专利名称：小鼠白血病病毒转化骨髓细胞建立细胞系的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种建立小鼠永生化细胞系的方法及其应用，特别涉及一种通过小鼠白血病病毒转化骨髓细胞建立细胞系的方法及其应用。
背景技术：
Abl是一类可诱导淋巴癌/白血病的重要癌基因，包括v-Abl、BCR-Abl、Tel-Abl ·。v_Abl iAbelson H 白(AbeIson murine leukemia virus, A-MuLV) ^ 癌基因。已有研究表明，A-MuLV主要诱导鼠淋巴细胞恶性转化，从而引发小鼠急性淋巴瘤的 /^t。 BCR_Abl Ι 入(chromosomal translocation) ^ BCR (breakpoint cluster region)与c_Abl的C端融合造成的，是诱发人类慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)最关键的癌基因。尽管进行了多年研究，但是对Abl癌基因诱导细胞癌变的作用机制仍不完全清楚。对于Abl癌基因的研究，常用的方法为体外细胞过表达Abl，研究Abl相互作用因子、Abl与其他基因的相互调控。虽然有学者利用双顺反子反转录病毒载体系统研究 Abl和其他基因的相互调节，也有应用小鼠白血病病毒转化小鼠细胞的报道，但是应用小鼠白血病病毒转化细胞的经典方法非常繁琐、成功率低、而且感染的细胞很难形成可以永久传代的永生化细胞系。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的小鼠细胞系的构建方法。本发明所提供的表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的小鼠淋巴细胞系的方法， 包括如下步骤用Abelson鼠白血病病毒转化离体的小鼠骨髓来源淋巴细胞，得到表达 Abelson鼠白血病病毒致癌基因的小鼠淋巴细胞系；所述Abelson鼠白血病病毒致癌基因编码序列表中序列2所示的蛋白质。序列表中的序列2是由981个氨基酸残基组成的蛋白质。序列表中序列2所示的蛋白质的编码基因具体可为序列表序列1所示的DNA分子。序列表中的序列1由3781个核苷酸组成，其编码序列是第205-3150位。其中，所述转化中所用的Abelson鼠白血病病毒具体可为体外包装得到的病毒。所述体外包装具体可包括如下步骤将表达序列表中序列2所示蛋白质的重组逆转录病毒表达载体和囊膜蛋白质粒PCL-VSV-G共转染逆转录病毒包装细胞系(如 Platinum-A-Amphotropic逆转录病毒包装细胞系)，得到包装病毒。所述表达序列表中序列2所示蛋白质的重组逆转录病毒表达载体是将所述 Abelson鼠白血病病毒致癌基因插入pLNCX得到的表达所述Abelson鼠白血病病毒致癌基因的重组表达载体。
上述方法构建得到的表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的小鼠淋巴细胞系，也属于本发明的保护范围。所述表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的小鼠淋巴细胞系具体可为小鼠淋巴细胞系BC44，其保藏号为CGMCC No. 4910。上述细胞系可作为表达序列表中序列2所示蛋白质的一种细胞模型。上述细胞系和细胞模型可用于筛选抑制所述细胞系中的序列表中序列2所示蛋白质表达的物质。本发明的另一个目的是提供一种鉴定序列表中序列2所示蛋白质活性抑制剂的方法。本发明所提供的鉴定序列表中序列2所示蛋白质活性抑制剂的方法，包括如下步骤在上述细胞系的培养体系中加入待筛选物质，如果待筛选物质能抑制上述细胞系中所述序列表中序列2所示蛋白质的活性，所述待筛选物质为候选的序列表中序列2所示蛋白质活性抑制剂；如果待筛选物质不能抑制上述细胞系中所述序列表中序列2所示蛋白质的活性，所述待筛选物质为非候选的序列表中序列2所示蛋白质活性抑制剂。实验证明，本发明方法构建的表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的小鼠淋巴细胞系，传代了一百三十多次，细胞生长状态良好，没有出现细胞凋亡现象，v-Abl蛋白的表达情况也非常稳定，从而形成了可以永久传代的永生化细胞系。这一方法的建立，不仅为建立小鼠淋巴细胞系提供技术支持，而且为研究Abl癌基因调控的信号网络系统及其分子机制和建立Abl癌基因小鼠肿瘤模型提供了一种理想的细胞模型，也为筛选Abl癌基因诱发肿瘤的抗癌药物提供了理想的细胞模型。保藏说明参据的生物材料BC44建议的分类命名小鼠淋巴细胞系保藏日期2011年6月1日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 4910保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号
