专利名称：模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体及其皮肤替代物的制作方法
技术领域：
本发明涉及组织工程和医学创面修复技术领域，是一种可在体外模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体及其皮肤替代物。
背景技术：
表皮干细胞的培养、扩增一直是皮肤组织工程研究中的热点和难点。目前主要利用表皮干细胞对基底膜的显著黏附特性进行分离、纯化(Barthel R,Aberdam D. Epidermal stem cells. J Eur Acad Dermatol Venereol2005 ； 19 (4) :405-13.)，采用二维平面培养的方式进行体外培养与扩增。传代扩增时为了保证干细胞的单一，需要首先将基底膜的主要成份之一 IV型胶原平铺于培养皿，但难以避免细胞经多次消化、传代培养后克隆形成率明显下降、逐渐分化、增殖活性降低等缺点，而且由于表皮干细胞固有的慢增殖特性，传统的培养方式难以在较短时间内扩增足量的细胞，无法及时满足应用的需要。微载体培养是一种大规模扩增贴壁依赖型细胞的技术，提供了细胞单层培养时不具备的三维立体空间，模拟了细胞在体内的生长环境，不仅可以大量扩增细胞，而且有利于维持细胞表型、防止分化，现已广泛应用于生物制药领域。目前研制的微载体多以生物材料人工合成，缺乏基底膜结构，不利于表皮干细胞的粘附、增殖。尽管有人采用表面改良或修饰等仿生技术处理，但仍难以模拟表皮干细胞生长的体内niche微环境，不利于维持其干细胞特性。研究表明，人羊膜是理想的细胞培养扩增载体(Niknejad H，Peirovi H，Jorjani M, et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. Eur Cell Mater 2008 ；29 (15) :88-99.)，具有天然的人体最厚的基底膜， 其基本结构与皮肤、角膜基底膜相似，此外基质中含有丰富的生长因子，如NGF、HGF、KGF、 bFGF、TGF- β 1、EGF 等(Koizumi NJ, Inatomi TJ, Sotozono CJ, et al. Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane. Curr Eye Res 2000 ；20 173-7.)，可以在体外模拟干细胞生长的niche微环境(Grueterich M, Espana EM，Tseng SC.Ex vivo expansion of limbal epithelial stem cells :amniotic membrane serving as a stem cell niche. Surv Ophthalmol 2003 ；48 (6) :631-46.)，因此羊膜被用于角膜缘干细胞、间充质干细胞的扩增和移植(Shortt AJiSecker GAiLomas RJ, et al. The effect of amniotic membrane preparation method on its ability to serve as a substrate for the ex-vivo expansion of limbal epithelial cells. Biomaterials 2009 ；30 (6) 1056-65. Liang HS, Liang P，Xu Y，et al. Denuded human amniotic membrane seeding bone marrow stromal cells as an effective compo site matrix stimulates axonal outgrowth of rat neural cortical cells in vitro. Acta Neurochir(Wien)2009 ； 151(9) :1113-20.)。但至今未见羊膜被制备成模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体以及用其构建表皮干细胞皮肤替代物的报道。
发明内容
