专利名称：一种与植物耐低温相关的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种与植物耐低温相关的基因及其应用。
背景技术：
大豆是世界上重要的蛋白和油料作物。低温对大豆生长造成严重影响，特别是在生长后期，冷胁迫往往对大豆产量造成严重破坏，成为限制大豆产量提高的重要因素。长期以来，人们主要用传统遗传育种的方法对大豆的抗寒性进行改良，然而这种方法具有效率低、周期性长的缺点，并且随着长期的使用其效果越来越不明显。利用转基因技术将抗寒相关基因转化到大豆中是提高大豆抗寒性的一个更直接有效的途径和必然趋势。目前，植物抗冷机制在拟南芥中研究较多，其中研究的最为清楚的是 CBFs (CRT-binding factorl)转录因子，包括CBFs的上下游发挥功能的各个基因所介导的冷信号通路(Jaglo-Ottosen et al.，1998 ；Gilmour et al.，2000)。另外，除了 CBFs 转录因子介导的冷信号通路外，其他独立于CBFs转录因子之外的冷信号通路的研究也取得了一些进展(Zhu et al.，2004 ；Xin et al.，2007 ；Zhu et al.，2008)。大豆抗冷机理的研究相对较少，冷相关基因的克隆和功能研究相对滞后。目前，主要通过同源克隆的方法在大豆中克隆了一些冷相关的基因。这些基因主要包括一些Ap2、 bZIP、MYB、WRKY等家族的转录因子。Chen等通过同源搜索大豆EST数据库得到一个含有Ap2 结构域的基因GmDREB3，其可以和干旱应答元件DRE结合，此基因受冷诱导上调，同时此基因转化拟南芥的过表达植株能增强对冷、干旱、盐等胁迫条件的抗性(Chen et al.，2008)。 Liao等以拟南芥bZIP结构域为探针对大豆EST序列搜索、拼接，最终鉴定了 4个bZIP家族的基因，其表达受到不同胁迫条件的调节，可以同ABRE元件结合并且其转化拟南芥的过表达植株增强了对冷冻和盐胁迫条件的抗性(Liao et al.，2008)。跑皿等通过同源比对的方法鉴定了数个含有WRKY结构域的基因，能同W-box作用元件结合，其表达受盐、干旱、冷等胁迫条件的调节，其转基因过表达拟南芥植株对盐、干旱、冷等胁迫的抗性增加(Zhou et al.，2008)。Cheng等利用cDNA_AFLP技术在大豆胚轴中得到一个受冷上调的基因，其过表达拟南芥植株增强了对冷、干旱和盐的抗性(Cheng et al.，2009)。Xie等利用RACE技术得到2个trihelix家族的转录因子，其蛋白被定为在细胞核中表达，其过表达拟南芥植株增强了对冷、干旱和盐的抗性(Xie et al.，2009)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种与植物耐低温相关的基因及其应用。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。一种与植物耐低温相关的基因，其具有序列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。含有上述基因的重组表达载体，所用空载体为PEGAD。将目的基因插入到PEGAD的限制性内切酶Sma I和BamH I酶切识别位点之间，得
到重组表达载体。
含有上述基因的重组表达载体，所用空载体为PTCK303。将目的基因连入pTCK303上的限制性内切酶Kpn I和BamH I酶切识别位点之间， 以及SpeI和McI酶切识别位点之间，得到重组表达载体。上述基因在培育耐低温转基因植物中的应用。首先构建含有SEQ ID NO :1所示基因的重组表达载体，然后利用所得重组表达载体构建转化体，再利用所得转化体转化目的植物，筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的与正常植物相比具有高抗寒性的转基因植物。所述目的植物为大豆。采用上述技术方案所产生的有益效果在于发明人通过大量科学研究证明本发明的基因对植物的低温胁迫具有应答性，证明其与植物的耐寒性具有紧密联系，基于此，利用现有常规基因工程方法能够得到具有高耐寒性的转基因植物，对提高作物的产量具有重大意义。
图1为低温胁迫下定量PCR检测到的GmICTl在大豆根及叶中的表达特征。图2以毛状根体系分析低温胁迫时GmICTl在大豆根中的表达模式分析。
具体实施例方式以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验， 结果取平均值。本发明的基因及其编码的蛋白质，来源于大豆属大豆(Glycine max L.)，将其命名为 GmICTl。实施例1、GmICTl基因的逆境及组织表达模式利用RT-PCR技术对GmICTl基因的逆境及组织表达模式进行分析验证；(1)、胁迫处理实验所用材料为威廉姆斯82 (简称W^)；幼苗期胁迫材料按照以下流程进行大豆种子用70%的洒精灭菌30S，dH20冲洗6遍后播种于无菌培养皿中，皿底置2张无菌滤纸，dH20浸湿，28°C暗萌发3天。