Cd24及cd24抗体的新用途的制作方法

专利名称：Cd24及cd24抗体的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及⑶M及⑶M抗体的新用途。
背景技术：
人胚胎干细胞不但能够为今后的糖尿病尤其是I型糖尿病治疗提供充足的供体胰岛细胞来源，而且能够成为探索人胰腺发育过程的理想的体外研究模型。到目前为止，在诱导人胚胎干细胞向胰腺前体和胰岛素分泌细胞定向诱导分化方面已经取得了一些进展。 按照分步诱导法，人胚胎干细胞的分化过程将模拟体内胰腺的发育过程，首先诱导其分化为胚内内胚层，在此基础上进一步诱导分化为胰腺前体细胞和胰岛素分泌细胞。目前主要用一些胰腺发育相关基因的共表达如PDXl、HNFlb、S0X9以及HNF6等来标记胰腺前体细胞， 并且人胚胎干细胞能够通过体外诱导分化获得这类胰腺前体细胞，但是它们向成熟的功能性beta细胞定向分化的效率较低，并且移植到糖尿病小鼠模型体内不能有效地逆转糖尿病症状。Kroon研究组报道人胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞移植到免疫缺陷小鼠体内3 个月后能够形成成熟的胰岛细胞，但前体细胞的致瘤性使其不能在今后向临床应用推广。 因此，相较于胰腺前体细胞，成熟的胰岛细胞是更理想的供体细胞来源，但是如何有效地诱导胰腺前体细胞产生胰岛细胞仍然是糖尿病干细胞疗法的瓶颈之一。胰腺器官发育过程包括了一系列复杂的组织间相互作用和信号传递。在胎胰的发育过程中，上皮-间充质、上皮-内皮以及内皮-间充质细胞间的相互作用同时并协同发生，并在胰腺前体的维持、胰腺外分泌部和内分泌部的特化、胰岛细胞的分化以及成熟发挥重要作用。然而，这些功能大多在低等动物如斑马鱼动物模型上发现的，对于人胰腺的发育过程，仍然缺少相关的研究报道。在胚胎干细胞的分化过程中，存在混合的不同类型细胞群；并且细胞与细胞间的相互作用使得探索诱导功能性胰岛素分泌细胞产生的分子信号的过程变得非常的复杂和困难。尽管用化学筛选的方法能够寻找到一些能够特化内胚层细胞和胰腺前体细胞的化学分子及其相关信号通路，但是基于不纯的混合体系筛选得到的信息是不完全的。纯化胰腺前体细胞能够有利于进一步深入探索调节胰岛细胞分化和成熟的关键信号通路。因此，如果能够寻找到胰腺前体细胞的表面标记基因将对于分离和深入研究胰腺前体细胞都意义重大。但鉴于研究人体发育的局限，以人胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞为研究模型，寻找其纯化的表面标记基因是目前最佳的研究体系之一。在过去的几年中，已经陆续有胰腺前体细胞表面标记基因研究的相关报导。 Suzuki等利用c-Met，肝细胞生长因子(h印atocyte growth factor)的受体，来分选成体小鼠胰腺中具有高度增殖能力以及多向分化潜能的前体细胞。CD133已经被用来在新生和成体小鼠体内分离胚胎胰腺前体细胞，并且这类分离的细胞能够产生胰腺的外分泌、内分泌和导管细胞。在另外的报道中，在小鼠15. 5天胚胎胰腺中，⑶133阳性/⑶49f低表达标记了一群内分泌前体细胞，并且这一表达标记证明在人胎胰中也是保守的。除了这一例报道外，由于取材方面的限制，还未见其他关于人胰腺前体细胞表面标记的相关报道。由于人和啮齿类动物胰腺发育方面有很大差异，目前还不是很清楚是否目前在小鼠模型上报道的胰腺前体标记适用于人的胰腺前体细胞。因此，人胚胎干细胞的体外分化模型将为研究人胰腺发育提供一个很效的研究平台，有利于探索人胰腺前体细胞的特异性标记。到目前为止，现发表的研究中还未见有关于人胚胎干细胞来源的胰腺细胞的表面标记的相关报道。CDM 的氨基酸序列 NCBI Reference Sequence :NP_037362. I0 具体如 SEQ ID NO :1 所示。PDXl (pancreatic and duodenal homeobox 1)的氨基酸序列 NCBI Reference Sequence :NP_000200. I0 具体如 SEQ ID NO :2 所示。