专利名称：双层细胞球的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种双层细胞球的制作方法，主要适用于细胞的三维培养。
背景技术：
目前传统的贴壁细胞培养是二维的培养模型，是一种细胞单层培养的模式，缺乏体内微环境的支持，所得出的实验结果不能与体内的实际情况相符。由于在体内实质细胞与其周围的间质细胞是密切接触的，之间存在着相互作用，正常的相互作用能维持体内平衡，机体正常运转，而异常相互作用则会导致疾病，如肿瘤。研究发现肿瘤的产生并不只是肿瘤细胞所致，其局部微环境也起着至关重要的作用，甚至决定着肿瘤的命运。肿瘤细胞在发生发展过程中始终与周围的间质细胞密切接触，当局部微环境中的作用因子达到一定浓度时，两者间相互作用才可导致肿瘤细胞发生一系列结构、功能和代谢改变，因此用普通的细胞培养方法由于细胞数量有限及培养液的稀释作用就无法观测到这种变化，目前也有一些三维培养模型，但是都是借助某种凝胶的作用，如水凝胶、胶原蛋白凝胶构建出来的，无法真实的反映出体内细胞的生存环境。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对上述存在的问题提供一种双层细胞球的制作方法，以克服外来不明物质对细胞的影响，更全面、更真实地反映体内细胞的生存环境，直观再现特定条件下两种细胞间的相互作用。本发明所采用的技术方案是双层细胞球的制作方法，其特征在于步骤如下a、按照常规培养方法在培养液内分别培养两种不同的细胞；b、选取其中一种细胞制作单个细胞悬液，即倒掉培养瓶中的培养液，加入l_2ml PBS洗涤液柔和洗1-2遍后倒掉该洗涤液，再加l_2ml消化液静置lk-5min，在显微镜下动态监测，当出现细胞间隙增大，胞质回缩，细胞变圆时便停止消化，倒掉消化液加入培养液， 并用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞形成单个细胞悬液；C、调整培养瓶内单个细胞的浓度，使瓶内所含单个细胞浓度为1 X IO5-I X IO6个/
毫升；d、将上述细胞悬液加入EP管中，并置于37摄氏度含5%的(X)2培养箱内静置 l-4h ；e、将静置后的EP管以1-7转/分钟的转速旋转培养，并每隔10_14h更换一次培养液，第一次更换培养液时需保证管内细胞已滚成球状，培养时间视实验要求而定；f、依次重复步骤b、c、d，制作另一种细胞的单个细胞悬液，并将其加入步骤e得到的含细胞球的培养液中，继续以1-7转/分钟的转速旋转培养，并每隔10-14h更换一次培养液，第一次更换培养液时需保证管内两种细胞已形成边界清楚的、双层结构的球形细胞团，培养时间视实验要求而定。所述培养液为含10%胎牛血清的RPMI1640。
所述PBS洗涤液pH值为7. 2-7. 4，浓度为0. OlM0所述消化液为0. 25% (即IOOml的上述PBS中含有0. 25g的胰酶)的胰酶。本发明的有益效果是本发明对细胞悬液进行旋转培养，利用万有引力定律，并且依赖细胞相互之间的一种粘附性构建三维细胞培养模型，可以较真实的模拟体内的微环境，较之现有技术中借助凝胶作用构建三维细胞培养模型，排除了一些外来不明物质对细胞的影响，将相当数量的两种细胞按照一定的排列方式紧密接触进行培养，模拟体内肿瘤与间质的空间构象，更全面、更真实地反映体内细胞的生存环境，形象地反映出肿瘤在间质的支持下，它的生长和生存状态，直观再现特定条件下两种细胞间的相互作用，而且还能间接地检测细胞的粘附作用，反映肿瘤细胞的侵袭性。
具体实施例方式本实施例以肿瘤细胞和正常细胞双层细胞球制作为例，其具体步骤如下a、采用含10%胎牛血清的RPMI1640作为培养液(即100毫升培养液中含10毫升胎牛血清，90毫升的RPMI1640)，按照常规培养方法分别培养正常细胞和肿瘤细胞；也可以采用 DMEM 或 α -MEM 代替 RPMI1640。b、选取其中一种细胞制作单个细胞悬液，即倒掉培养瓶中的培养液，加入l_2ml PBS(Phosphate-buffered saline or phosphate buffer solution，中文名称石舞酸盐缓7中液，按说明书将PBS粉剂溶于双蒸水中高压消毒，配成浓度为0. 01M, pH为7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液即可)柔和洗1-2遍后倒掉，再加入0. 25%的胰酶(制备IOOmlPBS,并称取0. 25g 胰酶加入到PBS中低速搅拌)，胰酶加入量原则上覆盖所有细胞即可，本例中胰酶加入量为 Ι-aiil，然后静置lk-5min，在显微镜下动态监测，当出现细胞间隙增大，胞质回缩，细胞变圆时便停止消化，倒掉胰酶加入l_2ml培养液(即含10%胎牛血清的RPMI1640)，并用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，尤其是边角处，形成单个细胞悬液。C、调整培养瓶内单个细胞的浓度，以防每毫升细胞悬液内单个细胞的个数过多， 导致后面步骤中细胞旋转成球后体积过大，导致细胞球中心的细胞无法得到足够的营养而出现坏死或细胞凋亡的现象。本例须使瓶内所含单个细胞浓度为IX IO5-I X IO6个/毫升， 根据细胞具体大小可以适当调整浓度，如HSF(人皮肤成纤维细胞)体积比较大，浓度可以为2.5X105/ml，SW620(结直肠癌细胞系)体积比较小，浓度可以为9X 105。