专利名称：一种耐热糖化酶gai及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及ー种耐热糖化酶GAI及其基因和应用。
背景技术：
糖化酶,即葡萄糖淀粉酶(glucoamylase,EC. 3. 2. I. 3),是淀粉水解过程中的重要酶。糖化酶是ー种外切型糖苷酶，主要作用是从非还原端水解淀粉、糊精、糖原等碳链上的α-1,4糖苷键和α -I，6糖苷键，切下ー个个葡萄糖単元，并使水解下来的葡萄糖发生构型变化，得到终产物β-D-葡萄糖。另外糖化酶也能微弱水解α_1，3糖苷键。糖化酶是世界上生产量最大、应用范围最广的酶制剂。不仅用于酒类和燃料酒精的生产，还广泛用于葡萄糖、果糖衆、有机酸、味精等食品エ业的多个领域(Polakovic and Bryjak, 2004, BiochemEng J18 :57-64)。糖化酶广泛的存在于动物、植物和微生物中。其中微生物是糖化酶的重要来源(Pardeep K and Satyanarayana T,2009, Crit Rev Biotechnol 29:225-255)。エ 属(Saccharmyces)中获得的。随着基因工程技术的广泛应用，很多糖化酶基因已被克隆并进行了异源表达(Pardeep K and Satyanarayana T, 2009, Crit Rev Biotechnol 29:225-255)。报道的糖化酶多属于糖苷水解酶15家族(Henrissat B et al. 1991, BiochemJ) ο 一般由催化域(catalytic domain, CD)、淀粉结合域(starch-binding domain, SBD)以及连接⑶与SBD的O-糖基化连接域(0-glycosylated linker domain)组成。不同微生物所产生的糖化酶的pH适性、耐热性、催化特性等也不相同。目前对糖化酶性质的測定主要集中在最适温度和最适PH值的研究上，エ业上应用的糖化酶多是应用它的热稳定性。大多数真菌糖化酶的最适反应PH值为4. 5-5. 0，在酸性条件下稳定。最适反应温度为 40-60 °C (Norouzian D et al. 2006, Biotechnol Adv 24:80-85)。目前，也有最适温度为70°C的糖化酶的报道，分别来源于Trichoderma Reesi(Fagerstrom R et al. 1995, Biotechnol Appl Biochem 21 :223-231)、Taiaromycesemersonii(Nielsen BR. 2002, Protein Expression and Purification 26:1-8)、Scytalidium thermophiIium(Aquino ACMM et al. 2001,Folia Microbiol 46 :11-16)等。筛选耐热糖化酶或克隆表达耐热糖化酶基因，提高糖化酶的作用温度，会使淀粉糖化过程像淀粉液化那样在短时间内完成，从而降低能源消耗及生产成本，将给糖化酶在エ业中的应用开辟更为广阔的前景，具有重要的商业价值。
发明内容
本发明目的是提供一种耐热糖化酶。本发明的再一目的是提供上述编码上述糖化酶的基因。本发明的再一目的是提供包含上述糖化酶编码基因的重组载体。本发明的再一目的是提供包含上述糖化酶基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供ー种制备耐热糖化酶的方法。本发明的再一目的是提供上述耐热糖化酶的应用。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供ー种耐酸、耐热的性质优良的新糖化酶。本发明人从Bispora sp. MEY-1CGMCC 2500得到ー个新的耐热、耐酸、作用PH广的糖化酶。它所产生的糖化酶适合于在酒类和燃料酒精的生产、葡萄糖、果糖浆、有机酸、味精等食品エ业的等多个行业中使用。
本发明从上述菌株中获得了一种耐热糖化酶GAI，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示I MQVSTCLFAL CSAVLAAPRQ ENLLRRATGS LTSffLAAESP IALQGVLNNI51 GPNGVDAPGA DSGMVVASPD QVNPDYFYSff TRDSALTFKC LTDQFLAYGT101SGLEAQIRDY VNAQAAVQTI ENPSGGLCTG GLGEPKFYLN QTAFFGPffGR151PQRDGPALRA TALIAYARYL ISQGESSSVS SIIffPIVQND LSYVTQYffND20ITTFDLffEEID SSSFffTTAVQ YRALIEGNTL AGQIGESCSN CVSQAPNVLC25IFLQSYffNGEY IVANTGGGRS GKDSNTILAS IHVFDPDASC DDNTFQPCSD301KMLANHKVLT DSFRSIYSIN SGISEGSGVA VGRYPEDTYQ GGNPffYLCTM351AAAELLYDAV YQffKRIGSLN VTSTSLAFFQ AIYPSAAVGT YSSSSSTFDS401IIDAVMTYGD SYMSIAEKYT PSNGSLSEQF SKTTGSPLSA YDLTffSFAAF451LTAYNARAAA MPASffGAASA SLPSSCSGSS ASGPCSTATA TFTSGTLTPT501CSAQPSTTVI FNELVTTTYG TNIYLTCDNS ELGNWSTGSE AVPCSASAYT55ISTNPLffYCVA TLPAGTDIQY KFIQVASDGT VTffESGSNRE YTVPSNCAGV601AEVNDSWQ*其中，该酶蛋白全长608个氨基酸和ー个终止密码子，N端16个氨基酸为其预测的信号肽序列 “MQVSTCLFALCSAVLA ”。