专利名称：番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂。
背景技术：
番鸭小鹅瘟病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起一月龄以内雏番鸭的病毒性传染病，该病1997年以来在福建省莆田、福清等地的番鸭饲养区暴发流行，目前全国各番鸭饲养区均有发生。临床上发病雏番鸭以腹泻、肠粘膜脱落形成栓塞为特征，发病率50 % 70 %、病死率40 % 65 %，给养鸭业造成一定的经济损失。临床上该病不仅常与番鸭细小病毒病(三周病)混合感染，且常被基层兽医误诊为番鸭细小病毒病。由于抗小鹅瘟高免血清对该病具有较好的治疗效果，因此快速诊断是有效控制该病减少损失的前提。然而，我国至今尚缺乏商品化的番鸭小鹅瘟病快速诊断试剂，给临床诊断带来很大困难。因此，快速确诊该病的试剂不仅具有较好的应用价值和产业化前景，而且对有效控制该病是必不可少的。
发明内容
本发明的目的就是提供番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂及其制备方法，它是通过如下技术方案来实现的取一种来源于人工筛选的抗番鸭源鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)杂交瘤细胞株Dll株(即抗GPV杂交瘤细胞株Dll株)，应用抗GPV杂交瘤细胞株Dll株制备抗番鸭源鹅细小病毒单克隆抗体(即抗GPV单克隆抗体)，然后用抗GPV单克隆抗体标记聚苯乙烯乳胶制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株Dll株，保藏在 CCTCC(即中国典型培养物保藏中心)，保藏日2011年4月15日，保藏编号C201120。本发明的目的还要提供番鸭小鹅病乳胶凝集试剂的应用。与现有技术比较，应用本发明的试剂建立的乳胶凝集试验(latex particle agglutination, LPA)可用于临床诊断番鸭小鹅瘟病和鹅细小病毒(GPV)抗原鉴定；同时，根据该凝集试验能被小鹅瘟抗体特异抑制的原理，建立的乳胶凝集抑制试验(latex particle agglutination inhibition,LPAI)还可用于小鹅瘟病的血清学调查和疫苗免疫抗体监测。该试剂具有快速(检测抗原30分钟内出结果，检测抗体60分钟内出结果)、简便(不需仪器、肉眼可判定)、特异性强(不与其它病原发生交叉反应)、敏感性好、重复性和准确率高(与病毒分离的符合率89. 3% )、保存期长 8°C保存一年)等优点。因此，本发明的番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂，既可检测病原，也可检测抗体。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明进一步说明(但不是对本发明的限制)。并通过定性或定量的实验数据证明本发明的技术方案可以实现所述的用途和/或达到预期效果。番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂的制备方法如下
将10%聚苯乙烯乳胶用0. IM pH8. 2甘氨酸缓冲液(GBS)稀释至l%，6000r/min 离心5min，弃上清液，沉淀物用0. IM pH8. 2GBS重悬到原体积，加等体积抗GPV单克隆抗体 (蛋白浓度0. 5 lmg/ml)，充分混勻，置37°C水浴箱中感作40min (每IOmin摇动数秒钟) 后，用含牛血清白蛋白(BSA)的0. IM pH8. 2GBS洗2次，每次以6000r/min离心5min， 沉淀重悬于0. 1 % BSA-GBS使乳胶终浓度为1 %，并加入叠氮钠至终浓度为0. 025 %，即成番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂。其中1.抗番鸭源鹅细小病毒单克隆抗体的制备从液氮中取出抗GPV杂交瘤细胞株Dll株，放入预先准备的37°C温水中，使其尽快融化后，1000r/min离心2min，弃冻存液，以细胞营养液(HT-D7777-10 % FCS)重悬细胞后，将细胞移至预先加好细胞营养液的培养瓶中，37°C CO2 6. O温箱中培养，经扩大培养到足够数量时，收集细胞离心，调细胞浓度达5X IO6个细胞/ml。腹腔接种12周龄BALB/c小鼠，5X IO5个细胞/0. Iml/只，约10天左右小鼠腹部明显臌起，以手触摸时皮肤有紧张感， 即可用16 18号消毒针头采集腹水。将腹水10 000r/min离心15min，弃沉淀，收集上清即为抗GPV单克隆抗体，经Commassi brilliant blue (考马斯亮蓝R-250)法测定抗体蛋白浓度，分装，"200C以下保存备用。2.乳胶凝集试剂制备2. 1抗体稀释以0. IM pH8. 2甘氨酸缓冲液(GBS)将抗GPV单克隆抗体(腹水) 稀释成含蛋白浓度1. O 0. 5mg/ml，备用。2. 2乳胶的预处理将10%聚苯乙烯乳胶用0. IM pH8. 2甘氨酸缓冲液(GBS)稀释成为l%，6000r/min离心5min，弃上清液，沉淀用0. IM pH8. 2GBS重悬到原体积，备用。2. 3乳胶凝集试剂制备将上述预处理的聚苯乙烯乳胶2mL加等体积含蛋白浓度 1. O 0. 5mg/mL的抗GPV单克隆抗体，充分混勻，37°C水浴中感作40min (每IOmin摇动数秒钟)后，用含牛血清白蛋白(BSA)的0. IM pH8. 2GBS洗2次，每次以6000r/min离心 5min，沉淀重悬于2mL的0. 1 % BSA-GBS中，并加入叠氮钠至终浓度为0. 