图1为小鼠淋巴细胞系BC44CGMCC No. 4910的照片。图2为Western blot检测小鼠淋巴细胞系BC44CGMCC No. 4910中v-Abl蛋白的表达。左侧泳道为正常小鼠骨髓来源淋巴细胞，右侧泳道为小鼠淋巴细胞系BC44CGMCC No.4910。图3为小鼠淋巴细胞系BC44CGMCC No. 4910的致瘤实验。左侧为对照小鼠，右侧为小鼠淋巴细胞系BC44CGMCC No. 4910的致瘤小鼠。图4为Imatinib对小鼠淋巴细胞系BC44CGMCC No. 4910中v-Abl下游蛋白表达的抑制。上面的图片为eIF4B 抗体(Cell Signaling Technology，Cat#3592)的 Westernblot检测v-Abl下游蛋白表达的结果；下面的图片为actin抗体(Sigma，A2066) W^festern blot检测结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、表达Abelson鼠白血病病毒的致癌基因的永生化小鼠淋巴细胞系的建 、,一、Abelson鼠白血病病毒(Α-MuLV)的获得1、A-MuLV 的包装(1)携带Abelson鼠白血病病毒的致癌基因ν-Abl的质粒pLNCX-v-Abl构建根据Genbank (AF0338U)报道的v_Abl基因的核苷酸序列设计引物，上游和下游引物均带有HindIII的酶切位点。利用BLAST确定序列特异性，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增得到序列表中序列1所示的v-Abl基因，HindIII酶切处理， 与经过HindIII单酶切的pLNCX载体(Clontech，Cat. No. 631503)质粒连接，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定后送交上海生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定，鉴定正确后用于下述实验。结构正确的质粒名称是pLNCX-v-Abl。 pLNCX-v-Abl中的v-Abl基因编码序列表中序列2所示的蛋白。(2)包装应用 Platinum-A Retroviral Packaging Cell Line, Amphotropic 细胞系(美国Cell Biolabs公司，北京西美杰科技有限公司代理，商品目录号RV-102)包装病毒。该包装细胞系培养于DMEM(Gibco，Cat. NO. 12800-017)培养基，完全培养基中添加终浓度 100units/mL 青霉素、100units/mL 链霉素和 10%胎牛血清(Gibco，Cat. NO. 16000044)，置于37°C，饱和湿度，5% CO2浓度的细胞培养箱中培养。于IOcm培养皿中培养至70-80%汇合时，按照Lipofectamineanvitrogen)转染试剂说明书，将携带小鼠白血病病毒癌基因 v-Abl 的质粒 pLNCX-v-Abl 和囊膜蛋白质粒 pCL-VSV-G(System Biosciences 公司，Cat. #s ⑶500B-1-⑶523A-1产品中包含该质粒)共转染包装细胞系，48_%h后收集细胞上清。2、病毒的收集及浓缩吸取每两个30cm培养皿的细胞上清至50ml离心管(此时在原培养皿中分别加入20ml新鲜的预热的完全培养基)，离心，吸取病毒上清，0. 45 μ m滤器过滤，然后加入 PEG8000 (终浓度5% )和NaCl (终浓度0. 15M)，充分颠倒混勻后，4°C孵育过夜，然后离心， 小心弃去上清，病毒沉淀用无菌PBS溶解，-80°C保存待用。同时用IOml新鲜培养基重悬细胞，在原培养皿中各自加入5ml细胞悬液，置细胞培养箱中继续培养，此后每隔对-3他，收集一次病毒上清，重复5-6次，浓缩后，-80°C保存待用。3、病毒滴度的测定采用RT反应的方法进行病毒滴度的测定，实验步骤如下(1) “hot” 液和 “cold” 液的制备Hot.6μ 1 oligo dT(lmg/ml)
6 μ 1 2mM dTTP12 μ 1 poly rA(lmg/ml)(Amersham 27-4110-01)48 μ 1 0. 5M DTTCold 600 μ 1 IM Tris (pH 8. 3)9. 19ml dH20150 μ 1 5M NaCl600 μ 1 10% NP40( 96孔板中，每孔加入5μ1病毒上清，1 2和1 4梯度稀释，设置完全培养基为阴性对照；(3)混合 hot 液和 cold 液Iml cold 液72 μ 1 hot 液2 μ 1 MnCl2 (0. 5Μ)(4)加入1 μ 1 32P dTTP至混合液中；(5)每孔加入20 μ 1混合液，室温，静置25min ；(6)转膜，将样品转移至 DEAE 膜(VWR Whatman DE81 anion exchanger)；(7)洗膜，2xSSC,洗 2 次，每次 IOmin ；(8)干燥，显影5h或过夜。结果表明步骤2收集的病毒液的滴度为10000-100000CFU/ml。