专利名称：人源化鼠兔瘦素蛋白、编码该蛋白的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种人源化鼠兔瘦素蛋白、编码该蛋白的基因及其应用。
背景技术：
青藏高原特有的动植物资源在世界上是独一无二的。高寒、低氧、强紫外线辐射的极端压力环境给这里的动植物的生存带来了挑战，同时，在长期的适应进化过程中赋予了这些特有动植物独特的功能优势，以满足生存需要。因此，对极端环境特有动物的优势抗环境压力功能基因的保护和开发，具有极其重要的价值。鼠兔是青藏高原的特有种和关键种，对维持青藏高原生态系统平衡及生物多样性 起到重要作用，已成为土著动物对青藏高原极端压力环境生态适应机制研究的代表性物种。鼠兔是一种典型的冷适应动物，全球鼠兔主要分布在高海拔高纬度的寒冷地区。鼠兔分布的化石资料显示，随着全球气候的变暖，鼠兔的分布范围逐渐缩小，海拔逐渐增高。在长期的进化中，鼠兔形成了独特的生活方式和适应机制来应对高寒低氧的严酷环境，表现为提高氧利用率增强低氧耐受力，提高基础代谢率及非颤抖性产热能力增强低温耐受力。维持机体能量平衡涉及多个信号蛋白的共同参与，其中瘦素(Ieptin)蛋白是能量代谢调节的关键蛋白，是由ob基因编码的主要由白色脂肪组织分泌的激素，与分布于中枢神经和外周组织中的Ieptin受体结合，发挥多种重要的生物学功能，其中最主要的功能是调节机体能量代谢平衡，调节葡萄糖代谢，脂类代谢等。鉴于高原鼠兔严酷的生存环境、显著的能量代谢特征以及I印tin蛋白在能量调节中的关键作用，研究者曾对鼠兔Ieptin基因序列进行了克隆并进行了全面的分子进化分析，得出重要结论长期的适应进化过程中，鼠兔Ieptin蛋白发生了适应性的功能进化，而这种功能的改变更有助于鼠兔更好地耐受这种压力环境。鉴于I印tin蛋白在能量代谢调节中的关键作用，自1994年人ob基因首次被克隆以来，有关人ob基因生物工程产品不断地被开发和利用，已经深入到许多领域包括减肥药物的开发以及肥胖产品的深加工，抗糖尿病药物的研发等。随着对其功能的认识不断深入，有关Ieptin蛋白的产业化前景将更加广阔。然而目前国内外被开发和利用的Ieptin蛋白产品多是从普通环境中生活的人体中分离获得，而从冷环境压力下的特有冷适应动物体内分离的Ieptin蛋白却鲜有报道，然而，对其功能的研究不仅有助于人们认识动物对极端环境生态适应的机制，同时，也为开发和利用其产品提供了科学依据，这方面的研究目前在国内外均处于空白。此外，由于人体会对异种蛋白产生过敏反应，异种蛋白成分越高，发生过敏反应的几率越高，相反，人源化程度越高，发生过敏反应的几率就会明显降低。因此为尽量充分发挥鼠兔Ieptin蛋白的功能优势同时要减少过敏反应,构建人源化鼠兔Ieptin蛋白是一条有效途径
发明内容
本发明的目的是提供一种新的人源化鼠兔瘦素蛋白及编码该蛋白的基因。本发明的另一目的是提供上述人源化鼠兔瘦素蛋白及编码该蛋白的基因的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种人源化鼠兔瘦素蛋白，其具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第23位的Asp替换为Gly，或是将第122位的Glu缺失，或是在78位添加Ser均不会影响蛋白的功能。本发明还提供编码上述蛋白的基因，其具有SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。本发明还提供含有上述基因的载体以及含有该载体的宿主细胞。本发明还提供制备上述人源化鼠兔瘦素蛋白的方法，包括步骤I)采用PCR方法扩增编码人源化鼠兔瘦素蛋白的基因； 2)将扩增片段克隆至表达载体中，并在宿主菌中进行表达。其中，步骤2)中所述表达载体为pMAL_c2x(New England Biolabs,NEB公司)，所述宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。诱导表达的具体步骤为1)挑取经鉴定正确的含重组人源化鼠兔瘦素蛋白基因克隆的单菌落，在Iml含100μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C，220rpm震荡培养16-18h ；2)按照I : 100的体积比，将细菌培养物加入到新鲜的含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C震荡培养至细菌浓度达到OD6tltl = O. 4-0. 