S0X9 的氨基酸序列 NCBI Reference Sequence :ΝΡ_000337· 1。具体如 SEQ ID NO :3 所示。HNF6 (h印atocyte nuclear factor 6)的氨基酸序列 NCBI Reference Sequence :NP_004489. I0 具体如 SEQ ID NO :4 所示。 HNFlb (hepatocyte nuclear factor 1-beta)的氨基酸序列 NCBI Reference Sequence NP_000449. 1。具体如 SEQ ID NO :5 所示。HB9(Hlxb9)的氨基酸序列 NCBI Reference Sequence :NP_005506. 30 具体如 SEQ ID NO :6 所示。F0XA2 (forkhead box A2)的氨基酸序列 NCBI Reference Sequence :NP_068556. 20 具体如 SEQ ID NO :7 所示。NKX6. 1 (NK6 homeobox 1)氨基酸序列 NCBI Reference Sequence :ΝΡ_006159· 2。具体如 SEQ ID NO :8 所示。

发明内容
本发明的一个目的是提供CDM的抗体在富集胰腺前体细胞中的应用；或，CD24 的抗体在制备富集胰腺前体细胞的试剂盒中的应用；或，CDM在富集胰腺前体细胞中的应用；或，CDM作为靶标在富集胰腺前体细胞中的应用。上述应用中，所述胰腺前体细胞是由离体的人胚胎干细胞分化而来的。上述任一应用中，所述离体的人胚胎干细胞为细胞系Hl或细胞系H9。上述任一应用中，所述分化为体外分化。上述任一应用中，所述由离体的人胚胎干细胞分化而来的方法包括如下步骤1)将所述离体的人胚胎干细胞换用细胞培养液I，培养4天；2)将步骤1)得到的细胞直接换用细胞培养液II，培养6-8天；3)将步骤2)得到的细胞直接换用细胞培养液III，培养3-5天；所述细胞培养液I按照如下方法配制得到将DMEM/F12培养基、B27，aCtiVin A和 wortmannin混合，得到细胞培养液I,其中DMEM/F12培养基、B27，activin A和wortmannin 的配比为 Iml 5μ 1 IOOng 0. 5nmol ；所述细胞培养液II按照如下方法配制得到将IMDM培养基，F12培养基，B27，RA， FGF7和NOGGIN混合，得到细胞培养液II,其中IMDM培养基，F12培养基，B27，RA, FGF7和 NOGGIN 的配比为 0. 5ml 0.5ml 10 μ 1 2nmol 20ng IOOng ；所述细胞培养液III按照如下方法配制得到将DMEM培养基，N2和EGF混合，得到细胞培养液III，其中DMEM培养基，N2和EGF的配比为Iml 10 μ 1 50ng ；所述步骤1)中，培养的条件为温度为37°C，5%二氧化碳；所述步骤2)中，培养的条件为温度为37°C，5%二氧化碳；所述步骤3)中，培养的条件为温度为37°C，5%二氧化碳；所述步骤1)中，细胞的接种密度为50% -80%。上述任一应用中，所述胰腺前体细胞是具备如下1)和/或幻所示条件的细胞
1)表达如下蛋白中的至少一种PDX1、S0X9，HNF6, HNFlb、HB9 和 F0XA2 ；2)能分化成胰岛素阳性细胞。上述任一应用中，所述胰岛素阳性细胞为具备如下I、II和III条件中的至少一种的细胞I、分泌胰岛素；II、表达蛋白PDXl ；III、表达蛋白NKX6. 1。上述任一应用中，所述富集是在所述步骤幻得到的细胞中进行；所述CDM的抗体为抗CDM的多克隆抗体或抗CDM的单克隆抗体。上述任一应用中，所述抗⑶对的多克隆抗体为兔来源的多抗FL80，所述抗⑶对的单克隆抗体为小鼠来源的单抗ML5或小鼠来源的单抗SN3。本发明的另一个目的是提供一种从细胞群中富集目的胰腺前体细胞的方法。本发明所提供的从细胞群中富集目的胰腺前体细胞的方法，包括如下步骤用 CD24抗体利用流式分选的方法对细胞群进行分离，收集CDM阳性细胞，即得到目的胰腺前体细胞。