二、小鼠骨髓细胞的转化1、小鼠骨髓细胞的分离(1) 二氧化碳窒息处死Balb/C小鼠，于70%乙醇中浸泡5min，固定于解剖操作台中，剪开下肢皮肤，钝性分离肌肉，分离双侧股骨、胫骨，置于洁净的IOcm培养皿中，皿中预先置入RPMI 1640完全培养基(10%胎牛血清，100units/mL青霉素、100units/mL链霉素， 50 μ M巯基乙醇)，用Iml注射器冲出骨髓，冲洗3-4次； (2)转移至15ml无菌离心管中，离心，弃上清，用5ml完全培养基重悬细胞，然后缓慢加入到含有5ml Histopaque 1077(sigma)的15ml无菌离心管中，离心lOmin，离心结束后，淋巴细胞位于分界面处，红细胞位于离心管底部；(3)收集单核细胞，完全培养基洗3次；(4)弃上清，加入约IOmlPBS,混勻后，经40 μ m筛网滤过至另一洁净15ml离心管中，离心；(5)弃上清，重悬细胞，计数，以适当体积的PBS重悬细胞，得到小鼠骨髓来源淋巴细胞。2、小鼠骨髓来源淋巴细胞的感染采用悬浮离心感染(spin infection)的方法感染小鼠骨髓来源淋巴细胞。细胞计数，用病毒液重悬小鼠骨髓来源淋巴细胞(1-4 χ 106/1.5-2ml病毒液，病毒液的滴度为 50000CFU/ml)，加入 Polybrene (sigma，H9268)，终浓度为 8 μ g/ml ；悬浮离心感染，32 °C， 2000rpm (Thermo centrifuge 400R, Rotor 8177)，离心 2_3h。
3、表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的永生化小鼠淋巴细胞系的建立和鉴定悬浮感染离心结束后，收集细胞，于“U”型底96孔板中在37°C，5.0% CO2中培养感染细胞(100 μ 1/孔)，培养基为RPMI 1640完全培养基(Gibco, Cat. 31800-022) (20% 胎牛血清，100units/mL青霉素、100units/mL链霉素，50 μ M巯基乙醇)。每隔5天，每孔补加50 μ 1完全培养基，以维持细胞的生长所需，2周以后，显微镜观察，挑取细胞长势较好的 ？L重新用“U”型底96孔板中培养，去除贴壁细胞，纯化A-MuLV感染的细胞。随后，以1 2 渐增的方式(96孔板-48孔板孔板-12孔板-6孔板-IOcm培养皿)扩大培养，最终获得细胞状态较好、生长态势良好、可稳定培养、连续传代的A-MuLV转化的淋巴细胞系(见图1)。获得了两株细胞系(命名为BC44，NS2)，按照如下方法已经培养了约600天，传了一百三十多次。细胞生长状态良好，没有出现细胞凋亡现象。其中细胞系的传代方法如下 将细胞于上述RPMI 1640完全培养基在37°C，5. 0% CO2中培养，每3-5天传代。其中小鼠淋巴细胞系BC44已于2011年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏中心登记入册编号CGMCC No. 4910。 图1为传代600天的小鼠淋巴细胞系BC44CGMCC No. 4910的照片。表明该小鼠淋巴细胞系可以永久传代，是永生化细胞系。这些结果表明，应用小鼠白血病病毒感染小鼠骨髓来源的淋巴细胞，通过筛选可以形成能永久传代的永生化细胞系。这一方法的建立，为小鼠淋巴细胞的建系提供了有用技术，也为研究Abl癌基因和白血病病毒致癌机理、以及抗癌药物的筛选提供了一种理想的细胞模型。4、表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的永生化小鼠淋巴细胞系的v_Abl蛋白表达检测通过Western blot检测传代600天的小鼠淋巴细胞系BC44CGMCC No. 4910和小鼠淋巴细胞系NS2中v-Abl蛋白的表达情况。收集细胞系BC44和NS2细胞，用细胞裂解液提取细胞总蛋白，蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、依次加入抗v-Abl抗体(抗体名称abl_c2 抗体，ALBI0CHEN产品，Cat. NO. OP19)和二抗后，ECL显色。结果表明与正常小鼠骨髓来源淋巴细胞相比，小鼠淋巴细胞系BC44CGMCC No. 4910和小鼠淋巴细胞系NS2在v-Abl蛋白分子量处有一明显的目的条带，表明小鼠淋巴细胞系BC44CGMCC No. 4910和小鼠淋巴细胞系NS2成功表达v-Abl蛋白(图2)。5、表达Abelson鼠白血病病毒的致癌基因的永生化小鼠淋巴细胞系的致瘤实验取裸鼠(Balb/C背景)，雌性，3_5周龄，SPF级，30只，体重为14_16g，随机分为3 组，10只/组。对照组的10只小鼠每只分别经皮下注射Balb/C正常小鼠骨髓来源淋巴细胞，细胞系BC44组的10只小鼠每只分别经皮下注射小鼠淋巴细胞系BC44CGMCC No. 4910细胞， 细胞系NS2组的10只小鼠每只分别经皮下注射小鼠淋巴细胞系NS2细胞。这三组的每只小鼠的注射细胞数量均为1*107个细胞。在注射后第12天拍照并观察肿瘤。