专利名称：谷氨酸的三级发酵制备的制作方法
技术领域：
本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵L-谷氨酸的方法，其包括将表达RNA聚合酶sigma-32因子变体的工程菌接入第一发酵罐培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，将所得的培养液接种量接种于第三发酵罐培养，然后在分阶段变温的条件下向第三发酵罐持续流加糖和氮源。另外，本发明还提供了所述方法生产的产品等。
背景技术：
L-谷氨酸是重要的氨基酸原料，已经被广泛用作为调味品和食品添加剂使用。当前，L-谷氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌来生产。用于发酵生产的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通过诱变或基因工程获得的产量更高的营养缺陷型、耐药变异型和代谢变异型微生物。对于基因工程获得的性状改良的微生物来说，其中至关重要的就是性质优异的基因。热休克(heat shock)是生物体的一种重要的自我修复机制，在面对高温、高渗透压、毒物等情况下采取的防御机制。其中，RNA聚合酶sigma-32因子通过特异性地对热休克启动子起作用，而参与热休克过程，影响热休克相关蛋白的转录，从而对氨基酸(如，谷氨酸)发酵中的微生物克服代谢产生的毒物产生影响。尽管野生型RNA聚合酶sigma-32已经被公开(可参见NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov)蛋白和基因登录号AAB18436. 1 ； 也可参见中国专利申请第96193336号)，但是对聚合酶sigma-32的变体的研究却没有报道。本发明人经过长期艰苦研究，除了令人意外地发现了新的RNA聚合酶sigma-32因子之外，本发明人更详细地研究了适合含有该酶的工程菌发酵的方法，尤其是分级变温发酵，在实际生产中增加了谷氨酸的产量。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵L-谷氨酸的方法，其包括将表达RNA 聚合酶sigma-32因子变体的工程菌接入第一发酵罐培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，将所得的培养液接种量接种于第三发酵罐培养，然后在分阶段变温的条件下向第三发酵罐持续流加糖和氮源。另外，本发明还提供了所述方法生产的产品等。具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵L-谷氨酸的方法，其包括(1)将表达RNA聚合酶sigma-32因子变体的工程菌接入第一发酵罐于34_36°C培养6-10小时；(2)将步骤(1)获得的培养液以3-7% (体积)的接种量接种于第二发酵罐，于 34-36°C培养8-12小时;(3)将步骤(2)获得的培养液以10-20% (体积)的接种量接种于第三发酵罐，于 31-34 °C培养2-4小时；
(4)向第三发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0. 2-0. 35% (重量)，而且氮源的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的 0. 1-0. 25% (重量)，于 35-36°C培养 11-17 小时；和(5)向第三发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0. 35-0.6% (重量)，而且氮源的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的 0. 05-0. 12% (重量)，于 38-39°C培养 10-18 小时。在本文中，“第一”、“第二”和“第三”在修饰发酵罐的时候，是为了区分所修饰的发酵罐，即第一发酵罐、第二发酵罐和第三发酵罐之间是互不相同的。在本文中，接种量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以体积百分比表示的时候，指的是菌体培养液(接入的菌液)体积相对于被接入的培养基体积的百分比量。