 5min，94°C变性 10s，57°C退火 15s，72°C延伸 2min，共 30 个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
下
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中连接的体系如
成分用量
pMD18-T 载体l|iL
loxP-kanr"loxP 片段4|iL
Solutionl5 μι连接条件为16°C连接池。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。本实施方式中Solutionl是商品化产品，购买自TAKARA公司，是一种连接酶及缓冲液的混合物，购买试剂盒中标配试剂，按照说明书操作使用。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中氨苄抗性的 LB固体培养基每IOOOmL由100 μ g的氨苄青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的琼脂、IOg的NaCl和余量的水组成，pH值为6. 0 8. 0。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中氨苄抗性的 LB液体培养基每IOOOmL由100 μ g的氨苄青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、IOg的NaCl和余量的水组成，pH值为6. 0 8. 0。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
权利要求
1.一种含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体pl8-kan±的构建方法，其特征在于含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体pl8-kan±的构建方法按以下步骤进行一、采用 PCR技术从pUG6质粒中获得loxP-kanr-loxP片段；二、胶回收1. 6Kb的loxP-kanr-loxP片段，然后以2. 7Kb WpMDlS-T载体作为骨架，通过T-A末端连接，获得连接产物；三、连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，然后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆，接种于氨苄抗性的LB液体培养基中震荡培养后采用碱裂解法提取重组质粒， 即完成含有loxP-kar^-loxP片段的重组质粒载体plS-kaf的构建。
2.根据权利要求1所述的一种含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kaf的构建方法，其特征在于步骤一中PCR的反应体系为18 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量模板 DNA pUG6Ιμ 20pmol/L 引物 1l|iL 5'- GTACGCTGCAGGTCGAC -3'20pmol/L 引物 2l|iL 5'- GCCACTAGTGGATCTGATATC -3'10 X扩增缓冲液2.5|iL2.5mM mmol/L dNTP 混合液1 μ 5υ/μ1 Taq DNA 聚合酶0.5|iLddH20ΙΙμ PCR条件为94°C预变性5min，94°C变性10s，57°C退火15s，72°C延伸2min，共30个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。
3.根据权利要求1所述的一种含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kaf的构建方法，其特征在于步骤二中连接的体系如下成分用量pMD18-T 载体l|iLloxP-kanr"loxP 片段4|iLSolutionl5 μι连接条件为16°C连接池。
4.根据权利要求1所述的一种含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体plS-kaf的构建方法，其特征在于步骤三中氨苄抗性的LB固体培养基每IOOOmL由100 μ g的氨苄青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的琼脂、IOg的NaCl和余量的水组成，pH值为6. 0 8. 0。
5.根据权利要求1所述的一种含有loxP-karf-loxP片段的重组质粒载体pl8-kan±的构建方法，其特征在于步骤三中氨苄抗性的LB液体培养基每IOOOmL由100 μ g的氨苄青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、IOg的NaCl和余量的水组成，pH值为6. 0 8. 0。
全文摘要
一种含有loxP-kanr-loxP片段的重组质粒载体p18-kan±的构建方法，它涉及一种重组质粒载体的构建方法。方法1、从pUG6质粒中获得loxP-kanr-loxP片段；2、以pMD18-T载体作为骨架，通过T-A末端连接获得连接产物；3、连接产物转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒即完成。本发明利用pMD18-T载体作为模板，向其多克隆位点上引入loxP-kanr-loxP基因片段，同时构建出一对连接方向相反的重组质粒，质粒loxP-kanr-loxP位点两端具有多个常用酶切位点，外源基因便于与loxP-kanr-loxP片段连接，为真核生物基因敲除、替换提供了新的操作途径。
文档编号C12N15/64GK102250937SQ20111014284
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者原韬, 张晓彦, 沙长青, 谷军, 赵晓龙, 陈兵 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所