成瘤的判断 接种后裸鼠出现腹围增加明显，腹部触及瘤体，活动减少，消瘦等症状即判断为成瘤。结果表明对照组的10只小鼠均未成瘤，细胞系NS2组的10只小鼠和细胞系BC44组的10只小鼠成瘤明显(图幻。细胞系BC44组的10只小鼠的瘤重为3. 5士0. 5g。6、用表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的永生化小鼠淋巴细胞系筛选治疗白血病的药物 将临床中BCR-ABL阳性白血病患者治疗药物Imatinib加入RPMI 1640培养基 (0. 5%胎牛血清，1001111^8/1^青霉素、1001111^8/1^链霉素，5(^11巯基乙醇)中，使其终浓度为1(^11，接入小鼠淋巴细胞系肌4犹6110 No. 4910，进行培养。同时设不加Imatinib的对照。分别于接种后5、10、15和20小时，按照步骤4的方法用eIF4B抗体(Cell Signaling Technology, Cat#3592)检测v-Abl下游蛋白eIF4B的表达情况，同时以actin蛋白的表达情况作为内参。结果表明，与不加Imatinib的对照相比，小鼠淋巴细胞系BC44CGMCC No. 4910中v-Abl下游蛋白的表达明显受到抑制，20小时时已检测不到v_Abl下游蛋白 eIF4B的表达(图4)，表明Abl激酶活性被完全抑制而导致其下游蛋白的表达受到抑制。由此可以看出该细胞系的建立为进行有效的慢性髓性白血病药物筛选提供了很好的细胞模型。
权利要求
1.表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的小鼠淋巴细胞系的构建方法，包括如下步骤用Abelson鼠白血病病毒转化离体的小鼠骨髓来源淋巴细胞，得到表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的小鼠淋巴细胞系；所述Abelson鼠白血病病毒致癌基因编码序列表中序列2所示的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述转化中所用的Abelson鼠白血病病毒是体外包装得到的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述体外包装包括如下步骤将表达序列表中序列2所示蛋白质的重组逆转录病毒表达载体和囊膜蛋白质粒pCL-VSV-G共转染逆转录病毒包装细胞系，得到包装病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于表达序列表中序列2所示蛋白质的重组逆转录病毒表达载体是将所述Abelson鼠白血病病毒致癌基因插入pLNCX得到的表达所述 Abelson鼠白血病病毒致癌基因的重组表达载体。
5.权利要求1-4中任一所述方法构建得到的表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的小鼠淋巴细胞系。
6.根据权利要求5所述的细胞系，其特征在于所述表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的小鼠淋巴细胞系为小鼠淋巴细胞系BC44，其保藏号为CGMCC No. 4910。
7.表达序列表中序列2所示蛋白质的细胞模型，它是权利要求5或6所述的细胞系。
8.权利要求5或6所述的细胞系在筛选抑制所述细胞系中的序列表中序列2所示蛋白质表达的物质中的应用。
9.一种鉴定序列表中序列2所示蛋白质活性抑制剂的方法，包括如下步骤在权利要求5或6所述的细胞系的培养体系中加入待筛选物质，如果待筛选物质能抑制权利要求5 或6所述的细胞系中所述序列表中序列2所示蛋白质的活性，所述待筛选物质为候选的序列表中序列2所示蛋白质活性抑制剂；如果待筛选物质不能抑制权利要求5或6所述的细胞系中所述序列表中序列2所示蛋白质的活性，所述待筛选物质为非候选的序列表中序列 2所示蛋白质活性抑制剂。
10.权利要求9所述的方法在筛选序列表中序列2所示蛋白质活性抑制剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了小鼠白血病病毒转化骨髓细胞建立细胞系的方法及其应用。该构建方法，包括如下步骤用Abelson鼠白血病病毒转化离体的小鼠骨髓来源淋巴细胞，得到表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的小鼠淋巴细胞系；所述Abelson鼠白血病病毒致癌基因编码序列表中序列2所示的蛋白质。该方法构建的表达Abelson鼠白血病病毒致癌基因的小鼠淋巴细胞系，传代一百三十次，细胞生长状态良好，没有出现细胞凋亡现象，v-Abl蛋白的表达情况也非常稳定，从而形成了可以永久传代的永生化细胞系。
文档编号C12N15/86GK102229960SQ20111014880
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者杨建岭, 郭桂杰, 陈吉龙, 陈玉海 申请人:中国科学院微生物研究所