专利名称：一种尼罗罗非鱼胆囊收缩素及其编码核酸和功能八肽的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种尼罗罗非鱼的新蛋白及其编码核酸，同时，本发明还涉及该新蛋白的一个八肽残基的应用。
背景技术：
罗非鱼(D7a/7ia)，俗称非洲鲫鱼，隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科Cichlidae、 罗非鱼属Tilapia(亦称丽鲷科，丽鲷属)。罗非鱼作为鳕鱼的替代品，国际市场的需求量不断增加。在全球淡水鱼贸易中，罗非鱼占第3位，仅次于鲑鱼和鳟鱼，具有极高的经济价值。随着养殖和出口规模的不断扩大，对饵料配置的要求也不断提高，由于饲料成本不断增加，研究趋向于以植物蛋白代替鱼粉来减少成本。但是鱼类摄入植物蛋白饲料，会出现摄食量减少、体重减轻的现象，这种结果与初衷相悖。然而，罗非鱼摄食调节机制尚未研究清楚， 虽然许多肽类被证实可以影响鱼类摄食，如NPY，orexin，ghrelin，黑色素聚集素(melanin concentration hormone, MCH)等促摄食因子，铃蟾肽(bombesin，BBS), Ieptin 等抑摄食因子。但是，鱼类中对于激素调节摄食还没有深入。胆囊收缩素(Cholecystokinir^CCK)，是一种由小肠黏膜I细胞和中枢神经细胞分泌的脑肠肽。它由人类基因组中单基因编码，产生的前体蛋白可以剪切成多种形式，广泛存在于胃肠道，中枢以及外周神经系统，并以神经递质或神经调制的形式参与调节痛觉感受、食欲和垂体激素释放等重要的生理作用，在消化系统能够促进胰酶分泌和胆囊收缩， 减缓胃排空，增强小肠和结肠运动等多方面功能。鉴于CCK在哺乳动物中的重要功能，更多学者关注CCK在鱼类中的功能，目前已经在多种鱼类中克隆出CCK CDNA，发现在鱼类中存在其它形式CCK cDNA前体，证实鱼类CCK具有和高等动物相似的功能，如抑制食物摄入， 促进胰酶分泌和胆囊收缩，短期促进生长激素分泌等。现有的研究中，并未发现可调节罗非鱼摄食和胃肠消化短肽。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种尼罗罗非鱼胆囊收缩素。本发明的另一个目的在于提供一种编码上述蛋白的核酸序列。本发明的再一个目的是提供上述尼罗罗非鱼胆囊收缩素八肽残基在调节罗非鱼摄食和胃肠消化中的应用。本发明所采取的技术方案是
一种尼罗罗非鱼胆囊收缩素，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。编码上述尼罗罗非鱼胆囊收缩素的核酸序列，特别的，其序列如SEQ ID N0:2所示。该序列的克隆方法包括如下步骤
提取尼罗罗非鱼全脑的总RNA，反转录得到cDNA ；通过RT-PCR和RACE的方法获得cDNA 全长，最后以反转录得到的 cDNA 为模板，以 CCK-2-QF 5‘-GATCTCTCCCTTCTCCCAGCC-3‘(SEQID NO :4)和 CCK-2-QR :5，-TAATCTCTGTCCTTTATCCTGTG-3，(SEQ ID NO :5)为引物，扩增得到其开放读码框。尼罗罗非鱼胆囊收缩素的C-末端八肽DYLGWMDF (SEQ ID NO :3)在调节罗非鱼摄食和胃肠消化中的应用。本发明的有益效果是
本发明提供的新型尼罗罗非鱼胆囊收缩素及其编码核酸序列，为阐明CCK在鱼类消化以及在摄食过程中所发生的作用提供理论基础，为将来开发鱼类新型饲料添加剂提供一些基因资源。C-末端八肽DYLGWMDF经腹腔注射后，可以刺激罗非鱼幽门盲囊淀粉酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶原以及脑中摄食因子NPY和orexin表达，具有调节摄食和胃肠消化的双重作用，有望作为一种新型的饲料添加剂，使罗非鱼可以更有效地利用植物蛋白，进而降低罗非鱼的生产成本。