第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方可以是相同的，也可以是不同的，优选是相同的。优选在本发明第一方面的方法中，第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方为 每18立方米培养基中含，葡萄糖500-800公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米浆400-700公斤，K2HPO4 45-80公斤，MgSO4 · 7H20 5-15公斤，生物素5-20克，和维生素Bl 5-15克。在本发明的具体实施方式
中，第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方为每18立方米培养基中含，葡萄糖650公斤，甘蔗糖蜜150公斤，玉米浆500公斤，K2HPO4 60公斤，MgSO4 · 7H20 9公斤，生物素12克，和维生素Bl 9克。优选在本发明第一方面的方法中，第三发酵罐的培养基配方为第三发酵罐的培养基配方为每300立方米培养基中含，葡萄糖13000-18000公斤，甘蔗糖蜜500-3000公斤，玉米浆 50-150 公斤，K2HPO4 120-180 公斤，MgSO4 ·7Η20 10-15 公斤，MnSO4 ·7H2O 100-200 公斤，生物素150-230克，和维生素Bl 15-60克。在本发明的具体实施方式
中，第三发酵罐的培养基配方为每300立方米培养基中含，葡萄糖15000公斤，甘蔗糖蜜2000公斤，玉米浆 70 公斤，K2HPO4 140 公斤，MgSO4 · 7Η20 12 公斤，MnSO4 · 7Η20 120 公斤，生物素 200 克， 和维生素Bl 40克。步骤⑷和(5)的部分培养条件(如，温度，PH等)与步骤(3)的可以相同也可以不同。优选步骤(3)、(4)和(5)中的温度是变化的，优选是逐步向升高的，即从步骤(3)的 31-34°C，升高至步骤(4)的35-36°C，再升高至步骤(5)的38_39°C。这比恒温发酵要显著提高谷氨酸产量。另外，步骤(3)中，不进行流加操作，不干预PH ；而在步骤(4)和(5)中， PH则维持在6. 3至7. 8之间，这可以简单地通过流加碱或酸来实现。在本文中，流加量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以重量百分比表示的时候，指的是加入物质的重量占被加入物质(如，培养液)的重量的百分比量。步骤(4)和(5)中的糖可以是葡萄糖、果糖或者蔗糖。本发明人发现，蔗糖被微生物同化的效果弱于葡萄糖，从而影响发酵效果。因此，优选在本发明第一方面的方法中，步骤(4)和 (5)中的糖是葡萄糖。在步骤中，葡萄糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的 0. 2-0. 35% (重量)，优选为0.27-0. 33% (重量)。在步骤( 中，葡萄糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.35-0. 6% (重量)，优选为0.38-0. 48% (重量)。优选在本发明第一方面的方法中，步骤(4)和( 中的氮源是无机氮源，优选是硫酸铵或氯化铵，如硫酸铵。在步骤(4)中，硫酸铵的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.1-0. 25% (重量)，优选为0. 17-0.23% (重量)。在步骤(5)中，硫酸铵的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.05-0. 12% (重量)，优选为0.07-0. (重量)。在本发明中，野生型RNA聚合酶sigma-32因子是本领域技术人员所知晓的，其序列如 NCBI (http//www. ncbi. nlm. nih. gov)蛋白和基因登录号 AAB18436. 1 所示。优选本发明第一方面的发酵方法中，所述多核苷酸编码RNA聚合酶sigma-32因子变体。在本发明的具体实施方式