所述细胞群是由离体的人胚胎干细胞分化而来的；具体按照如下方法分化而来1)将所述离体的人胚胎干细胞换用细胞培养液I，培养4天；2)将步骤1)得到的细胞直接换用细胞培养液II，培养6-8天；3)将步骤2)得到的细胞直接换用细胞培养液III，培养3-5天，得到所述细胞群；所述细胞培养液I按照如下方法配制得到将DMEM/F12培养基、B27，aCtiVin A和 wortmannin混合，得到细胞培养液I,其中DMEM/F12培养基、B27，activin A和wortmannin 的配比为 Iml 5μ 1 IOOng 0. 5nmol ；所述细胞培养液II按照如下方法配制得到将IMDM培养基，F12培养基，B27，RA， FGF7和NOGGIN混合，得到细胞培养液II,其中IMDM培养基，F12培养基，B27，RA, FGF7和 NOGGIN 的配比为 0. 5ml 0.5ml 10 μ 1 2nmol 20ng IOOng ；所述细胞培养液III按照如下方法配制得到将DMEM培养基，N2和EGF混合，得到细胞培养液III，其中DMEM培养基，N2和EGF的配比为Iml 10 μ 1 50ng ；所述步骤1)中，培养的条件为温度为37°C，5%二氧化碳；所述步骤2)中，培养的条件为温度为37°C，5%二氧化碳；所述步骤3)中，培养的条件为温度为37°C，5%二氧化碳；所述步骤1)中，细胞的接种密度为50% -80%。所述方法中，所述胰腺前体细胞是具备如下1)和/或2、所示条件的细胞1)表达如下蛋白中的至少一种PDX1、S0X9，HNF6, HNFlb、HB9 和 F0XA2 ；2)能分化成胰岛素阳性细胞。所述胰岛素阳性细胞为具备如下I、II和III条件中的至少一种的细胞I、分泌胰岛素；II、表达蛋白 PDXl ；III、表达蛋白 NKX6. 1。所述方法中，所述CDM的抗体为抗CDM的多克隆抗体或抗CDM的单克隆抗体。所述方法中，所述抗CDM的多克隆抗体为兔来源的多抗FL80，所述抗CDM的单克隆抗体为小鼠来源的单抗ML5或小鼠来源的单抗SN3。
上述任一应用或分离方法中，所述⑶对的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；所述 PDXl的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示；所述S0X9的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示；所述HNF6的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示；所述HNFlb的氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示；所述HB9的氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示；所述F0XA2的氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示；所述NKX6. 1的氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示·本发明发现了人胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞一个全新的特异性表面标记分子即CDM。CDM共表达于PDXl以及其他的胰腺前体细胞特有的关键转录因子，并且只有 CD24阳性细胞能够分化成为胰岛素阳性细胞。这些数据证明CDM可用于富集人胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞。只需要使用CDM—个表面分子标记，就可以极大程度的富集人胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞。本发明将使目的胰腺前体细胞得到相当程度的富集，这样将有利于准确筛选各种内皮或者间质来源的信号对进一步分化成熟的作用，从而对整个胰腺分化的研究起着相当重要的推动作用。