5 ；3)加入IPTG至终浓度为ImM，于25°C震荡培养20h，以诱导重组人源化鼠兔瘦素蛋白的表达。上述制备人源化鼠兔瘦素蛋白的方法中还包括对重组人源化鼠兔瘦素蛋白的纯化，具体步骤为a)离心收集菌体，重悬并破碎细胞后离心取上清，上清液经O. 22 μ m滤膜过滤b)将过滤后的上清液以5ml/min流速上样至预先用缓冲液A平衡后的Ni层析柱；c)上样结束后，用缓冲液A以相同的流速冲洗Ni柱，冲洗体积为50个柱体积；d)用缓冲液B洗脱目的蛋白，洗脱体积为5个柱体积，收集洗脱液；e)向洗脱液中加入TEV蛋白酶，4°C酶切过夜后，对酶切产物进行脱盐；f)将酶切产物重新上样至经缓冲液A平衡后的Ni柱中，收集流出液并对流出液进行脱盐。其中，缓冲液A:20mM Tris-Cl, 500mM NaCl，40mM 咪唑，PH = 8· 5 ;缓冲液 B :20mMTris-Cl,500mM NaCl, 500mM 咪唑，PH = 8. 5。本发明进一步提供上述人源化鼠兔瘦素蛋白、编码该蛋白的基因、含有该基因的载体或含有该载体的宿主细胞在制备降血糖降血脂药物中的应用。本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。(I)人工合成编码人源化鼠兔I印tin蛋白的核苷酸序列分子进化分析显示鼠兔I印tin蛋白有20个氨基酸位点为鼠兔家族所特有，其性质为适应性进化位点，提示这20个位点是导致鼠兔I印tin蛋白功能增强的关键位点。为此，本发明采用人工合成的方式，合成了以人I印tin基因序列为模板，在这20个位点参照鼠兔I印tin基因序列，构建了 20个位点为鼠兔I印tin基因序列的人源化I印tin蛋白基因序列 SEQ ID No. I gtg tec ate tgg aaagtc egg gat gac acc aaa acc ctc ate aag aca att gtc accagg ate aatgac att tea cacacg cat gca gtc tcc tcc aaa cag aaa ate acc ggt ttg gac ttc att cct gca ctccac ccc ate ctg acc tta tccaag atg gac cag aca ctg gtc ctc tac aaa cac ate ctc acc agt atg cct tcc agaaac gtg ate caa atatcc aacgac ctg gag aac ctc egg gat ctt ctt cac gtg ctg gcc gcc tct caa ggc tgccac cca ccc tgg gcc agt ggccts gag acc ctg_ gac agt ctg ggg Qgc gtc ctg_ gaa get tea ggc tac tcc aca gag gtggtg gcc ctg age aggctg cag ggg tct ctg cag gac atg ctg tgg cag ctg gac ctc age cct ggg tgctga其中，斜体下划线字体为鼠兔I印tin序列，其余为人I印tin序列。
其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示 Y SA W ^ R DDTKTLIKTIVTRINDISHT HA VSSKQK I TGLDFIP '￡ LHPILTLSKMDQTL VLY KH ILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLA ASQG CHPPffAS GLE ZLiD SLGSF LEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLffQLDLSPGC其中，斜体下划线字体为鼠兔I印tin序列，其余为人I印tin序列。(2)重组人源化鼠兔I印tin蛋白的制备本发明采用基因克隆、大肠杆菌原核表达、层析纯化的方法制备具有生物活性的重组人源化鼠兔I印tin蛋白。以往I印tin蛋白制备方法尽管大多是由原核表达体系，但表达出来的蛋白质多以无生物活性的包涵体形式存在，若要获得有生物活性的蛋白需要对包涵体进行复性。而本发明通过优化表达载体、菌株、诱导条件等措施，使得在大肠杆菌中诱导表达的蛋白质以可溶性的方式存在，直接进行分离纯化，即可获得具有生物活性的蛋白。