图1是CCK-2中间片段克隆电泳结果； 图2是CCK-2 3’ RACE克隆电泳结果；
图3是CCK-2 5’ RACE克隆电泳结果； 图4是CCK-2 ORF克隆电泳结果；
图5是淀粉酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶原cDNA部分片段克隆电泳结果； 图6是淀粉酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶原溶解曲线结果； 图7是淀粉酶mRNA表达水平结果； 图8是胰蛋白酶mRNA表达水平结果； 图9是胃蛋白酶原mRNA表达水平结果； 图10是NPY和orexin部分片段克隆电泳结果； 图11是NPY和orexin溶解曲线结果； 图12是NPY mRNA表达水平结果； 图13是orexin mRNA表达水平结果。
具体实施例方式本发明采取RT-PCR和RACE技术进行克隆。首先利用hvitrogen公司产品Trizol Reagent进行全脑总RNA的提取，再利用Toyabo公司产品Rever Tra Ace-a-Tm First Strand cDNA Synthesis Kit进行RT-PCR，最后用设计好的简并引物进行该基因cDNA部分片段的克隆。获得部分片段后，利用TaKaRa公司TdT加尾试剂盒在cDNA3’末端加上一段dCTP，设计cDNA5’末端特异引物，并与接头引物AAU和AUAU —起进行5’ RACE。利用 CL0NTECH 公司的产品 SMART 3，RACE 反转录酶 SMARTScribe Reverse Transcriptase 进行反转录，利用接头引物UPM (包括Long-UPM和Short-UPM)进行3’ RACE。最后在3’和5’ 非编码区设计特异引物，进行开放读码框ORF的克隆，确定序列。下面结合实施例，进一步说明本发明。尼罗罗非鱼CCK-2 cDNA的克隆(1)引物设计
把已获得的尼罗罗非鱼CCK-I序列(前期实验获得，已发表GenBank: HM222539. 1)， 和鲑鱼、黑青斑河豚、虹鳟序列进行比对，找到鲑鱼、黑青斑河豚、虹鳟同源性较高但是与 CCK-I同源性较低的位置设计简并引物，根据已获得的中间片段，设计CCK-2 RACE特异引物。(2)尼罗罗非鱼CCK-2 cDNA中间片段克隆
利用 Toyobo 公司的 Rever Tra Ace-a-Tm First Strand cDNA Synthesis Kit,把总 RNA合成第1条链cDNA。中间片段PCR扩增按照Toyobo公司产品聚合酶blend tap plus 进行。第一轮PCR反应条件94°C 3min ；94 V 15s, 62 °C (每循环降落0.3 V )15s，72 "C 30s，40 个循环；72 "C 7min。第二轮 PCR 反应条件94°C 3min ；94 "C 15s，58°C 15s, 72 "C 30s，40 个循环；72 "C 3min。CCK-2中间片段克隆电泳结果如图1所示，经过第一轮PCR，在300bp到400bp之间出现了预期条带，第二轮在200bp到300bp之间嵌套出预期条带。把第一轮的预期条带回收测序得到38^p的片段，经blast比对证明为CCK-2序列。(3)尼罗罗非鱼 CCK-2 3，RACE 和 5，RACE
3，末端根据Clontech公司RACE试剂盒进行，3，RACE PCR反应条件第一轮94°C 3min ；94 "C 15s，温度梯度(56°C，58°C，60°C，62°C ) 15s，72 "C 40s，40 个循环；72 "C lOmin。第二轮94°C 3min ；94 "C 15s，58°C 15s, 72 "C 40s，40 个循环；72 "C IOmint^lJ 用已设计的RACE引物与接头引物AUAP，AAP扩增CCK-I 5’末端序列，5，RACE PCR反应条件第一轮 P:94°C 3min ；94 "C 15s，58°C 15s, 72 "C 30s，40 个循环；72 "C 5min。第二轮94°C 3min ；94 "C 15s，58°C 15s, 72 "C 30s，40 个循环；72 "C 5min。CCK-2 3'RACE 和5’RACE克隆电泳结果分别如图2和3所示，获得长度分别为421bp和33^p的片段，与 CCK-2中间片段重合部完全相同。(4)尼罗罗非鱼开放读码框(Opening Reading Frame, ORF )的克隆