图1为人胚胎干细胞分化过程中胰腺前体细胞的存在。图2为确定CDM和PDXl的共表达。图3为确定⑶对和PDXl在不同细胞系和不同分化条件下的共表达。图4为免疫荧光证明⑶对阳性细胞表达胰腺前体细胞关键的转录因子。图5为定量PCR证明⑶对阳性细胞表达胰腺前体细胞关键的转录因子。图6为⑶对阳性细胞能形成克隆并维持⑶对和PDXl的表达，而⑶对阴性细胞不能。图7为⑶对阳性细胞能分化成胰岛素阳性细胞，而⑶对阴性细胞不能。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、CDM与胰腺前体细胞中的特异性蛋白共表达一、确定⑶对和PDXl在人胚胎干细胞来源的胰腺细胞中的共表达胰腺分化培养具体步骤如下1)将人胚胎干细胞系Hl换用细胞培养液I (接种密度为80% )，在温度为37°C、 5% 二氧化碳条件下，培养4天；2)将步骤1)得到的细胞直接换用细胞培养液II，在温度为37°C、5%二氧化碳条件下，培养6天；3)将步骤2)得到的细胞直接换用细胞培养液III，在温度为37°C、5%二氧化碳条件下，培养5天，得到胰腺前体细胞；所述细胞培养液I按照如下方法配制得到将DMEM/F12培养基、B27，aCtiVin A和 wortmannin混合，得到细胞培养液I,其中DMEM/F12培养基、B27，activin A和wortmannin 的配比为 Iml 5μ 1 IOOng 0. 5nmol ；所述细胞培养液II按照如下方法配制得到将IMDM培养基，F12培养基，B27，RA，FGF7和NOGGIN混合，得到细胞培养液II,其中IMDM培养基，F12培养基，B27，RA, FGF7和 NOGGIN 的配比为 0. 5ml 0.5ml 10 μ 1 2nmol 20ng IOOng ；所述细胞培养液III按照如下方法配制得到将DMEM培养基，N2和EGF混合，得到细胞培养液III，其中DMEM培养基，N2和EGF的配比为Iml 10 μ 1 50ng。用免疫荧光抗体法检测多个转录因子与CDM是否共表达。其中，用到的抗体如下检测CDM的抗体兔来源的抗CDM的多抗FL80购自Santa Cruz，产品目录号为 sc-11406 ；小鼠来源的抗CDM的单抗SN3购自Santa Cruz，产品目录号为sc_19585 ；以及小鼠来源的单抗ML5，是用PE标记的，购自BD Bioscience，产品目录号为55讨观。检测PDXl的抗体是兔来源的多抗，该抗体购自Abcam，产品目录号为ab47^7 ；以及山羊来源的多抗，该抗体购自Abcam，产品目录号为ab47383。检测S0X9的抗体是兔来源的多抗；该抗体购自&mta Cruz，产品目录号为 sc-20095。检测HNF6的抗体是兔来源的多抗；该抗体购自Santa Cruz，产品目录号为 sc-13050。检测HNFlb的抗体是羊来源的多抗；该抗体购自Santa Cruz，产品目录号为sc-7411。检测HB9的抗体是小鼠来源的单抗；该抗体购自Developmental Studies Hybridoma Bank，产品目录号为81. 5C10。检测F0XA2的抗体是羊来源的多抗；该抗体购自R&D Systems，产品目录号为AFM00。检测⑶133的抗体是兔来源的多抗；该抗体购自 Santa Cruz，产品目录号为SC-30220。检测E-cadherin的抗体是小鼠来源的单抗；该抗体购自Abcam，产品目录号为abl416。检测N-cadherin的抗体是小鼠来源的单抗；该抗体购自BD Bioscience，产品目录号为610920。检测NCAM的抗体是小鼠来源的单抗；该抗体购自Santa Cruz，产品目录号为SC-7326。检测VE-cadherin的抗体是羊来源的多抗；该抗体购自Santa Cruz，产品目录号为SC-6458。检测HCAM的抗体是大鼠来源的单抗；该抗体购自Santa Cruz，产品目录号为SC-18849。