(3)人源化鼠兔Ieptin蛋白改善血糖血脂的功能本发明建立了高糖高脂血症的动物模型，采用重组人源化鼠兔I印tin蛋白和人I印tin蛋白进行治疗，观察两种蛋白在改善血糖及降低血脂的疗效差异。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果(一)本发明首次提供了具有显著降血糖降血脂功能的人源化鼠兔I印tin蛋白及编码该蛋白的基因。(二)本发明通过可溶性表达方式制备重组人源化鼠兔I印tin蛋白，避免了因包涵体复性所引起的蛋白活性不稳定的不足，为重组Ieptin蛋白的制备提供了新方法。(三)对本发明的人源化鼠兔I印tin蛋白进行功能验证的结果表明在相同实验条件下，人源化鼠兔Ieptin蛋白与人Ieptin蛋白作用相似,可显著改善高血糖高脂血症小鼠的血糖水平及血脂水平，减少白色脂肪组织含量及白色脂肪组织中脂肪的堆积，但两种蛋白相比，人源化鼠兔Ieptin蛋白的作用优于普通人Ieptin蛋白，主要表现在降低高血糖高脂血症小鼠的血糖、总胆固醇、甘油三酯水平以及诱导糖代谢和脂代谢的调节基因的表达量等方面。
图I为本发明重组人源化鼠兔I印tin蛋白的SDS-PAGE电泳结果，其中，M为蛋白Marker, 1-5为重组人源化鼠兔Ieptin蛋白。图2为本发明重组人源化鼠兔I印tin蛋白对白色脂肪组织的影响，其中，A为PBS对照组，B为人源化鼠兔Ieptin蛋白治疗组。图3A-C分别为I印tin对高糖高血脂小鼠治疗前后血糖、血清甘油三酯、总胆固醇的影响，其中，a为人源化鼠兔leptin(human-pika)治疗组与PBS对照组相比具有显著性差异，P < O. 05 ；b为人源化鼠兔leptin治疗组与人leptin蛋白相比差异具有显著性，p< O. 05。图4为leptin蛋白对闻糖闻脂小鼠能量代谢调节关键基因表达的影响，其中，A-C分别为过氧化酶增殖剂激活Y受体(PPARY)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)，PPARy共激活因子a (PGC-a)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I人工合成人源化鼠兔I印tin基因序列采用人工基因合成的方法合成SEQ ID No. I序列，基因合成工作由上海生工生物工程有限公司完成。实施例2重组人源化鼠兔I印tin蛋白的制备I、实验材料及溶液配制(I)表达载体及工程菌用于表达重组鼠兔瘦素leptin蛋白的表达载体为pMAL_c2x (NewEnglandBiolabs, NEB公司)，工程菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。(2)试剂盒、工具酶及生化试剂限制性内切酶以及Taq酶均为大连宝生物工程公司产品，血生化检测试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司，酵母提取物(Yeast extract)和胰蛋白胨(Tryptone)为Oxford公司产品，其他抗生素及生化试剂为sigma公司产品。(3)蛋白纯化层析柱及其介质所有层析介质及其层析柱均为美国GE Healthcare公司产品。Ni亲和介质为NiSepharose 6 Fast Flow，层析柱为 XK 16/20 column,脱盐介质为 Sephadex G-25。(4)主要溶液的配制LB培养基(IL) =NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，PH = 7. O ；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)溶液lg IPTG溶于4. 2ml去离子水中，用0. 22μπι滤膜过滤除菌，_20°C保存；蛋白纯化溶液缓冲液A 20mM Tris-Cl, 500mM NaCl，40mM 咪唑，PH = 8. 5 ；缓冲液B 20mM Tris-Cl, 500mM NaCl，500mM 咪唑，PH = 8. 5 ；缓冲液C :含有5mM DTTUmM EDTA和10%甘油的PBS缓冲液，PH = 7. 4 ；所有蛋白纯化用溶液在使用前需要经0. 22 μ m滤膜过滤。2、重组人源化鼠兔I印tin蛋白制备过程(I)重组人源化鼠兔I印tin蛋白表达载体的构建
