专利名称：一种用于体外细胞共培养的复合微囊模型的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞体外培养技术领域，特别是涉及一种动物细胞体外共培养模型。
背景技术：
在体内，细胞处于一个高度信息化的微环境中，其间充斥着各种复杂的物理化学信号，细胞对各种信号刺激做出响应，以实现其特定的生物学功能。细胞与这种微环境间的相互作用包括来自周围细胞、细胞外基质和可溶性因子的各种复杂的生物化学、生物力学和生物电学信号。其中，细胞与细胞之间是通过直接接触或旁分泌可溶性因子而发生相互作用。这种细胞间的通讯作用是维持细胞、组织及器官结构与功能的重要环节，同时也是调节体内外组织修复与重建的关键因素，而缺少这种通讯作用则是某些细胞体外培养时功能丧失以及分化异常、肿瘤发生的潜在原因。在细胞体外培养过程中，如何有效模拟体内微环境、调控细胞与外界微环境间的相互作用，对于细胞形态与功能的维持以及体外组织的仿生重建至关重要。细胞共培养(cell co-culture)技术是将多种细胞(可以来自同一组织，也可以来自不同的组织)进行共同培养，从而使目的细胞的形态与功能稳定表达，并维持较长的时间和较高的水平。该技术能够有效地模拟体内微环境，是目前体内外组织结构及其功能重建的常用手段之一。传统共培养方式主要有接触式和非接触式共培养。接触式共培养是在合适的培养条件下，将多种细胞按照一定比例混合接种到同一培养环境中进行共同培养。非接触式共培养主要是指用一种细胞的培养上清液(含有不同生长因子等)直接或间接的与另外一种细胞进行共培养，从而达到研究细胞的分泌或代谢产物对目的细胞生长、迁移、增殖、分化等生物学行为影响的目的。然而，传统接触式共培养很难调控体系中同型与异型细胞间相互作用比例，且后期深入研究时也很难有效的把不同种细胞分离开。而非接触式共培养体系仅能部分模拟体内细胞间的相互作用，缺乏由异种细胞间直接接触而导致的胞间作用。近年来，随着工程学、材料学等相关学科的发展，出现了一些新的用于调控细胞外基质微环境的细胞共培养方法。其中，一种具有突破性的调控方法是进行图案化细胞共培养。其原理是通过在基质材料表面不同区域进行特定修饰而形成细胞粘附生长的图案化区域，使不同细胞选择性地粘附在材料表面的不同区域，或通过可移除的物理障碍将不同细胞限制在图案化的不同区域内生长而实现共培养。该共培养方法可以将细胞精确地定位在基质材料表面，更好的调控细胞在培养过程中的空间分布和更加精确的控制同型和异型细胞间的相互作用比例，维持目的细胞的生物学活性，为揭示细胞与细胞以及细胞与基底相互作用基本机理提供有力工具，是一种用于研究细胞间相互作用和工程化组织重建的有效途径。然而，该共培养方法操作较为复杂，基底材料制备工艺较为繁琐，且只限于贴壁细胞的共培养，极大的限制了其应用范围。同时，细胞在该体系中仍处于二维培养环境中，而二维细胞培养方式不能提供类似于体内细胞生长所需的三维空间微环境，对细胞形态、功能表达等许多生物学特征产生不利影响。研究表明，在三维培养体系中细胞的生长方式更接近体内，能够更为真实的模拟复杂的体内细胞微环境。因而，模拟体内微环境，开发新型的用于调控细胞外基质微环境的细胞培养方法，对于体外研究细胞行为、揭示细胞与基质微环境间的相互作用至关重要。
发明内容