因此，成熟的糖化酶GAI的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 I APRQENLLRR ATGSLTSffLA AESPIALQGV LNNIGPNGVD APGADSGMVV51 ASPDQVNPDY FYSffTRDSAL TFKCLTDQFL AYGTSGLEAQ IRDYVNAQAA101VQTIENPSGG LCTGGLGEPK FYLNQTAFFG PffGRPQRDGP ALRATALIAYI5IARYLISQGES SSVSSIIffPI VQNDLSYVTQ YffNDTTFDLff EEIDSSSFffT201TAVQYRALIE GNTLAGQIGE SCSNCVSQAP NVICFIQSYff NGEYIVANTG251GGRSGKDSNT ILASIHVFDP DASCDDNTFQ PCSDKMLANH KVLTDSFRSI301YSINS6ISEG SGVAVGRYPE DTYQGGNPffY LCTMAAAELL YDAVYQffKRI351GSLNVTSTSL AFFQAIYPSA AVGTYSSSSS TFDSIIDAVM TYGDSYMSIA401EKYTPSNGSL SEQFSKTTGS PLSAYDLTffS FAAFLTAYNA RAAAMPASffG451AASASLPSSC SGSSASGPCS TATATFTSGT LTPTCSAQPS TTVIFNELVT501TTYGTNIYLT ⑶NSELGNWS TGSEAVPCSA SAYTSTNPLff YCVATLPAGT551DIQYKFIQVA SDGTVTffESG SNREYTVPSN CAGVAEVNDS WQ*成熟蛋白由592个氨基酸和ー个终止密码子组成，理论分子量为63. 3kDa，该酶属于糖基水解酶第15家族。将推导出的糖化酶氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，该基因与来源于Aureobasidium pul Iulans的糖化酶序列一致性最高为64. 2 %。说明GAI是ー种新的糖化酶。本发明提供了编码上述耐热糖化酶的基因。该酶基因全长2001bp，序列如SEQ ID NO. 3所示I ATGCAAGTAT CAACTTGCCT ATTTGCGCTA TGCAGCGCTG TTCTTGCTGC TCCAAGGCAG61 GAAAATCTGT TACGGCGTGC TACGGGAAGC CTCACCTCCT GGCTGGCTGC TGAGAGTCCG121 ATCGCACTCC AAGGTGTCCT CAACAACATT GGACCGAATG GGGTTGATGC TCCGGGCGCT181 GATTCCGGAA TGGTCGTAGC CTCTCCAGAT CAGGTGAACC CAGACTACTTTTACAGTTGG241 ACTCGAGATT CTGCATTGAC GTTCAAATGT CTTACTGACC AGTTCCTGGC ATACGGGACT
301 TCGGGGTTGG AGGCTCAGAT ACGGGATTAT GTCAATGCCC AGGCTGCGGTGCAGACAATC361 GAAAACCCTT CAGGAGGGTT GTGCACGGGT GGGTTGGGAG AGCCAAAGTTCTACCTCAAC421 CAAACCGCCT TCTTTGGGCC CTGGGGACGG CCCCAACGAG ATGGCCCCGC CCTTCGTGCT481 ACAGCGCTCA TTGCCTATGC ACGGTACTTG ATCTCTCAGG GGGAAAGCTC GTCGGTTTCT541 TCCATCATCT GGCCCATTGT GCAAAACGAT CTTTCCTACG TGACGCAGTA TTGGAATGAT601 ACAACCTTTG ATCTTTGGGA AGAAATAGAC AGCTCGTCCT TTTGGACGAC AGCCGTACAG661 TACCGGGCTC TCATTGAGGG AAACACTCTC GCCGGTCAGA TCGGAGAGAG CTGCAGCAAC721 TGTGTCTCGC AAGCCCCTAA TGTCTTGTGC TTCCTTCAGT CGTACTGGAA TGGAGAATAT781 ATCGTCGCAA ATACTGGCGG GGGCAGAAGT GGCAAAGACT CTAACACAATCCTCGCCAGC841 ATTCATGTCT TCGACCCCGA TGCTTCCTGC GATGACAATA CCTTCCAACC CTGCTCAGAC901 AAGATGCTTG CCAATCACAA GGTGCTGACC GACTCGTTTC GATCCATCTA TTCTATCAAT961 AGCGGAATCT CGGAGGGCAG CGGCGTTGCC GTTGGCCGTT ACCCTGAGGA CACATATCAA1021GGTGGAAATC