芽长至2cm时，低N水培，10，OOOlux，温度为^TC,相对湿度为70%，培养15天，进行幼苗期胁迫处理，取材根、叶；①对照的处理直接取正常环境培养的大豆材料各组织于-80°C冻存作为对照(O小时) ’②)低温处理幼苗期或成株期材料在4°C分别处理0. 5、3、6、12及M小时后，取其各组织，于液氮速冻，-80°C 保存备用；(2)、mRNA的分离采用Trizol法提取大豆总RNA，①先将组织剪切成小块，放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织50-100mg加入1. 5mL离心管中然后加入Iml RNAVzol，裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体.室温放置5分钟；②加200 μ 1氯仿，振荡混勻，室温静置5min，12，000r/min，4°C离心IOmin ；③取500 μ 1上清于另一离心管，加等体积异丙醇，室温放置lOmin，12，OOOr/min，4°C离心IOmin ；④加入Iml 75%乙醇洗沉淀， 8，000r/min，4°C离心5min，重复两次；室温风干IOmin左右，加20 μ 1左右DEPC处理过的 RNase Free水(DEPC水)溶解沉淀；
(3)、反转录为cDNA 将提取的mRNA用!Iomega公司的反转录酶AMV反转录为 cDNA ；cDNA第一链的合成配置第一种混合液totalRNA,7y 1(2μ g) ；oligo dT (10 μ Μ)，3 μ 1 ；总体积 10 μ 1，PCR仪上70°C放置8min，立即置于冰上；配置第二种混合液5XBuffer，4y1 ；dNTPs(dATP, dGTP, dTTP, dCTP 2. 5mmol/ L each), 4 μ 1 ； RNase inhibitor (40U/μ 1) ,0. 5μ 1 ；RNase-free 水，0· 5 μ 1 ；M-MLV (200U/ μ D反转录酶， μ ι ；混勻，将第二种混合液加入到第一种混合液中，每管10μ 1，pcr仪上 42°C孵育90min，然后70°C，IOmin终止反应；(4)、利用RT-PCR技术对GmICTl基因的逆境及组织表达模式进行分析验证以上述cDNA作为模板，设计引物，以18srRNA为内参，使用TaKaRa公司出品的STOR Premix Ex TagTM进行定量PCR分析。在20 μ 1体系中加入cDNA模板2 μ 1、正反向引物各0. 4 μ 1、 SYBRPrimix Ex taqTM(2X) 10μ 1, ROX Reference Dye II (50 X) 0. 4 μ 1、ddH20 6. 8 μ L· 扩增程序为95°C 30s ；95°C 5s,60°C 34s,45cycles ；95°C 15s，60°C lmin，95°C 15s ；引物序列分别为qICTl-F 5' -AACTGGGTAATAAGTCGTTG-3，(SEQ ID NO 3)；qICTl-R 5' -CCGTAAACTGGTTGAGATC-3，(SEQ ID NO 4)；18srRNA-F 5' -CCTTGCTTGTTGCTTTACTAAAT-3，(SEQ ID NO 5)；18srRNA-R 5' -ATGCACCTTTTCGTTTGTTTCGGAG-3，(SEQ ID NO 6)；(5)、结果结果如图1所示，横坐标为4°C低温处理的时间点，纵坐标为GmICTl基因的相对表达量；低温处理0. 5小时后GmICTl基因的表达在大豆根及叶中均受到显著诱导，低温处理时间延长可以明显下调GmICTl基因的表达；结果表明，GmICTl基因参与了大豆对低温胁迫的响应过程。这样，可以利用空载体PEGAD或pTCK303等构建含有SEQ ID NO :1所示基因的重组表达载体，然后利用所得重组表达载体构建转化体，再利用所得转化体转化目的植物，筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的与正常植物相比具有高抗寒性的转基因植物。实施例2、gmictl基因的逆境及组织表达模式利用⑶S染色技术对GmICTl基因的逆境表达模式进行分析验证；(1)、gmictl启动子的克隆根据ICTl的Promoter的序列(ATG上游取1473bp，参见SEQ IDNO 2)设计引物对，根据载体PCAMBIA3301多克隆位点，引物末端分别引入EcoRI和NcoI酶切识别位点，以 CTAB法提取的大豆测序品种Williams82的DNA为模板，PCR扩增ICTl基因的启动子；引物序列为Pro-ICTl-F-EcoRI :CGGAATTC GAATGAACGGTTTGAAGGTG(SEQ IDNO :7)；Pro-ICTl-F-NcoI :CATGCCATGG TAGTTGCGACAAGAAGGGAG(SEQID NO :8)；PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化 