检测PDGFRa的抗体是兔来源的多抗；该抗体购自Abcam，产品目录号为abM60。以上除CDM的单抗ML5是PE标记的，其余所有抗体均为非直标抗体，检测中分别用Jackson ImmunoResearch公司购来的抗体复染Ahodamine标记的驴来源的抗山羊的多抗(产品目录号为705-026-147)，FITC标记的驴来源的抗山羊的多抗(产品目录号为 705-096-147)，Rhodamine标记的驴来源的抗小鼠的多抗(产品目录号为715-026-150)， FITC标记的驴来源的抗兔的多抗(产品目录号为711-096-152)，DyLight-649标记的驴来源的抗山羊的多抗(产品目录号为705-496-147)。FITC标记的驴来源的抗大鼠的多抗(产品目录号为712-096-153)。结果在如上胰腺分化体系中，分化过程中存在一个多个转录因子共同表达的阶段,包括？0乂1，!1顺113，5( 9，？(《42，!1顺6以及PR0X1 (图1A)，而且这些PDXl或者HNF6阳性细胞不表达S0X17(图1B)。对这一阶段进行PDXl和许多表面分子的免疫荧光共染色，初步发现⑶对和PDXl的染色相当匹配，而且，在⑶对阴性细胞里没有观察到PDXl的着色(图 1C)。二、几种方法来确认⑶对和PDXl的共表达分化体系与实验一中所述相同。1、分别用三种CDM抗体与PDXl进行共染
首先，因为⑶对被报道过不同的商用抗体存在一些差异，所以选择了总共3种商用抗体，包括一个兔来源的多抗FL80，两个小鼠来源的单抗ML5和SN3。用免疫荧光抗体法检测PDXl与⑶对是否共表达。
检测⑶对的抗体分别如下检测CDM的抗体兔来源的抗CDM的多抗FL80购自Santa Cruz，产品目录号为 sc-11406;以及小鼠来源的抗CDM的单抗SN3购自Santa Cruz，产品目录号为sc_19585 ； 以及小鼠来源的单抗ML5，是用PE标记的，该抗体购自BDBioscience，产品目录号为 55讨观。检测PDXl的抗体是山羊来源的多抗，该抗体购自Abcam，产品目录号为ab47383。以上所有抗体均用Jackson ImmunoResearch公司购来的抗体复染FITC标记的驴来源的抗山羊的多抗(产品目录号为705-096-147)和Iihodamine标记的驴来源的抗小鼠的多抗(产品目录号为715-026-150)或Miodamine标记的驴来源的抗兔的多抗(产品目录号为 711-026-152)。结果表明，三个抗体都显示出和PDXl良好的共染(图2A)。2、流式分析方法按照BD Biosciences购来的细胞固定/通透试剂盒(产品目录号为 554714)进行。将细胞固定后使用PDXl抗体(山羊来源的多抗，购自R&D Systems，产品目录号为AFM19)和CDM抗体(小鼠来源的单抗SN3，购自Santa Cruz，产品目录号为SC-19580染色，之后再用荧光二抗复染。用流式分选仪进行分析。二抗购自Jackson ImmunoResearch =PE标记的驴来源的抗小鼠的多抗(产品目录号为715-116-150)。从PDXl和CDM的结果来看，流式数据显示在分化的胚胎干细胞中主要只存在两群细胞，双阳性和双阴性(图2B)，这也说明了 PDXl和CDM的共表达关系。3、流式分选用流式分选获得了⑶对阴性和⑶对阳性细胞。用定量PCR技术分析了这两群细胞的基因表达情况。CDM阳性细胞的PDXl表达量平均是阴性细胞群的沈倍，是分选前混合细胞群的2. 5倍(图2C)。定量PCR 检测 PDXl 的弓| 物为 5，-GGTGGAGCTGGCTGTCATGT-3，， 5， -CGCGCTTCTTGTCCTCCTC-3，。三、不同分化体系中PDXl和⑶对的共表达检测选择了两个目前公认的细胞系，Hl和H9 ；以及两种应用最多的分化方案，基于 Matrigel以及基于饲养层细胞(Feeder)。分别对每个细胞系都使用两种分化体系，分化体