CGTGGTATGC CCCCAACGAA CCCTTACTAC CTGTGTGCATAGTCTGGATG1081TGTCACGCAG GTACTTGTGC ACCATGGCCG CCGCCGAGTT ATTATACGATGCAGTCTATC1141AGTGGAAAAG GATTGGCTCG CTGAATGTGA CGTCCACCTC TCTCGCTTTC TTCCAAGCCA1201TTTATCCATC TGCAGCTGTT GGAACGTACT CTTCATCTTC GAGTACTTTC GACTCCATTA1261TTGATGCTGT TATGACGTAC GGGGATAGCT ATATGTCGAT CGCCGTATGTTAGAGCTGTG1321CCATCAAAAG TGTTACTCCT GACTAACTTG ATTTGGCCCT CCAGGAAAAG TACACACCTT1381CCAATGGCTC TTTATCTGAG CAATTTTCAA AGACGACGGG ATCACCTCTG TCGGCTTATG1441ACCTGACATG GTCGTTCGCT GCTTTTCTGA CTGCTTATAA TGCTCGAGCA GCCGCCATGC1501CAGCATCTTG GGGCGCTGCA TCAGTAAGGG AGAAGCAAAA AATAACTAAA GAGTAACCAC1561CGTCAGCTGA CATTGTTATA GGCATCACTG CCATCATCAT GTTCGGGAAG CTCGGCATCC1621GGACCATGTT CCACGGCAAC GGCCACCTTC ACATCTGGCA CTTTAACCCC TACTTGCTCA1681GCCCAACCAT CCACAACTGT AATTTTTAAC GAGCTCGTAA CGACTACATA TGGCACGAAT1741ATCTATCTTA CTGGCGACAA TTCTGAGCTG GGGAACTGGA GCACTGGCTC TGAAGCCGTT1801CCATGTTCTG CGTCGGCATA CACATCCACC AATCCGCTCT GGTATTGTGTTGCCACGTTA1861CCCGCTGGGA CTGACATCCA ATACAAATTC ATACAAGTGG CTTCAGATGG TACAGTCACT1921TGGGAGAGCG GGTCAAACAG GGAATACACC GTCCCTTCTA ACTGTGCAGG GGTTGCTGAG1981GTGAATGATA GTTGGCAGTA A本发明提供了编码上述耐热糖化酶的cDNA序列，全长1827bp，如SEQ ID NO. 4所
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I ATGCAAGTAT CAACTTGCCT ATTTGCGCTA TGCAGCGCTG TTCTTGCTGC TCCAAGGCAG61 GAAAATCTGT TACGGCGTGC TACGGGAAGC CTCACCTCCT GGCTGGCTGC TGAGAGTCCG121 ATCGCACTCC AAGGTGTCCT CAACAACATT GGACCGAATG GGGTTGATGC TCCGGGCGCT181 GATTCCGGAA TGGTCGTAGC CTCTCCAGAT CAGGTGAACC CAGACTACTT TTACAGTTGG241 ACTCGAGATT CTGCATTGAC GTTCAAATGT CTTACTGACC AGTTCCTGGC ATACGGGACT301 TCGGGGTTGG AGGCTCAGAT ACGGGATTAT GTCAATGCCC AGGCTGCGGT GCAGACAATC361 GAAAACCCTT CAGGAGGGTT GTGCACGGGT GGGTTGGGAG AGCCAAAGTT CTACCTCAAC421 CAAACCGCCT TCTTTGGGCC CTGGGGACGG CCCCAACGAG ATGGCCCCGC CCTTCGTGCT
481 ACAGCGCTCA TTGCCTATGC ACGGTACTTG ATCTCTCAGG GGGAAAGCTC GTCGGTTTCT541 TCCATCATCT GGCCCATTGT GCAAAACGAT CTTTCCTACG TGACGCAGTA TTGGAATGAT601 ACAACCTTTG ATCTTTGGGA AGAAATAGAC AGCTCGTCCT TTTGGACGAC AGCCGTACAG661 TACCGGGCTC TCATTGAGGG AAACACTCTC GCCGGTCAGA TCGGAGAGAG CTGCAGCAAC721 TGTGTCTCGC AAGCCCCTAA TGTCTTGTGC TTCCTTCAGT CGTACTGGAA TGGAGAATAT781 ATCGTCGCAA ATACTGGCGG GGGCAGAAGT GGCAAAGACT CTAACACAAT CCTCGCCAGC841 ATTCATGTCT TCGACCCCGA TGCTTCCTGC GATGACAATA CCTTCCAACC CTGCTCAGAC901 AAGATGCTTG CCAATCACAA GGTGCTGACC GACTCGTTTC GATCCATCTA TTCTATCAAT961 AGCGGAATCT CGGAGGGCAG