1473bp左右的条带；连T载体(PMD19-T)，挑阳性克隆，测序；o)、重组表达载体的构建①提取含有正确测序的ICTlPromoter序列的T载体质粒，用限制性内切酶EcoRI和NcoI酶切，回收酶切产物；②用限制性内切酶EcoRI和NcoI酶切空载体pCAMBIA3301，回收载体骨架；③用T4连接酶将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接；④将步骤3的连接产物热激转化感受态DH5 α菌株，37°C过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pCAMBIA330I-Pmcti:⑶S ；(3)大豆材料准备及低温处理以W82大豆品种为材料，将材料用氯气消毒10小时后，在B5培养基上萌发4天进行毛状根转化，利用重组表达载体转化农杆菌GV3101，再利用农杆菌转化体转化目的植物， 得到转基因植物；外植体转至共培培养基上生长2天后，再转至MS/2培养基上培养，15天后，毛状根长出，选择发育阶段接近的长度约1-2厘米的毛状根分别在4°C处理0、3、6、12、 24小时后，取样进行GUS染色，染色时间限定为3小时；0)、⑶S染液的配制首先配制⑶S反应缓冲液Tris Buffer，其中包括IOOmM Tris和50mM NaCl，以浓盐酸调pH至7. 4。然后以iTris buffer配制0. 5mM K3 [Fe (CN)6]溶液。按lmg/ml的浓度称取x-glu (5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷)，按照每mg加入10 μ 1 DMSO ( 二甲基亚砜)的比例溶解x-glu，加入1Tris buffer配制的0. 5mM K3 [Fe (CN)6]溶液定容，可加入几滴TritonX-IOO以增强染色效果。迅速分装后于_20°C避光保存；(5)、⑶S 染色将待测定的毛状根取植物样品放入⑶S反应缓冲液中，浸没，37°C暗中保温。每隔半小时在解剖镜下观察显色效果。染色3小时后，吸出⑶S反应缓冲液，加入70%乙醇终止反应并在37°C脱色，每隔数小时更换一次；(6)、结果见图2，其中图 A 为转化了 pCAMBIA3301 (Control)和 PGmICTl GUS 的大豆毛状根中⑶S的积累量在4 °C低温处理0. 5小时前后的对比图片，图B是对有⑶S积累的毛状根占总毛状根数目的比率进行分析比对的结果。图2的结果显示，空载体 PCAMBIA3301 (Control)的转化根中GUS积累并未受到4°C低温处理0. 5小时的影响，而 PGmICTl: AUS的转化根中⑶S的积累量在4°C处理0. 5小时后出现了明显的增加；结果表明，GmICTl参与大豆根系对低温胁迫的响应。这样，可以利用空载体PEGAD或pTCK303等构建含有SEQ ID NO: 1所示基因的重组表达载体，然后利用所得重组表达载体构建转化体， 再利用所得转化体转化目的植物，筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的与正常植物相比具有高抗寒性的转基因植物。上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
权利要求
1.一种与植物耐低温相关的基因，其特征在于其具有序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述基因的重组表达载体，其特征在于所用空载体为PEGAD。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于将目的基因插入到PEGAD的限制性内切酶Sma I和BamH I酶切识别位点之间，得到重组表达载体。
4.含有权利要求1所述基因的重组表达载体，其特征在于所用空载体为PTCK303。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于将目的基因连入PTCK303上的限制性内切酶Kpn I和BamH I酶切识别位点之间，以及SpeI和McI酶切识别位点之间， 得到重组表达载体。
6.权利要求1所述的基因在培育耐低温转基因植物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于首先构建含有SEQIDNO :1所示基因的重组表达载体，然后利用所得重组表达载体构建转化体，再利用所得转化体转化目的植物，筛选阳性植株，经过三代筛选得到纯合的与正常植物相比具有高抗寒性的转基因植物。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述目的植物为大豆。
全文摘要
本发明公开了一种与植物耐低温相关的基因，其对植物的低温胁迫具有应答性，证明其与植物的耐寒性具有紧密联系，基于此，利用现有常规基因工程方法能够得到具有高耐寒性的转基因植物，对提高作物的产量具有重大意义。
文档编号C12N15/29GK102226192SQ20111015524
公开日2011年10月26日 申请日期2011年6月10日 优先权日2011年6月10日
发明者李东晓, 李霞, 王幼宁, 石磊, 陈亮 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所