其具体过程如下，将步骤b得到的单个细胞悬液加入EP管，然后吸出10μ1充入细胞计数板中，计数四角大方格内的细胞总数；四角大方格内的细胞总数+4Χ104即为每毫升内的细胞数。若单个细胞浓度过高，则加入适量培养液稀释直至达到所需浓度。d、将调整至所需浓度的细胞悬液加入EP管中，并置于37摄氏度含5% (体积百分比)的CO2培养箱内静置l"4h ；e、将静置后的EP管以1-7转/分钟的转速旋转培养，当管内的单个细胞滚成球状 (即相当数量的单个细胞在离心力作用下紧贴在一起形成球状，其成球时间一般为12个小时左右)后，更换管内培养液，换液过程中先用吸管将管内培养液吸出，然后沿管壁缓慢加入新的培养液，整个过程中须保证细胞球不受破坏；此时，可根据实验要求选择直接进行步骤f ；也可选择继续旋转培养，培养过程中，须每隔10-14h更换一次培养液，以保证管内细胞正常生长所需营养，当培养时间达到实验所需要求时，进行步骤f ；
f、依次重复步骤b、c、d，制作另外一种细胞的单个细胞悬液，并将其加入步骤e得到的含细胞球的培养液中，继续以1-7转/分钟的转速旋转培养，并每隔10-14h更换一次培养液，第一次更换培养液时需保证管内两种细胞已形成内核与外层边界清楚的、双层结构的近似球形细胞团，培养时间视实验要求而定。细胞球培养达到所需时间(即做实验所要求的时间，可以不同)后，吸出培养液， 在4摄氏度下先用4%多聚甲醛(称取4克多聚甲醛溶于IOOml 0. IM PBS中)固定约12 小时，再用15%蔗糖溶液脱水，4摄氏度冰箱内放置约12小时；然后用胶水或OCT进行包埋 (OCT是一种包埋剂，一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，在制作切片或超薄切片时， 由于组织是柔软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄均勻的切片是困难的，所以有必要用一定物质浸透组织内部，整个组织一样硬化，以利于切成薄片，这种物质叫做包埋剂)后移入液氮冻存，标记日期及细胞种类，以便以后拿取。冰冻切片后染色观察两种细胞相互作用结果。本发明将相当数量的两种细胞(包括正常细胞和肿瘤细胞)按照一定的排列方式紧密接触进行培养，模拟体内肿瘤与间质的空间构象，较常规单层细胞培养方法能更全面、 更真实地反映体内细胞的生存环境，直观再现特定条件下两种细胞间的相互作用。此外，本发明模拟了一种近体内环境，该模型也可用于药敏试验。
权利要求
1.一种双层细胞球的制作方法，其特征在于步骤如下a、按照常规培养方法在培养液内分别培养两种不同的细胞；b、选取其中一种细胞制作单个细胞悬液，即倒掉培养瓶中的培养液，加入1-aiilPBS洗涤液柔和洗1-2遍后倒掉该洗涤液，再加l_2ml消化液静置lk-5min，在显微镜下动态监测，当出现细胞间隙增大，胞质回缩，细胞变圆时便停止消化，倒掉消化液加入培养液，并用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞形成单个细胞悬液；c、调整培养瓶内单个细胞的浓度，使瓶内所含单个细胞浓度为1X IO5-I X IO6个/毫升；d、将上述细胞悬液加入EP管中，并置于37摄氏度含5%的CO2培养箱内静置l_4h；e、将静置后的EP管以1-7转/分钟的转速旋转培养，并每隔10-14h更换一次培养液， 第一次更换培养液时需保证管内细胞已滚成球状，培养时间视实验要求而定；f、依次重复步骤b、c、d，制作另一种细胞的单个细胞悬液，并将其加入步骤e得到的含细胞球的培养液中，继续以1-7转/分钟的转速旋转培养，并每隔10-14h更换一次培养液， 第一次更换培养液时需保证管内两种细胞已形成边界清楚的、双层结构的球形细胞团，培养时间视实验要求而定。
2.根据权利要求1所述的双层细胞球的制作方法，其特征在于所述培养液为含10% 胎牛血清的RPMI1640。
3.根据权利要求1所述的双层细胞球的制作方法，其特征在于所述PBS洗涤液pH值为 7. 2-7. 4，浓度为 0. OlM0
4.根据权利要求1所述的双层细胞球的制作方法，其特征在于所述消化液为0.25% 的胰酶。
全文摘要
本发明涉及一种双层细胞球的制作方法。本发明所要解决的技术问题是提供一种双层细胞球的制作方法，全面真实地反映体内细胞的生存环境，直观再现特定条件下两种细胞间的相互作用。解决该问题的技术方案是双层细胞球的制作方法a、分别培养两种不同的细胞；b、选其中一种细胞制作单个细胞悬液；c、控制瓶内单个细胞浓度为1×105-1×106个/毫升；d、置于37度含5％的CO2培养箱内静置1-4h；e、旋转培养使其滚成球状，每隔10-14h换液一次；f、制作另一种细胞的单个细胞悬液，并将其加入步骤e得到的含细胞球的培养液中，继续旋转培养使管内两种细胞形成边界清楚的、双层结构的球形细胞团，每隔10-14h换液一次。本发明主要用于细胞的三维培养。
文档编号C12N5/02GK102250824SQ20111015450
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月8日 优先权日2011年6月8日
发明者来茂德, 许晶晶, 赵志敏, 邓红, 饶翠 申请人:浙江大学