在3’和5’的非编码区设计上下游特异引物克隆CCK-2 ORF序列，PCR反应条件为 940C 3min ；94 "C 15s, 58 "C 15s, 72 "C 30s，40 个循环；72 "C IOmin0 在第一轮出现 500bp的预期条带，经回收测序为489bp。结果如图4所示。CCK-2的ORF克隆片段经测序大小为5(^bp，0RF长度为3%bp，编码一个132aa的前体蛋白。这个前体蛋白包括一个推测的20个氨基酸的信号肽和112个氨基酸的成熟肽， C-末端八肽(CCK-8) :DYLGWMDF,以及胃泌素结构域。CCK-8对淀粉酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶原以及中枢摄食因子NPY，orexin的影响 (1)实验设计
CCK-8蛋白由^witrogen公司合成。实验设计方案为，尼罗罗非鱼200尾，体重 40-60g，驯养期间，每天投喂2次，上午9:30和下午16:30，按照体重2%进行投喂，驯养10 天后，饥饿5天，饥饿5天后的尼罗罗非鱼，在注射前先将鱼麻醉处理，将鱼用麻醉剂丁香酚处理 3-%iin，把 CCK 八肽溶解在 PBS 里，剂量分别 10ng/g，100ng/g, 1000ng/g Bff fish。实验分组如下表
权利要求
1.一种尼罗罗非鱼胆囊收缩素，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.编码权利要求1所述尼罗罗非鱼胆囊收缩素的核酸序列。
3.根据权利要求2所述的编码权利要求1所述尼罗罗非鱼胆囊收缩素的核酸序列，其特征在于所述序列如SEQ ID N0:2所示。
4.权利要求1所述尼罗罗非鱼胆囊收缩素的C-末端八肽DYLGWMDF(SEQID NO :3)在调节罗非鱼摄食和胃肠消化中的应用。
5.根据权利要求3所述的尼罗罗非鱼胆囊收缩素的核酸序列，其特征在于其克隆方法包括如下步骤提取尼罗罗非鱼全脑的总RNA，反转录得到cDNA ；通过RT-PCR和RACE的方法获得cDNA 全长，最后以反转录得到的 cDNA 为模板，以 CCK-2-QF 5‘-GATCTCTCCCTTCTCCCAGCC-3‘(SEQ ID NO :4)和 CCK-2-QR :5，-TAATCTCTGTCCTTTATCCTGTG-3，(SEQ ID NO :5)为引物，扩增得到其开放读码框。
全文摘要
本发明提供一种尼罗罗非鱼胆囊收缩素及其核苷酸序列，克隆方法和应用。本发明中编码尼罗罗非鱼胆囊收缩素的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明还提供CCK-8八肽序列在消化摄食方面的应用，将CCK-8多肽腹腔注射罗非鱼后，发现CCK-8能够促进尼罗罗非鱼幽门盲囊分泌淀粉酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶原，下丘脑分泌NPY和orexin。本发明为阐明CCK在鱼类消化以及在摄食过程中所发生的作用提供理论基础，为将来开发鱼类新型饲料添加剂提供一些基因资源。
文档编号C12N15/16GK102241761SQ201110158899
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者李文笙 申请人:中山大学