本发明提供一种可在体外模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体及用其构建的表皮干细胞皮肤替代物。本发明羊膜微载体为具有完整的基底膜结构和生物学活性的三维立体微粒羊膜， 以其作为一种天然的新型微载体，结合旋转培养系统，可为表皮干细胞的体外培养扩增提供近似体内的干细胞生长niche微环境，不仅能够短时间迅速扩增表皮干细胞，维持表皮干细胞增殖活性，保持其干细胞特性，而且可直接将其作为真皮支架构建皮肤替代物。本发明以医疗废弃胎盘中羊膜作为基质，采用反复冻融方法裂解羊膜细胞，辅助 DNA酶去除核酸，进一步通过冷冻裂解技术制备具有三维立体结构的羊膜微载体，其保存了完整的基底膜结构和基质中生物活性物质，可以为表皮干细胞提供近似体内生理的niche 微环境。本发明羊膜微载体的构建方法如下1、羊膜的获取按常规取废弃的健康新鲜胎盘组织，在无菌条件下剥离羊膜，钝性分离绒毛膜， 经含 100U/ml 青霉素、100μ g/ml 链霉素、0. 25 μ g/ml 两性霉素的 phosphate buffered saline (PBS)浸泡冲洗3 X 15min,将羊膜切割成3 X 2cm大小的小片，放入冷冻管中，加入含 10% DMSO的PBS，将冷冻管置_80°C冰箱保存备用；2、羊膜去细胞化处理取出上述冷冻管，置25 °C水浴充分解冻10分钟，吸出羊膜中的PBS，再将冷冻管放置于液氮中冷冻，静置30min后取出，于25°C水浴充分解冻10分钟，再次置于液氮中冷冻， 如此反复冻融3次，然后将羊膜孵育在lmg/mlDNAase中酶解，37°C条件下孵育3小时伴轻微震荡，室温下离心2000rpmXaiiin，去除上清液，按常规用PBS充分冲洗羊膜后冻干，成片状羊膜；3、制备羊膜微载体片状羊膜通过冷冻裂解方法制备成羊膜微载体，方法如下室温条件下，将上述制备的片状羊膜迅速置于液氮中，借助其自然产生的微裂缝，通过均质化冷冻裂解片状羊膜成微粒，以避免破坏羊膜组织微结构，然后在真空密闭条件下冷冻干燥，将羊膜微粒依次通过32目、80目金属筛网过滤，获得200-500μπι的羊膜微载体。用本发明羊膜微载体构建表皮干细胞皮肤替代物，方法如下1)培养、扩增表皮干细胞采用常规“酶消化+IV型胶原快速粘附”方法分离人皮肤表皮干细胞(详见Kim DS, Cho HJ, Choi HR, Kwon SB, Park KC. Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents. Cell Mol Life Sci 2004 ； 61(21) :2774-81.)。取包皮术后皮肤，按常规用0. 25% Dispase 4°C消化，分离表皮层，用0. 25%胰蛋白酶37°C消化20-30分钟，金属筛网过滤，离心收集细胞，将细胞接种于预先铺有IV型胶原的培养皿中，贴壁20min后弃上清，加入无血清培养基(Keratinocyte serum free medium, K-SFM，Gibco下同)，隔日换液，当细胞达70% -80%融合时用胰酶消化制备浓度为5X IO5 个/ml的表皮干细胞悬液备用；
2)构建表皮干细胞皮肤替代物取上述表皮干细胞悬液IOml与上述制备的羊膜微载体IOOmg注入容量为IOml的旋转培养系统(RCCS)，设定旋转速度22rpm，隔日用无血清培养基K-SFM半量换液，当细胞生长达70% -80%融合时，加入新的羊膜微载体，通过羊膜微粒之间的互相接触碰撞继续扩增表皮干细胞，培养2-3周后形成含表皮干细胞的皮肤替代物。本发明也可用角质细胞或成纤维细胞作为种子细胞代替所用的表皮干细胞构建皮肤替代物。本发明羊膜微载体的优点是羊膜微载体大小为200-500 μ m，具有三维立体结构，其不仅具备一般微载体的特性，如具有较大的比表面积，为细胞增殖提供三维培养空间，可以快速扩增细胞，而且保留了基底膜结构，具有较为完整的IV型胶原、层粘连蛋白， 同时含有NGF、HGF、KGF、bFGF、TGF-β 1、EGF等生长因子，为表皮干细胞的体外培养扩增提供了近似体内生理状态的niche微环境，可在保持干细胞特性的同时快速扩增表皮干细胞；此外羊膜微载体免疫源性低，生物相容性好，可直接作为真皮支架负载表皮干细胞移植修复创面。本发明羊膜微载体的双重功能改善了目前皮肤替代物构建中先扩增足量细胞， 再接种真皮支架后二次培养形成皮肤替代物的构建模式。本发明利用羊膜微载体结合旋转培养系统一步完成表皮干细胞的大量扩增与皮肤替代物的快速构建，不仅缩短了体外培养构建时间，而且避免了常规方法中反复消化对细胞造成的损伤，有利于维持细胞增殖活性， 同时提高了皮肤替代物从实验室构建到临床转化应用的效率。体外表皮干细胞扩增实验表明，本发明羊膜微载体可以迅速扩增表皮干细胞， 培养7、14天时，相对增殖活性分别为3沈士观％、5 3 5 士 4 7 %，明显高于常规的培养方法 032士21 %，307士32%，P < 0.05)，同时可有效防止细胞分化、维持其干细胞特性。裸鼠全层皮肤缺损创面移植实验表明，本发明负载表皮干细胞的皮肤替代物在裸鼠创面愈合质量方面远优于不负载表皮干细胞的单纯的羊膜微载体或空白对照，创面愈合后不仅外观平整、柔软，收缩程度轻，而且新生表皮层明显增厚，伴有乳突样结构形成，同时新生真皮层胶原纤维排列规则、有序。