中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNo :2所示。其中，所述RNA聚合酶sigma-32因子变体在M28、Y71、D77、K88或1239的位置上被其他天然氨基酸替换，更优选所述RNA聚合酶sigma-32因子变体是在iC8、Y71、D77、K88 和1239的位置上被其他天然氨基酸替换。其中的替换优选选自iC8V、Y71S、D77A、K88N和 I239F。在本发明的具体实施方式
中，所述RNA聚合酶sigma-32因子变体的氨基酸序列如 SEQ ID No 1所示。本领域技术人员可以根据RNA聚合酶sigma-32因子变体的氨基酸序列推导出其编码核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列，如针对发酵所用的菌密码子使用情况优化的。在本发明的具体实施方式
中，所述RNA聚合酶sigma-32因子变体由如 SEQ ID No :2所示的多核苷酸编码。所述多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入产L-谷氨酸的菌，只要能够使产L-谷氨酸的菌表达所述RNA聚合酶sigma-32因子变体即可。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。优选本发明第一方面的方法中，工程菌是棒状杆菌。通常，由于产 L-谷氨酸的菌本身不适于作为克隆宿主菌，因此优选所述多核苷酸是通过穿梭质粒导入产 L-谷氨酸的菌的。其中，所述穿梭质粒优选是大肠杆菌和棒状杆菌的穿梭质粒。这样便能够很方便地在大肠杆菌宿主中进行DNA重组操作。在本发明的具体实施方式
中，工程菌是 Corynebacterium glutamicum0在第二方面，本发明提供了根据本发明得到的产品。具体而言，本发明提供了本发明第一方面的方法制备的发酵液，其中谷氨酸的含量不低于135g/L，优选不低于150g/L。 该发酵液可以进一步纯化以精制谷氨酸。本发明具有以下有益效果多级变温发酵方法适合表达RNA聚合酶sigma-32因子变体的工程菌产生谷氨酸；谷氨酸的发酵产量在工业化生产中得到了很有效的提高；发酵生产的时间较短，提高了单位时间的产量；发酵需要控制的参数较少，简化了操作，更适宜工业化的标准化生产；发酵液质量稳定；变体酶与野生型酶结构差异不大，都可以顺利降解，无安全隐患。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。实施例IRNA聚合酶sigma-32因子变体基因构建体的制备根据我们设计的序列，通过商业途径委托上海生工生物技术有限公司合成编码 RNA聚合酶sigma-32因子变体的基因并构建入大肠杆菌-棒状杆菌穿梭质粒pMS2 (可购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)，商品编号ATCC 67189)中。克隆过程参照《分子克隆实验指南》以及所用商品化试剂的操作指南进行，简要过程如下通过DNA自动合成仪，合成RNA聚合酶sigma-32因子变体基因的核酸片段，用T4 多核苷酸激酶(购自TaKaRa公司)将这些核酸片段的5’端进行磷酸化，然后等摩尔比混合这5个核酸片段后于65°C变性5分钟，退火降温至16°C，加入T4 DNA连接酶(购自TaKaRa 公司)连接12小时。然后，取1 μ L上述连接产物在50 μ L反应体积中进行PCR扩增，其中正向引物如序列表的SEQ ID Νο:3所示(引入了 EcoR I内切酶位点)、反向引物如序列表的SEQ ID No :4所示(引入了 )(ba I内切酶位点)，反应条件为以94°C变性4分钟，然后以94°C变性30秒、63°C退火60秒并72°C延伸30秒进行35个循环，最后以72°C延伸4分钟并降温至4°C。琼脂糖凝胶电泳上述PCR产物，回收约900bp大小的片段，用EcoR I和)(baI双酶切该片段，并与经这两个内切酶酶切的PMS2质粒用T4 DNA连接酶进行连接，转化入大肠杆菌ToplO F’中。挑出阳性克隆，抽提出其中的质粒，经测序验证，相应核苷酸序列如序列表的SEQ ID No 2所示，编码了如SEQ ID No 1所示的RNA聚合酶sigma-32因子变体，由公司将构建好的质粒(命名为pMS2-sigma)寄回。