专利名称：桑树肌动蛋白MaACT3启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及桑树肌动蛋白MaACT3启动子及其应用。
背景技术：
肌动蛋白是真核生物中普遍存在的一种古老的蛋白质，它是构成细胞骨架的主要成分。在高等植物中，有肌动蛋白组成的微丝参与细胞分裂、胞质环流、延长生长等重要的生理活动。细胞器表面的肌球蛋白与微丝接触，肌动蛋白与肌球蛋白相互作用，ATP化学能转变为机械能，推动细胞器运动。单体肌动蛋白一般由375-377个氨基酸残基组成，分子量约为42kDa。由于肌动蛋白基因非常保守，所以被作为一种进化研究中的分子标记广泛采用。大部分肌动蛋白基因在植物各种组织中都有高效且稳定的表达，所以其启动子具有高效，稳定的启动活性。现有的桑树转基因研究都是采用植物通用的组成型启动子，如CMV35s、玉米Ubi 启动子等，由于植物中存在对外部DNA的识别及防御机制，所以在研究中经常出现基因沉默或者表达量过低的现象。
发明内容
本发明的目的之一在于提供桑树肌动蛋白MaACT3启动子核酸序列，以及核酸序列延长、截短或具有80%以上同源性的具有启动活性的核酸序列。针对外源基因在转基因植物中存在的基因沉默及表达量过低的问题，以及在植物中的报告基因需要有强启动子来驱动的需要，提供桑树中的一个内源性强启动子及其在转基因植物中的应用。本发明所述的桑树肌动蛋白MaACT3启动子，通过下列步骤克隆得到
一、桑树肌动蛋白MaACT3启动子5’端调控序列的分离
1)桑树基因组的提取；
2)桑树基因组酶切消化；
3)桑树基因组酶切产物纯化；
4)衔接头连接到消化的桑树基因组上；
5)采用槽式PCR方法获得基因片段；
二、扩增的PCR产物经过切胶回收并连接到pMD19-TVector (Takara)，挑选阳性克隆并测序。本发明同时提供桑树肌动蛋白MaACT3启动子的应用，S卩利用获得的MaACT3启动子构建启动子_目的基因_终止序列的表达盒，构建成植物表达载体，并采用农杆菌感染方法进行瞬时表达检测，具体操作如下
一、植物表达载体的构建
1)采用PCR法分别获得MaACT3启动子、EGFP以及Nos片段，切胶回收备用；
2)融合PCR扩增构建MaACT3启动子-EGFP-Nos表达盒；3)含三个元件的融合片段经切胶回收、双酶切消化及乙醇沉淀回收等步骤，插入植物表达载体PCMBIA1300的酶切位点损ο I和幻7/ I之间；
二、瞬时表达检测
1)利用冻融法将植 物表达载体转入农杆菌，采取PCR法鉴定阳性克隆；
2)瞬时表达具体方法采用农杆菌感染桑树成熟叶片的方法，荧光显微镜观察荧光蛋白在桑树叶片中的表达情况。上述植物表达载体的构建中，EGFP为增强型的绿色荧光蛋白基因，常用作植物转基因的报告基因。Nos片段为胭脂碱合成酶的终止子，在植物启动子活性研究中用作表达终止元件。载体PCMBIA1300是目前广泛采用的植物双元表达载体，其中含有潮霉素抗性的表达框，可以在植物转基因中作为筛选标记。桑树肌动蛋白MaACT3启动子可应用于外源基因的真核表达，同时可应用于转基因植物。
图ι为槽式PCR扩增桑树肌动蛋白MaACT3启动子，1-5泳道为第一轮PCR的结果，6_10 为第二轮PCR的结果，其中8，9扩增的片段含有922bp的启动子区域和肌动蛋白基因的5’ 端区域。图2为绿色荧光蛋白EGFP在桑树叶片中的瞬时表达，图中亮绿色的区域代表绿色荧光蛋白EGFP表达的区域，黑色的区域代表没有荧光蛋白表达的区域。本发明的优点是
本发明采用桑树内源性的强启动子代替植物通用型启动子，可以避免外源基因转入桑树中产生的基因沉默及表达量过低的问题。利用农杆菌T-DNA区将启动子-目的基因-终止序列表达盒导入植物基因组中，可以实现外源基因的高效稳定表达，获得组成型表达的转基因植物，尤其在驱动筛选标记及报告基因的表达中具有重要意义，也为植物基因工程技术的研究和应用提供了重要价值的启动子和调控元件。
具体实施例方式实施例1 桑树肌动蛋白MaACT3启动子的克隆一、桑树肌动蛋白MaACT3启动子5’端调控序列的分离
1)采用CTAB法提取桑树基因组，并用核酸蛋白仪及0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA ；
2)分别取20μg用2μ L限制性内切酶Pn/ U、Dra I, Sma I, Stu I禾口 V (Takara )，酶切过夜；
3)乙醇沉淀法回收酶切产物在酶切产物中加入等体积酚氯仿(V:V=1:1)充分混勻，12 OOOx g，常温离心5分钟，取上清；加入1/10体积的NaAc (3M，PH5. 2)以及2. 5-3倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟，13 OOOx g常温或者4°C离心15分钟，弃上清；用80% 乙醇溶液清洗沉淀2次，室温干燥，加入TE缓冲液或无菌水溶解备用；
4)衔接头由两条链(长链5，-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGG GCTGGT-3’ ；短链5’ -NH2-ACCAGCCC-P04-3')退火形成，将衔接头与酶切产物相连接，连接体系(40 μ L)基因组酶切产物 8μ L ；接头 4μ L ； 40%PEG4000 20 μ L ；IOxLigation Buffer4 μ L，T4连接酶(Fermentas)2 μ L，无菌水2 μ L，22°C保温4小时；连接产物在70°C保温10 分钟，并用上述乙醇沉淀法回收连接产物作为PCR的模板；