图1为采用本发明微载体mAM扩增表皮干细胞的情况，其中A和C为相差显微镜下观察，B和D为Hoechst染色后荧光镜下观察。图2为采用本发明微载体mAM与常规培养皿培养扩增表皮干细胞的细胞相对增殖活性比较。图3为裸鼠全层皮肤缺损移植ESC-mAM、mAM及空白对照组的创面愈合比较图。图4为裸鼠全层皮肤缺损移植术后4周的病理切片图，A D依次为正常裸鼠皮肤、ESC-mAM移植组、空白对照组及mAM移植组的HE染色。
具体实施例方式现结合附图和实施例，对本发明作进一步描述。实施例1.制备本发明羊膜微载体mAM1、羊膜的获取
按常规取医学上废弃的健康新鲜胎盘组织，在无菌条件下剥离羊膜，钝性分离绒毛膜，经含100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、0. 25 μ g/ml两性霉素的phosphate buffered saline (PBS)浸泡冲洗3 X 15min,将羊膜切割成3 X 2cm大小的小片，放入冷冻管中，加入含10% DMSO的PBS，将冷冻管置_80°C冰箱保存备用；2、羊膜去细胞化处理取出上述冷冻管，置25°C水浴充分解冻10分钟，吸出羊膜中的PBS，再将冷冻管放置于液氮中冷冻，静置30min后取出，于25°C水浴充分解冻10分钟，再次置于液氮中冷冻， 如此反复冻融3次，然后将羊膜孵育在lmg/mlDNAase中酶解，37°C条件下孵育3小时伴轻微震荡，室温下离心2000rpmXaiiin，去除上清液，按常规用PBS充分冲洗羊膜后冻干，成片状羊膜；3、制备羊膜微载体mAM片状羊膜通过冷冻裂解方法制备成羊膜微粒，具体如下室温条件下，将上述制备的片状羊膜迅速置于液氮中，借助其自然产生的微裂缝，通过均质化冷冻裂解片状羊膜成微粒，以避免破坏羊膜组织微结构，然后在真空密闭条件下冷冻干燥，将羊膜微粒依次通过 32目、80目金属筛网过滤，获得200-500 μ m的羊膜微载体mAM ；实施例2.构建表皮干细胞皮肤替代物ESC-mAM1)培养、扩增表皮干细胞取包皮术后皮肤，按常规用0.25% Dispase 4°C消化，分离表皮层，用0. 25%胰蛋白酶37°C消化20-30分钟，金属筛网过滤，离心收集细胞，将细胞接种于预先铺有IV 型胶原的培养皿中，贴壁20min后弃上清，加入无血清培养基K-SFM，隔日换液，当细胞达 70% -80%融合时用胰酶消化制备浓度为5 X IO5个/ml的表皮干细胞悬液备用；2)采用mAM扩增表皮干细胞并构建成皮肤替代物ESC-mAM取上述表皮干细胞悬液IOml与实施例1制备的羊膜微载体mAM IOOmg注入容量为IOml的旋转培养系统，设定旋转速度22rpm，隔日用无血清培养基K-SFM半量换液，当细胞生长达70% -80%融合时，加入新的羊膜微载体mAM，通过羊膜微粒之间的互相接触碰撞继续扩增表皮干细胞，体外培养2-3周后形成含表皮干细胞的皮肤替代物ESC-mAM。结果见附图。由图1可见，第3天时，ESC-mAM中的表皮干细胞黏附于mAM呈立体生长(图I-A和B)，第7天时细胞克隆明显增多，密布于mAM表面(图I-C和D)。图2进一步比较了采用本发明微载体mAM与常规培养皿培养扩增表皮干细胞的细胞相对增殖活性比较。由图2可见，第3天开始，本发明ESC-mAM中mAM培养的细胞增殖活性高于培养皿中培养(P < 0. 05)，培养至7、14天时，相对增殖活性分别为3 士观％、535士47%，明显高于常规的培养皿培养方法032士21%，307士32%，P < 0. 05)。动物实验取6-8周裸鼠12只(由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供)，雌雄不限，按常规用戊巴比妥钠腹腔麻醉，酒精消毒。于每只裸鼠背部两侧分别制作直径为1. 2cm的圆形全层皮肤缺损创面，将M个创面随机分为ESC-mAM组、mAM组及空白对照组。ESC-mAM 组在移植前用CM-Dil (Invitrogen，USA)染色标记表皮干细胞，标记方法详见CM-Dil使用说明书，随后分别将ESC-mAM、mAM等量均勻滴涂在创面上，空白对照组创面滴涂等量PBS， 再覆盖凡士林纱布，用4-0号线将凡士林纱布间断缝合固定于创周皮肤。术后定期观察拍照，通过图像分析软件比较创面愈合率，创面愈合率为非上皮化的表面积占总创面面积的比例，并定期取材行组织学观察。