系同实验一。实验结果显示，在两种细胞系和两种分化方案中，CDM和PDXl始终存在良好的共染关系(图3)。四、CDM阳性细胞表达胰腺前体细胞关键的转录因子为了证明CDM阳性细胞群确实代表了胰腺前体细胞，分析CDM阳性细胞群的基因表达情况。胰腺前体细胞群有特殊的转录因子表达网络，对这些关键的转录因子和CDM 进行免疫荧光分析。人胚胎干细胞为Hl和人胚胎干细胞为H9均进行检测。分化体系与实
验一中所述一致。结果，⑶对阳性细胞不仅仅和PDXl共表达，而且和其他的关键转录因子，包括S0X9，HNF6, HNFlB和HB9都有着良好的共表达关系(图4，此处图片来自H9，Hl的结果类似)。五、进一步证明⑶对阳性细胞中多种转录因子共表达人胚胎干细胞及分化体系与实验一中所述一致。收集CDM阳性细胞和CDM阴性细胞。并利用定量PCR检测实验四中所述关键转录因子的表达。检测Pdxl 的引物为 5，-GGTGGAGCTGGCTGTCATGT-3，，5，-CGCGCTTCTTGTCCTCCTC-3，； 检测 Foxa2 的引物为 5，-CTGAGCGAGATCTACCAGTGGA-3，，5，-CAGTCGTTGAAGGAGAGCGAGT-3，； 检测 Hnf6 的引物为 5，-TGTGGAAGTGGCTGCAGGA-3，，5，-TGTGAAGACCAACCTGGGCT-3，；检测 Hesl 的引物为 5，AGCACACTTGGGTCTGTGC-3，，5，-TGAAGAAAGATAGCTCGCGG-3，；检测 Proxl 的引物为 5，-CAATTTCCACACCGCCAAC-3，，5，-TCAGTGGAACTGGCCATCTG-3，；结果与实验四中免疫荧光数据一致，包括Pdxl，Foxa2，Hnf6，Hesl和ftOXl,这些转录因子的mRNA的表达量在CDM阳性细胞群中明显高于阴性细胞群(图5)。以上结果证明，⑶对阳性细胞表达胰腺前体细胞关键的转录因子。实施例2、用抗CDM的抗体富集胰腺前体细胞人胚胎干细胞系Hl购自WiCell Research Institute, NIH编号为WAOl ；人胚胎干细胞系 H9 购自 WiCell Research Institute，NIH 编号为 WA09。DMEM/F12 培养基购自 hvitrogen，产品目录号为 11330-032 ；KnockOut SR 培养基购自Invitrogen，产品目录号为10拟8_(^8 ；bFGF购自P印roTech，产品目录号为 AF-100-18B ；B27 购自 hvitrogen，产品目录号为 17504044 ;activin A 购自 P印roTech，产品目录号为120-14 ；wortmannin购自Sigma，产品目录号为W1628 ；IMDM培养基购自Invitrogen，产品目录号为1M40-061 ；F12培养基购自 hvitrogen，产品目录号为11765-0M ；RA购自Sigma，产品目录号为似625 ；FGF7购自 P印rol^ech，产品目录号为AF-100-19 ；NOGGIN购自P印rol^ech，产品目录号为120-10C ；DMEM 培养基购自 hvitroge，产品目录号为 C11965500BT ；N2 购自 hvitrogen，产品目录号为17502-048 ；EGF购自P印roTech，产品目录号为AF-100-15 ；PE直标的小鼠来源的抗⑶对的单抗ML5购自BD Bioscience，产品目录号为 555428。一、预培养培养在丝裂霉素处理过的小鼠胚胎成纤维细胞上进行。培养基如下 将每0.8ml DMEM/F12培养基、0. 2ml KnockOut SR培养基和IOng bFGF混合得到。二、分化培养1)将人胚胎干细胞系Hl换用细胞培养液I (接种密度为80% )，在温度为37°C、 5% 二氧化碳条件下，培养4天；2)将步骤1)得到的细胞直接换用细胞培养液II，在温度为37°C、5%二氧化碳条件下，培养6天；3)将步骤2)得到的细胞直接换用细胞培养液III，在温度为37°C、5%二氧化碳条件下，培养5天，得到胰腺前体细胞；所述细胞培养液I按照如下方法配制得到将DMEM/F12培养基、B27，aCtiVin A和