实施例2棒状杆菌的发酵实验通过电转化法将pMS2-Sigma质粒转入L-谷氨酸发酵的棒状杆菌工程菌(可购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)，商品编号ATCC 13869)中，其简要过程是将棒状杆菌在 50mL LB液体培养基中振荡培养至0D500达到0. 8，离心收集菌体，用0°C预冷的10% (V/V) 甘油溶液洗涤后将菌体重悬于200 μ L预冷的10% (V/V)甘油溶液中，加入pMS2-Sigma质粒，混合均勻后转移入0. Icm电击杯中，于1. 5kV持续5ms的条件进行电击，然后立即加入 ImL含0. 5% (M/M)葡萄糖的液体LB培养基，于42°C温浴5分钟，然后涂布在含100 μ g/mL 氨苄青霉素和35 μ g/mL卡那霉素的固体LB培养基上于30°C培养36小时。生长出的转化菌株提取总DNA后，用上述正向引物和反向引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳发现有约900bp 大小的片段，表明已经将如序列表的SEQ ID No :1所示的基因导入了棒状杆菌工程菌中。 同时将pMS2质粒电转化入L-谷氨酸发酵的棒状杆菌工程菌，形成阴性对照菌。将上述电转化的阳性棒状杆菌工程菌和阴性对照菌分别在液体LB培养基中振荡培养至0D500达到0. 5，以5%的接种量接入谷氨酸发酵培养基(每升培养基配方为80g蔗糖，20g NH4Cl，45g CaCl2, Ig KH2PO4, Ig 蛋白胨，400mgMgS04 · 7H20, IOmg FeSO4 · 7H20, IOmg MnSO4 ·7Η20，300 μ g生物素，50 μ g盐酸硫胺素，和4mg氯霉素，用NaOH调节至ρΗ7· 8)中以 30°C振荡(150rpm)培养72小时。离心收集培养基上清液(即，发酵液)，用纸层析法分离并定量培养基中的L-谷氨酸。结果发现，阳性棒状杆菌工程菌的发酵培养基中L-谷氨酸的含量达到了 58g/L，而阴性对照菌的发酵培养基中L-谷氨酸的含量仅为31g/L，表明导入了如序列表的SEQ ID No :2所示的基因，产量整整提高了 81%，远高于现有技术中导入野生型RNA聚合酶sigma-32因子的工程菌的产量提高比率。实施例3谷氨酸的三级发酵实例1第一级制备将实施例2的转化有pMS2-Sigma质粒的棒状杆菌工程菌以0. 5%的接种量接入20立方米发酵罐(其中的培养基配方为葡萄糖650公斤，甘蔗糖蜜150公斤， 玉米浆500公斤，K2HPO4 60公斤，MgSO4 · 7H20 9公斤，生物素12克，和维生素Bl 9克，用水定容至18立方米)，于35°C饱和通气培养8小时，提高菌体密度。第二级制备将20立方米发酵罐的培养液以5%的接种量注入50立方米发酵罐 (其中培养基配方与上相同)，于35°C饱和通气培养10小时，使菌体适宜产酸。第三级制备将50立方米发酵罐的培养液直接注入350立方米发酵罐(其中的培养基配方为葡萄糖15000公斤，甘蔗糖蜜2000公斤，玉米浆70公斤，K2HPO4 140公斤， MgSO4 · 7H20 12公斤，MnSO4 · 7H20 120公斤，生物素200克，和维生素Bl 40克，用水定容至300立方米)，于33°C饱和通气培养3小时。然后，升温至35°C，每小时流加1000公斤葡萄糖和700公斤硫酸铵，持续15小时，期间排出蒸汽以保持体积；之后，升温至38°C，每小时流加1500公斤葡萄糖和300公斤硫酸铵，持续发酵15小时，期间排出蒸汽以保持体积。 流加期间，加入NaOH和浓盐酸使pH维持在6. 3至7. 8之间，即低于低限时加碱，高于高限时加酸。流加时，可以放出1立方米培养液溶解100公斤葡萄糖或硫酸铵，流加入。发酵完毕，薄层层析检测其中产谷氨酸150g/L，达到工业应用的标准。实施例4谷氨酸的三级发酵实例2基本同实施例3，所不同的是，将50立方米发酵罐的培养液直接注入350立方米发酵罐，始终保持在35°C培养和流加。最终，薄层层析检测其中产谷氨酸128g/L，显著低于实施例2的第三级制备的变温培养。实施例5谷氨酸的三级发酵实例3基本同实施例3，所不同的是，将50立方米发酵罐的培养液直接注入350立方米发酵罐，于32°C搅拌培养3小时。然后，升温至36°C，每小时流加1100公斤葡萄糖和700公斤硫酸铵，持续15小时；之后，升温至39°C，每小时流加1400公斤葡萄糖和300公斤硫酸铵，持续发酵15小时。最终，薄层层析检测其中产L-赖氨酸152g/L。