结果发现，移植后2周(见图幻，ESC-mAM组新生表皮形成，较薄，呈半透明状， 创面愈合率为97. 6士2. 1 %，而mAM组和空白对照组创面明显收缩，且仍可见残存创面，愈合率分别为 93. 4士4.3 %，91. 2士4.9%，明显低于 ESC-MAi^i (ρ < 0.01)；移植后 3 周， ESC-MAM组新生表皮增厚，创面基本愈合，外观平整、柔软，收缩程度轻，而mAM组和空白对照组创面收缩明显。移植后4周行切片HE染色(见图4)，ESC-mAM、mAM组愈合表皮下羊膜微载体充填真皮基质，表皮细胞形成6-8层，空白对照组仅3-4层，此外ESC-mAM组伴有表皮乳突样结构形成，类似正常皮肤，而mAM组和空白对照组表皮细胞基底处平整未见乳突样结构形成。实验结果表明，本发明羊膜微载体具有完整的基底膜结构和生物学活性物质，可为表皮干细胞的体外培养扩增提供近似体内的干细胞生长niche微环境，因此不仅能够短时间迅速扩增表皮干细胞，维持表皮干细胞增殖活性，而且可直接作为真皮支架构建皮肤替代物移植修复全层皮肤缺损。
权利要求
1.模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体，构建方法如下1)羊膜的获取按常规取废弃健康新鲜的胎盘组织，在无菌条件下剥离羊膜，钝性分离绒毛膜，经含 100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、0. 25 μ g/ml两性霉素的PBS浸泡冲洗3X 15min，将羊膜切割成3 X 2cm大小的小片，放入冷冻管中，加入含10% DMSO的PBS，将冷冻管置_80°C冰箱保存备用；2)羊膜去细胞化处理取出上述冷冻管，置25°C水浴充分解冻，吸出羊膜中的PBS，再将冷冻管放置于液氮中冷冻，如此解冻和冷冻反复冻融3次，然后将羊膜孵育在lmg/mlDNAase中酶解，37°C条件下孵育3小时伴轻微震荡，室温下离心去除上清液，按常规用PBS充分冲洗羊膜后冻干，成片状羊膜；3)制备羊膜微载体将上述片状羊膜迅速置于液氮中，通过均质化冷冻裂解，将片状羊膜裂解成羊膜微粒， 然后在真空密闭条件下冷冻干燥，将羊膜微粒依次通过32目、80目金属筛网过滤，获得 200-500 μ m的羊膜微载体。
2.权利要求1所述微载体构建的表皮干细胞皮肤替代物，构建方法如下1)培养、扩增表皮干细胞取术后废弃皮肤，按常规用0. 25% Dispase 4°C消化，分离表皮层，用0. 25%胰蛋白酶 37°C消化20-30分钟，金属筛网过滤，离心收集细胞，将细胞接种于预先铺有IV型胶原的培养皿中，贴壁20min后弃上清，加入无血清培养基K-SFM，隔日换液，当细胞达70% -80%融合时用胰酶消化制备表皮干细胞悬液备用；2)构建表皮干细胞皮肤替代物取上述表皮干细胞悬液与权利要求1所述的羊膜微载体按一定比例注入旋转培养系统培养，隔日用无血清培养基K-SFM半量换液，当细胞生长达70% -80%融合时，加入新的羊膜微载体继续扩增表皮干细胞，培养2-3周后形成含表皮干细胞的皮肤替代物。
3.权利要求1所述模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体在构建皮肤替代物中的应用。
4.权利要求2所述皮肤替代物在制备创面修复移植材料中的应用。
全文摘要
本发明涉及组织工程和医学创面修复技术领域，是一种可在体外模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体及其皮肤替代物。本发明利用医学废弃的人羊膜作为基质材料，采用反复冻融结合DNA酶消化法去除羊膜细胞，进一步通过冷冻裂解制备了200-500μm大小的具有三维立体结构的羊膜微载体，其不仅具备一般微载体的特性，而且保留了基底膜结构，具有较为完整的IV型胶原、层粘连蛋白，同时含有NGF、HGF、KGF、bFGF、TGF-β1、EGF等生长因子，为表皮干细胞的体外培养扩增提供了近似生理的niche微环境，可在保持干细胞特性的同时快速扩增表皮干细胞，此外其可直接作为真皮支架构建皮肤替代物，动物全层皮肤缺损移植实验显示，愈合质量远优于单纯的羊膜微载体组和空白对照组，不仅新生表皮层明显增厚，伴有乳突样结构形成，而且新生真皮层胶原纤维排列规则、有序。
文档编号C12N5/074GK102367434SQ20111014812
公开日2012年3月7日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者夏照帆, 朱世辉, 王光毅, 纪世召, 罗鹏飞, 肖仕初, 黄国锋 申请人:中国人民解放军第二军医大学