10wortmannin混合，得到细胞培养液I,其中DMEM/F12培养基、B27，activin A和wortmannin 的配比为 Iml 5μ 1 IOOng 0. 5nmol ；所述细胞培养液II按照如下方法配制得到将IMDM培养基，F12培养基，B27，RA， FGF7和NOGGIN混合，得到细胞培养液II,其中IMDM培养基，F12培养基，B27，RA, FGF7和 NOGGIN 的配比为 0. 5ml 0.5ml 10 μ 1 2nmol 20ng IOOng ；所述细胞培养液III按照如下方法配制得到将DMEM培养基，N2和EGF混合，得到细胞培养液III，其中DMEM培养基，N2和EGF的配比为Iml 10 μ 1 50ng。三、用⑶对抗体富集目的胰腺前体细胞用PE直标的小鼠来源的抗CDM的单抗ML5将上述步骤二得到的细胞进行流式分选，将上述步骤二得到的细胞分为两组⑶对阳性组和⑶对阴性组。CD24阳性组细胞即为目的胰腺前体细胞(即能分化成胰腺的胰腺前体细胞)。四、检测富集的⑶对阳性组细胞是否是真正的阳性胰腺前体细胞1、通过细胞表面标志性蛋白表达情况进行验证用免疫荧光抗体法检测各标志蛋白在CDM阳性细胞中是否表达。检测时所用的抗体均与实施例1中实验一中所述一致。结果CDM阳性细胞表达如下蛋白PDX1、S0X9，HNF6，HNFlb、HB9和F0XA2。这些蛋白均是胰腺前体细胞群特有的转录因子表达网络，因此，说明⑶对阳性细胞即是胰腺前体细胞。2、通过细胞增殖能力进行验证将⑶M阳性组和⑶M阴性组细胞分别接种于实验二的细胞培养液III，在温度为 37°C、5%二氧化碳条件下，培养一周。检测细胞的生长形态。结果将CDM阳性细胞和阴性细胞群的单细胞重铺，CDM阳性细胞能形成大量的克隆，并且这些克隆维持了⑶对和PDXl的表达；相比之下，⑶对阴性细胞几乎不能形成克隆，也不表达CDM或者PDXl (图6)。实验设3次重复，结果一致。表明，⑶对阳性细胞显示出一定的增殖能力。⑶对阴性细胞几乎不能形成克隆。相比之下，CDM阳性细胞可以形成，这样体现出CDM阳性细胞有一定的增殖能力。3、通过是否分化得到胰岛素阳性细胞进行验证分化方法将分选的CDM阳性细胞和CDM阴性细胞按实验四-2所述分别在培养基III培养一周后，换用如下细胞培养液将DMEM/F12培养基、B27，bFGF和尼克酰胺混合， 其中DMEM/F12培养基、B27，bFGF和尼克酰胺的配比为Iml 5μ 1 IOng IOymol0在温度为37°C、5%二氧化碳条件下，培养一周，检测能否得到胰岛素阳性细胞。证明分化出的细胞是胰岛素阳性细胞的方法检测分化出的细胞是否表达PDX1、 NKX6. 1和是否表达胰岛素(INS)。具体如下检测NKX6. 1的抗体是小鼠来源的单抗，购自Developmental Studies Hybridoma Bank，产品目录号为F55A12 ；检测INS的抗体是豚鼠(Guinea Pig)来源的多抗，购自Dako，产品目录号为 A0564 ；检测PDXl的抗体是山羊来源的多抗，该抗体购自Abcam，产品目录号为ab47383。
以上所有抗体均用Jackson ImmunoResearch公司购来的抗体复染FITC标记的驴来源的抗山羊的多抗(产品目录号为705-096-147)和Iihodamine标记的驴来源的抗小鼠的多抗(产品目录号为715-026-150)或Miodamine标记的驴来源的抗豚鼠的多抗(产品目录号为706-026-148)。实验数据显示，在相同的分化条件下，⑶对阳性细胞能进一步分化出表达PDX1、 NKX6. 1以及胰岛素的内分泌细胞，但是⑶对阴性细胞不具有这种分化能力(图7)。综合上述实验，表明由人胚胎干细胞系Hl分化得到的细胞中，CDM阳性细胞即为目的胰腺前体细胞(即胰岛素阳性细胞)。实施例3、在人胚胎干细胞系H9上验证CDM对分化得到的胰腺前体细胞的富集方法与实验一至四中所述基本相同，不同的是使用人胚胎干细胞系的是H9。结果与实验四中所述结果无显著差异。
权利要求