CGGCGTTGCC GTTGGCCGTT ACCCTGAGGA CACATATCAA1021GGTGGAAATC CGTGGTACTT GTGCACCATG GCCGCCGCCG AGTTATTATA CGATGCAGTC1081TATCAGTGGA AAAGGATTGG CTCGCTGAAT GTGACGTCCA CCTCTCTCGC TTTCTTCCAA1141GCCATTTATC CATCTGCAGC TGTTGGAACG TACTCTTCAT CTTCGAGTAC TTTCGACTCC1201ATTATTGATG CTGTTATGAC GTACGGGGAT AGCTATATGT CGATCGCCGA AAAGTACACA1261CCTTCCAATG GCTCTTTATC TGAGCAATTT TCAAAGACGA CGGGATCACC TCTGTCGGCT1321TATGACCTGA CATGGTCGTT CGCTGCTTTT CTGACTGCTT ATAATGCTCG AGCAGCCGCC1381ATGCCAGCAT CTTGGGGCGC TGCATCAGCA TCACTGCCAT CATCATGTTC GGGAAGCTCG1441GCATCCGGAC CATGTTCCAC GGCAACGGCC ACCTTCACAT CTGGCACTTT AACCCCTACT1501TGCTCAGCCC AACCATCCAC AACTGTAATT TTTAACGAGC TCGTAACGAC TACATATGGC1561ACGAATATCT ATCTTACTGG CGACAATTCT GAGCTGGGGA ACTGGAGCAC TGGCTCTGAA1621GCCGTTCCAT GTTCTGCGTC GGCATACACA TCCACCAATC CGCTCTGGTA TTGTGTTGCC1681ACGTTACCCG CTGGGACTGA CATCCAATAC AAATTCATAC AAGTGGCTTC AGATGGTACA1741GTCACTTGGG AGAGCGGGTC AAACAGGGAA TACACCGTCC CTTCTAACTG TGCAGGGGTT1801GCTGAGGTGA ATGATAGTTG GCAGTAA其中，信号肽的碱基序列为ATGCAAGTATCAACTTGCCT ATTTGCGCTATGCAGCGCTGTTCTTGCT因此，编码成熟糖化酶的基因序列如SEQ ID NO. 5所示gctccaaggc aggaaaatct gttacggcgt gctacgggaa gcctcacctc ctggctggct60gctgagagtc cgatcgcact ccaaggtgtc ctcaacaaca ttggaccgaa tggggttgat120gctccgggcg ctgattccgg aatggtcgta gcctctccag atcaggtgaa cccagactac
权利要求
1.一种耐热糖化酶GAI，其特征在于，其具有如SEQ ID NO. I或2所示的氨基酸序列。
2.一种耐热糖化酶基因gal，其特征在于，编码权利要求I所述的糖化酶。
3.如权利要求2所述的糖化酶基因gal，其特征在于，其基因序列如SEQID NO. 5所示。
4.耐热糖化酶GAI的表达载体，其特征在于它包含有权利要求2或3所述的糖化酶基因序列。
5.根据权利要求4所述的表达载体,其特征在于所述表达载体为毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体、丝状真菌表达载体、大肠杆菌表达载体。
6.包含权利要求2或3所述糖化酶基因的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、酿酒酵母细胞、大肠杆菌、曲霉或木霉细胞。
8.一种制备耐热糖化酶GAI的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)用权利要求5重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组糖化酶的表达；以及 3)回收并纯化所表达的糖化酶GAI。
9.根据权利要求2或3所述糖化酶基因gal的应用。
10.根据权利要求I所述的耐热糖化酶GAI的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新的耐热糖化酶及其应用。具体的，本发明提供了一种来源于Bispora sp.MEY-1CGMCC 2500的新的耐热糖化酶GAI，其具有如SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列，提供了编码上述糖化酶的基因，其具有如SEQ ID NO.3或4所示的核苷酸序列，以及包含该基因的重组载体、重组菌株和重组酶及其应用。本发明的糖化酶具有以下性质GAI的最适作用pH为3.5，在pH2.0-4.5能保持90％以上的酶活；在pH范围为1.5-12.0间都很稳定；最适作用温度75℃；在70℃和75℃条件下，GAI热稳定性很好。
文档编号C12N15/80GK102827817SQ201110159749
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月15日 优先权日2011年6月15日
发明者郭庆文, 王兴吉, 王忠连, 李芳芳, 刘文龙, 孙硕, 钱娟娟 申请人:山东隆科特酶制剂有限公司