I)采用PCR方法扩增已人工合成的实施例I的人源化鼠兔I印tin蛋白的核苷酸序列，扩增引物为上游引物:5，ccg RRa tcc gtg tcc atctgg aaa gtc cgg_3’，下游引物5’ -ccg ctc RaR gca ccc agg get gag gtccag-3’，下划线处为限制性内切酶酶切位点，上游引物含有BamH I位点，下游引物含有Xho I酶切位点。将PCR扩增片段经BamH I和XhoI两个酶切位点，克隆入pMAL-c2x表达载体中，挑取单菌落，提取重组质粒酶切鉴定后，进行进一步的序列测定。(2)重组人源化鼠兔I印tin蛋白的诱导表达I)挑取经鉴定正确的含重组人源化鼠兔I印tin基因克隆的单菌落，在Iml含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C，220rpm震荡培养过夜(16_18h)。2)按照I : 100的体积比，将细菌培养物加入到新鲜的LB培养基(含有相同浓度 的氨苄青霉素)中，于37°C震荡培养，直至细菌浓度达OD6tltl = O. 4-0. 5。3)加入IPTG至终浓度为ImM，于25°C震荡培养20h，以诱导重组鼠兔瘦素I印tin蛋白的表达。4)采用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定重组蛋白的表达情况，结果如图I所示。(3)重组鼠兔I印tin蛋白的纯化细菌的收集破碎I) 4°C, 8000rpm 离心 5min,收集菌液。2)用缓冲液A重悬菌体后，4°C，8000rpm离心收集菌体。重复一次。3)按5ml/g菌体湿重比例用含有IOmM β -巯基乙醇和100 μ M的PMSF的缓冲液A重悬菌体，采用超声波或高压冲击法在低温下破碎细胞。4)将破碎后的细菌，于4°C，16000rpm离心lh，取上清液，经O. 22 μ m滤膜过滤后
用于蛋白亲和纯化。重组鼠兔I印tin蛋白的亲和层析l)Ni亲和层析柱的平衡用缓冲液A平衡填充有Ni Sepharose 6Fast Flow介质的XK 16/20 column (简称Ni柱)。洗脱体积为20个柱体积(CV)。2)将过滤后的细菌裂解物以5ml/min流速上样至预先用缓冲液A平衡后的Ni层析柱。3)上样结束后，用缓冲液A以相同的流速缓慢冲洗Ni柱，冲洗体积为50CV，以除去未与Ni柱充分结合的蛋白。4)用缓冲液B —次性洗脱目的蛋白，洗脱体积为5CV，该洗脱下来的蛋白即为含有His标签以及MBP蛋白的重组人源化鼠兔I印tin融合蛋白。His-tag和MPB-tag标签蛋白的去除I)将洗脱下来融合蛋白溶液加入TEV蛋白酶，4°C低温下进行酶切过夜，以切除含有His (6)和麦芽糖结合蛋白(MPB)的融合蛋白肽段。2)将酶切产物进行脱盐换液，以缓冲液A置换酶切反应体系中的缓冲液B溶液。目的去除反应液中高浓度的咪唑。3)将脱盐后的酶切反应液，重新上样至经缓冲液A平衡后的Ni柱中，收集流出液，该溶液为含有重组人源化鼠兔leptin蛋白纯品。4)将含有重组人源化鼠兔I印tin蛋白纯品溶液经脱盐换液,置换为缓冲液C溶液，最后将蛋白溶液经液氮速冻后，转移至-80°C冰箱后保存备用。实施例3人源化鼠兔leptin蛋白在改善血糖血脂中的应用I、闻糖闻脂血症小鼠丰旲型建立(I)实验动物雄性断乳(21天)小鼠40只，体重25g左右(购自河北医科大学实验动物中心)。单笼喂养，室温18 25°C .相对湿度50% 80%。每日光照12小时，自由摄食、饮水。适应3天后，经内眦取血，分离血清，测定基线生化指标。(2)高脂饲料配方制成含猪油28%，白糖30%，奶粉1%，鸡蛋黄18%，基础饲料33 %的闻脂词料。 (3)高脂高糖动物模型的建立过程将小鼠给与高脂饲料喂饲连续8周，每周测定一次空腹血糖、甘油三酯和总胆固醇水平。第8周末禁食12小时后，经腹腔内一次性注射链脲佐菌素STZ (STZ100mg/kg体重，用O. lmol/L无菌柠檬酸缓冲液pH4. 4配制，O. 2 μ m微孔滤膜过滤灭菌)；继续喂养1_2周后。取血测定空腹血糖，挑选出高血糖、高血脂的模型动物，将其随机分为三组，人源化鼠兔leptin 蛋白组(简称 hum-pika leptin)、人 leptin 蛋白组(hum leptin)和 PBS 缓冲液对照组(PBS)，每组10只，用于治疗试验。2、重组I印tin蛋白治疗过程每日17:30-18:00，经腹腔注射给药，剂量为10 μ g/g体重，对照组给与等体积的PBS缓冲液，持续注射8周，试验结束时禁食12h，摘眼球取血，分离血清，用于生化指标测定。取部分肝脏组织，经液氮速冻后，转入-80°C冰箱保存备用。3、血清生化指标测定(I)血葡萄糖测定采用中生北控生物科技股份有限公司生产的葡萄糖液体单试剂盒测定I)实验参数(表I)表I