1.CD24的抗体在富集胰腺前体细胞中的应用；或，CD24的抗体在制备富集胰腺前体细胞的试剂盒中的应用；或，CDM在富集胰腺前体细胞中的应用；或，CDM作为靶标在富集胰腺前体细胞中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述胰腺前体细胞是由离体的人胚胎干细胞分化而来的。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述离体的人胚胎干细胞为细胞系 Hl或细胞系H9。
4.根据权利要求1或2或3所述的应用，其特征在于所述分化为体外分化。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于所述由离体的人胚胎干细胞分化而来的方法包括如下步骤1)将所述离体的人胚胎干细胞换用细胞培养液I，培养4天；2)将步骤1)得到的细胞直接换用细胞培养液II，培养6-8天；3)将步骤2、得到的细胞直接换用细胞培养液III，培养3-5天；所述细胞培养液I按照如下方法配制得到将DMEM/F12培养基、B27，activin A和 wortmannin混合，得到细胞培养液I,其中DMEM/F12培养基、B27，activin A和wortmannin 的配比为 Iml 5μ 1 IOOng 0. 5nmol ；所述细胞培养液II按照如下方法配制得到将IMDM培养基，F12培养基，B27，RA，FGF7 和NOGGIN混合，得到细胞培养液II,其中IMDM培养基，F12培养基，B27，RA，FGF7和NOGGIN 的配比为 0.5ml 0.5ml 10 μ 1 2nmol 20ng IOOng ；所述细胞培养液III按照如下方法配制得到将DMEM培养基，N2和EGF混合，得到细胞培养液III，其中DMEM培养基，N2和EGF的配比为Iml 10 μ 1 50ng ；所述步骤1)中，培养的条件为温度为37°C，5%二氧化碳；所述步骤2)中，培养的条件为温度为37°C，5%二氧化碳；所述步骤幻中，培养的条件为温度为37°C，5%二氧化碳；所述步骤1)中，细胞的接种密度为50% -80%。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于所述胰腺前体细胞是具备如下 1)和/或2)所示条件的细胞1)表达如下蛋白中的至少一种PDX1、S0X9，HNF6,HNFlb、HB9和F0XA2 ；2)能分化成胰岛素阳性细胞。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于所述胰岛素阳性细胞为具备如下I、II和III条件中的至少一种的细胞I、分泌胰岛素；II、表达蛋白PDXl；III、表达蛋白NKX6.1。
8.根据权利要求1-7中任一所述的应用，其特征在于所述富集是在所述步骤幻得到的细胞中进行；所述CDM的抗体为抗CDM的多克隆抗体或抗CDM的单克隆抗体。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述抗CDM的多克隆抗体为兔来源的多抗FL80，所述抗CD24的单克隆抗体为小鼠来源的单抗ML5或小鼠来源的单抗 SN3。
10. 一种从细胞群中富集目的胰腺前体细胞的方法，包括如下步骤用CDM抗体利用流式分选的方法对细胞群进行分离，收集CDM阳性细胞，即得到目的胰腺前体细胞。
全文摘要
本发明公开了CD24及CD24抗体的新用途。该新用途是CD24抗体在富集胰腺前体细胞中的应用。本发明将使目的胰腺前体细胞得到相当程度的富集，这样将有利于准确筛选各种内皮或者间质来源的信号对进一步分化成熟的作用，从而对整个胰腺分化的研究起着相当重要的推动作用。
文档编号C12N5/071GK102250828SQ20111015172
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月8日 优先权日2010年11月10日
发明者刘猛, 尹明, 张冬卉, 时艳, 蒋卫, 邓宏魁, 隋鑫 申请人:北京大学, 北京瑞普晨创科技有限公司