5)根据报道的MaACT3的mRNA设计两条基因特异引物GSPl (5’ -CCACTGGCATAGAGGGA AAG-3，)和 GSP2 (5，-GCATCCTTTTGGCCCATAC-3’ )，根据长接头设计两条引物 APl (5' -TCTGTGAGGTCACG TCCAGC-3‘)和 AP2(5' -TTGCCTTGGACTACGAGCAGG-3‘)；先采用 GSPl和APl进行第一轮扩增，然后采用GSP2和AP2进行第二轮扩增获得特异片段；采用琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，片段与Takara公司的pMD19_T Vector载体相连接，转化大肠杆菌DH5 α，挑选阳性克隆，送到南京金斯瑞公司测序；
二、扩增的PCR产物经过回收并连接到pMD19-T Vector (Takara)，挑选阳性克隆并测 序。实施例2 植物表达载体的构建
一、MaACT3启动子与荧光蛋白基因EGFP的融合
采用PCR法扩增分别回收获得MaACT3启动子、EGFP以及Nos的片段作为融合PCR材料；扩增片段所用引物如下
MaACT3 启动子上游引物5' -CCGCTCGAGACGCGTCATGGGGTCCCTAAATCAG-3‘ MaACT3 启动子下游引物5' -TCCTCGCCCTTGCTCACCATTTTCTATTGTATTTCTGCAG-3‘ EGFP 上游引物5 ‘ -CTGCAGAAATACAATAGAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ‘ EGFP 下游引物5 ‘ -ATTCGAGCTGGTCACCAATTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3 ‘ No s 上游引物5 ‘ -ATGGACGAGCTGTACAAGTAAATTGGTGACCAGCTCGAAT-3 ‘ No s 下游引物5 ‘ -AAAGGGCGGCCGCTATTAATTAACCCGATCTAGTAACATAGATGA-3 ‘ 融合 PCR 扩增体系(25 μ L) IOxPCR Buffer 2. 5 μ L、MgCl2 2 μ L、MaACT3 启动子上游引物和Nos下游引物各1 μ L、模板总体积2 μ L (三个片段摩尔数相等)、LA Taq酶0. 2 μ L (5U/ μ L)和无菌水14. 8 μ L ；扩增程序94°C预变性4分钟；94°C变性30秒，70°C退火5分钟，72 °C延伸2分钟；94 V变性30秒，70 V退火30秒，72 °C延伸2分钟，运行30个循环；72 °C 延伸10分钟；4°C保存；
二、含三个元件的融合PCR片段经切胶回收、双酶切消化及乙醇沉淀等步骤，插入农杆菌植物表达载体PCMBIA1300的酶切位点损ο I和幻w I之间，双酶切及测序证实瞬时表达载体构建成功。实施例3 瞬时表达检测
利用冻融法将植物表达载体转入农杆菌，采取PCR法鉴定阳性克隆。阳性克隆在YEB 液体培养基中扩大培养至OD=L 5-2. 4之间，离心收集菌体，利用感染培养基(1/4MS培养基 +100 μ m乙酰丁香酮)重悬沉淀2次，最后稀释成OD=O. 5 ；将桑树成熟叶片切成Icm2大小， 在0. 1%升汞中消毒5分钟，无菌水漂洗3次以上；然后将消毒后的叶片浸泡在菌液中保持 30分钟，放在用感染培养基浸湿的滤纸上，22°C黑暗培养3天，采用荧光显微镜观察荧光蛋白在桑树叶片中的表达情况。
权利要求
1.桑树肌动蛋白MaACT3启动子，其特征在于如说明书序列表所示的核酸序列，以及核酸序列延长、截短或具有80%以上同源性的具有启动活性的核酸序列。
2.权利要求1所述的桑树肌动蛋白MaACT3启动子的克隆方法，其特征在于包括以下步骤1)桑树基因组的提取；2)桑树基因组酶切消化；3)桑树基因组酶切产物纯化；4)衔接头连接到消化的桑树基因组上；5)采用槽式PCR方法获得基因片段；6)扩增的PCR产物经过切胶回收并连接到pMD19-TVector (Takara)，挑选阳性克隆并测序。
3.权利要求1所述的桑树肌动蛋白MaACT3启动子的应用，其特征在于，利用该启动子构建启动子_目的基因_终止序列的表达盒，构建成植物表达载体。
4.权利要求1所述的桑树肌动蛋白MaACT3启动子应用于外源基因的真核表达。
5.权利要求1所述的桑树肌动蛋白MaACT3启动子应用于转基因植物。
全文摘要
本发明涉及桑树肌动蛋白MaACT3启动子及其克隆、植物表达载体构建方法及应用。克隆方法包括桑树基因组的提取、酶切消化、酶切产物纯化、衔接头连接到消化的桑树基因组上、采用槽式PCR方法获得基因片段、回收扩增的片段，连接到pMD19-TVector载体(Takara)上并测序等步骤。本发明采用桑树内源性的强启动子代替植物通用型启动子，可以避免外源基因转入桑树中产生的基因沉默及表达量过低的问题。利用遗传转化技术将启动子-目的基因-终止序列表达盒导入植物基因组中，可以实现外源基因的高效稳定表达，获得组成型表达的转基因植物。
文档编号C12N15/82GK102220328SQ20111015424
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月9日 优先权日2011年6月9日
发明者余茂德, 吕蕊花, 吴存容, 张琼予, 李军, 李镇刚, 王茜龄, 赵爱春, 金筱耘, 鲁成 申请人:西南大学