025%，即成番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂。 3乳胶凝集试验(LPA)方法的建立3.1样品采集与处理取濒死病鸭肝、脾、肾、胰等组织，用稀释液研磨成1 1勻浆，加等体积氯仿振荡 3 5min，以6000r/min离心15min，取水相为待检样品。3. 2乳胶凝集试验(LPA)操作方法用稀释液(pH7. 2PBS或生理盐水)将待检样品作连续倍比稀释后，各取IOul不同稀释度的待检样品与等量致敏乳胶在洁净的玻片或96 孔细胞培养板板盖上混勻，室温(22 士 4°C)或37°C水浴温箱中静置5 15min，肉眼观察凝集反应。试验设致敏乳胶对照、抗原对照和抗原加稀释液对照。以能出现“ + ”凝集的抗原最高稀释度的倒数为该抗原的凝集价。4乳胶凝集抑制试验(LPAI)方法的建立4. 1样品的采集与处理常规采血并分离血清。4. 2抗原凝集工作液制备4. 2. 1抗原凝集价测定按3. 2测定抗原凝集效价。4. 2. 2抗原凝集价工作液配制及检验如果抗原价测定结果为2_6(举例)，4个凝
4集单位=2_6/2_2 (2-4)，即将抗原1 16稀释则为4个凝集单位GU)。4.2.2. 1配制稀释液15ml，加病毒抗原lml，使最终浓度为1 16(即仙)，将 1 16稀释的抗原加等量稀释液即成2U的病毒抗原。4. 2. 2. 2抗原凝集价滴定检查4U的凝集价是否准确，应将抗原分别以0. Iml的量加入稀释液0. 1、0. 2、0. 3、0. 4和0. 5ml中，使抗原最终稀释度为1 2、1 3、1 4、 1 5和1 6，取不同稀释度抗原IOul与等量致敏乳胶混勻，室温(22士4°C )或37°C水浴温箱中静置5 15min，如果配制的抗原液为4U，则1 4稀释度出现终点；如果高于4U， 可能1 5或1 6出现终点；如果低于4U，可能1 3或1 2出现终点。应根据检验结果做适当调整，使工作液确为4U，同理检查2U的凝集价是否准确。4. 3LPAI的操作方法在96孔微量细胞培养板上，每排的第1孔加人50uL4凝集单位0U)抗原；第2孔以后每孔加人50uL 2U抗原。然后在第1孔中加人50uL待检血清或高免血清做连续倍比稀释后，置37°C水浴中感作30min后，每孔取IOuL抗原抗体混合液与等量的胶乳试剂混合后，37°C水浴中或室温中静置5 15min肉眼观察结果，以能完全抑制胶乳凝集的血清最高稀释度的倒数为该血清的凝集抑制效价。5乳胶凝集试剂的特性鉴定5. 1自凝性用等量PBS、生理盐水和GBS分别代替被检抗原，进行乳胶凝集试验， 结果乳胶凝集试剂均不会自凝。5. 2特异性和敏感性将乳胶凝集试剂分别与GPV胚液或组织悬液、MPV、MDRV、 ARV、PMV, DHV、正常胚液和正常组织悬液进行LPA试验。结果从表1可知，番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂仅与GPV反应出现肉眼可见的凝集颗粒，而不与其它病毒反应，特异性好；同时敏感性测定显示GPV胚液的效价达26，而GPV感染鸭肝脾组织悬液为22。表1乳胶凝集试剂的特异性和敏感性
权利要求
1.番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂，其特征在于，制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂是应用抗GPV杂交瘤细胞株Dll株制备抗GPV单克隆抗体，然后用抗GPV单克隆抗体制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株Dll株，保藏在CCTCC，保藏日2011年4 月15日，保藏编号C201120。
2.根据权利要求1所述的番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂的应用，其特征在于，用番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂建立的乳胶凝集试验在鹅细小病毒抗原鉴定和番鸭小鹅瘟病诊断中的应用。
3.根据权利要求1所述的番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂的应用，其特征在于，用番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂建立的乳胶凝集抑制试验在小鹅瘟病血清学调查和免疫抗体监测中的应用。
全文摘要
本发明公开了番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂，其特征在于，制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂是用抗GPV杂交瘤细胞株D11株制备抗GPV单克隆抗体，然后用GPV单克隆抗体制备番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株D11株，保藏在CCTCC，保藏日2011年4月15日，保藏编号C201120；本发明还公开了番鸭小鹅瘟病乳胶凝集试剂建立的乳胶凝集试验(LPA)和乳胶凝集抑制试验(LPAI)在鹅细小病毒抗原鉴定和番鸭小鹅瘟病诊断中的应用与在血清学调查和免疫抗体监测中的应用。
文档编号C12N5/20GK102346191SQ20111016677
公开日2012年2月8日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者朱小丽, 林锋强, 王劭, 程晓霞, 陈仕龙, 陈少莺 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 陈少莺