温度37°C样品用量3μ I~
波长500nm 工作液用量300 μ I
反应时间10分钟测定光径I. Ocm2)测试程序(表2)表权利要求
1.人源化鼠兔瘦素蛋白，其特征在于，其具有SEQID No. 2所不的氣基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求I所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID No. I所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.制备权利要求I所述人源化鼠兔瘦素蛋白的方法，其特征在于，包括步骤 1)采用PCR方法扩增权利要求2的基因； 2)将扩增片段克隆至表达载体中，并在宿主菌中进行诱导表达。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述表达载体为pMAL-c2x，所述宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，诱导表达的具体步骤为 1)挑取经鉴定正确的含重组人源化鼠兔瘦素蛋白基因克隆的单菌落，在Iml含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C，220rpm震荡培养16_18h ； 2)按照I: 100的体积比，将细菌培养物加入到新鲜的含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C震荡培养至细菌浓度达到OD6tltl = O. 4-0. 5 ； 3)加入IPTG至终浓度为ImM，于25°C震荡培养20h，以诱导重组人源化鼠兔瘦素蛋白的表达。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括重组人源化鼠兔瘦素蛋白的纯化，具体步骤为 a)离心收集菌体，重悬并破碎细胞后离心取上清,上清液经O.22 μ m滤膜过滤 b)将过滤后的上清液以5ml/min流速上样至预先用缓冲液A平衡后的Ni层析柱； c)上样结束后，用缓冲液A以相同的流速冲洗Ni柱，冲洗体积为50个柱体积； d)用缓冲液B洗脱目的蛋白，洗脱体积为5个柱体积，收集洗脱液； e)向洗脱液中加入TEV蛋白酶，4°C酶切过夜后，对酶切产物进行脱盐； f)将酶切产物重新上样至经缓冲液A平衡后的Ni柱中，收集流出液并对流出液进行脱盐； 其中，缓冲液 A:20mM Tris-Cl, 500mM NaCl，40mM 咪唑，PH = 8· 5 ;缓冲液 B :20mMTris-Cl,500mM NaCl，500mM 咪唑，PH = 8. 5。
10.权利要求I所述的蛋白、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备降血糖降血脂药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种人源化鼠兔瘦素蛋白及编码该蛋白的基因，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。本发明还提供了上述可溶性重组人源化鼠兔瘦素蛋白的表达及纯化方法。本发明建立了高糖高脂血症的动物模型，采用重组人源化鼠兔leptin蛋白和人leptin蛋白进行治疗，结果表明与人leptin蛋白相似，人源化鼠兔leptin蛋白可明显降低血糖浓度及血清总胆固醇、甘油三酯水平；降低内脏白色脂肪组织含量及细胞内脂肪的堆积，促进肝脏中参与糖代谢和脂代谢的关键基因的表达量。与重组人leptin蛋白相比，人源化鼠兔leptin蛋白在改善血糖降低血脂的作用更为显著。
文档编号C12N15/63GK102827267SQ20111015851
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者杨洁, 赵新全 申请人:中国科学院西北高原生物研究所