权利要求
1.发酵L-谷氨酸的方法，其包括(1)将表达RNA聚合酶sigma-32因子变体的工程菌接入第一发酵罐于34-36°C培养 6-10小时；(2)将步骤(1)获得的培养液以3-7%(体积)的接种量接种于第二发酵罐，于34-36°C 培养8-12小时；(3)将步骤(2)获得的培养液以10-20%(体积)的接种量接种于第三发酵罐，于 31-34°C培养2-4小时；(4)向第三发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0. 2-0. 35% (重量)，而且氮源的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的 0. 1-0. 25% (重量)，于 35-36°C培养 11-17 小时；和(5)向第三发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的0.35-0. 6% (重量)，而且氮源的每小时流加量为第三发酵罐内培养液量的 0. 05-0. 12% (重量)，于 38-39°C培养 10-18 小时。
2.权利要求1所述的方法，其中第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方为每18立方米培养基中含，葡萄糖500-800公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米浆400-700公斤，K2HPO4 45-80公斤，MgSO4 · 7H20 5-15公斤，生物素5-20克，和维生素Bl 5-15克。
3.权利要求2所述的方法，其中第一发酵罐和第二发酵罐中的培养基配方为每18立方米培养基中含，葡萄糖650公斤，甘蔗糖蜜150公斤，玉米浆500公斤，K2HPO4 60公斤， MgSO4 · 7H20 9公斤，生物素12克，和维生素Bl 9克。
4.权利要求1所述的方法，其中第三发酵罐的培养基配方为每300立方米培养基中含，葡萄糖13000-18000公斤，甘蔗糖蜜500-3000公斤，玉米浆50-150公斤，K2HPO4 120-180 公斤，MgSO4 · 7H20 10-15 公斤，MnSO4 · 7H20 100-200 公斤，生物素 150-230 克，和维生素Bl 15-60克。
5.权利要求4所述的方法，其中第三发酵罐的培养基配方为每300立方米培养基中含，葡萄糖15000公斤，甘蔗糖蜜2000公斤，玉米浆70公斤，K2HPO4 140公斤，MgSO4 · 7H20 12公斤，MnSO4 · 7H20 120公斤，生物素200克，和维生素Bl 40克。
6.权利要求1所述的方法，其中步骤(4)和( 中的糖是葡萄糖；和/或，其中步骤(4) 和(5)中的氮源是无机氮源，优选是硫酸铵或氯化铵。
7.权利要求1所述的方法，其中工程菌是棒状杆菌，优选是CorynelDacterium glutamicum。
8.权利要求1所述的方法，其中RNA聚合酶sigma-32因子变体是在野生型RNA聚合酶 sigma-32因子的M28、Y71、D77、K88或1239的位置上被其他天然氨基酸替换，优选所述替换选自]\C8V、Y71S、D77A、K88N和I239F，最优选其氨基酸序列如SEQ ID No 1所示。
9.权利要求8所述的方法，其中RNA聚合酶sigma-32因子变体是由如SEQID No:2所示的核苷酸序列编码的。
10.权利要求1-9之任一所述的方法制备的发酵液，其中谷氨酸的含量不低于135g/L， 优选不低于150g/L。
全文摘要
本发明提供了L-谷氨酸的发酵方法，其包括将表达RNA聚合酶sigma-32因子变体的工程菌接入第一发酵罐培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，将所得的培养液接种量接种于第三发酵罐培养，然后在分阶段变温的条件下向第三发酵罐持续流加糖和氮源。
文档编号C12R1/15GK102234668SQ201110151558
公开日2011年11月9日 申请日期2011年6月8日 优先权日2011年6月8日
发明者刘鑫, 孟刚, 曹洪, 程耀东, 陈崇安, 马吉银 申请人:宁夏伊品生物科技股份有限公司