本发明目的是克服以上现有的细胞体外共培养中存在的缺点与不足，提供一种新型的细胞体外三维共培养模型，即用于体外细胞共培养的复合微囊模型。本发明为模拟体内细胞生长微环境，利用微囊技术，以天然多糖海藻酸钠为基质材料，构建海藻酸钠微囊化细胞体外三维培养模型。本发明提供的用于体外细胞共培养的复合微囊模型，是以天然多糖海藻酸钠为基质材料，经过两次将多糖海藻酸钠滴入到多价阳离子溶液中凝胶化处理，形成由内外两层海藻酸钠凝胶微球构成的球包球式复合微囊模型，其中在一层凝胶微球中包含或不包含一种细胞，如细胞A，在另一层凝胶微球中包含或不包含另一种细胞，如细胞B。其中所述的多价阳离子是钙、锌、钡、铜、镁、铁、锰离子。所述的内层凝胶微球的粒径范围在50-600 μ m，外层凝胶微球的粒径范围在 100-3000 μ m0本发明所述的复合微囊模型的构建方法，包括
第1、将经过滤灭菌的海藻酸钠溶液滴入到多价阳离子溶液中凝胶化处理，形成海藻酸钠凝胶微球；所述的海藻酸钠溶液中选择性添加或不添加细胞A ；
第2、收集凝胶化的海藻酸钠凝胶微球，用生理盐水(0. 9%NaCl溶液)洗涤，将海藻酸钠凝胶微球再次分散到经过滤灭菌的海藻酸钠溶液中，然后将含有海藻酸钠凝胶微球的海藻酸钠溶液滴入到多价阳离子溶液中再次凝胶化处理，形成球包球式复合微囊模型；所述的海藻酸钠溶液中选择性添加或不添加细胞B ；
第3、收集凝胶化处理后的复合微囊模型，生理盐水洗涤，置入细胞培养板内，加入细胞培养基，置于二氧化碳培养箱(37°C、5% C02、100%湿度)静置培养。以上第1步、第2步中所述的海藻酸钠溶液采用高压静电滴液、气流吹喷滴液或手工注射器滴液的方法滴入到多价阳离子溶液中凝胶化处理，所述的多价阳离子是钙、锌、 钡、铜、镁、铁、锰离子。第1步制备内层凝胶微球的海藻酸钠溶液的质量体积浓度为0. 5%_5%，内层凝胶微球的粒径控制在50-600 μ m范围；
第2步制备外层凝胶微球的海藻酸钠溶液的质量体积浓度为0. 1%_3%，外层凝胶微球的粒径控制在100-3000 μ m范围。本发明还可以在第1步、第2步凝胶化处理后得到的海藻酸钠凝胶微球表面选择性包覆一层半透性膜，具体方法是
将生理盐水洗涤后的海藻酸钠凝胶微球分散到质量浓度为0. 01%-2%的阳离子型高分子溶液中处理l-30min分钟即可；所述的阳离子型高分子溶液是多聚赖氨酸溶液或壳聚糖溶液。本发明所述的复合微囊模型可以应用于考察细胞-细胞、细胞-细胞外基质以及细胞-可溶性因子间的相互作用，体外构建肿瘤模型、组织工程化各类组织器官类似物或等同物。
本发明的优点和积极效果
1.本发明采用的基质材料天然多糖海藻酸钠是一种廉价、无毒、生物相容性好的聚阴离子型生物材料，在常温、酸碱中性的生理条件下，可以不使用存在细胞毒性的交联剂，而是利用多价阳离子，使海藻酸钠溶液发生相变形成凝胶态；利用微囊化技术仿生构建细胞体外三维培养模型。本发明具有设备简易，操作简单，对细胞物理伤害小的优点，适于进一步的体内移植及体外组织再生研究；构建的微囊模型一方面使囊内细胞与外界免疫分子隔离，保护囊内细胞，另一方面诸如氧气、营养物质、电解质、有生物活性的分泌物以及细胞代谢产物等低分子量物质可自由穿过而进行物质传递，保证了囊内细胞的生长存活，并延长了其形态和功能的维持时间。2.本发明首次报道通过球包球复合微囊模型实现细胞体外三维共培养。该共培养模型具备更为仿生的特点，可同时克服传统接触式共培养体系很难调控同型与异型细胞间相互作用比例和难于在后期研究中把不同种细胞分离开、非接触式共培养体系缺乏由异种细胞间直接接触而导致的胞间作用以及图案化共培养存在细胞依赖性的诸多缺点，在温和、可调控的条件下实现各种目的细胞的三维仿生共培养。3.本发明中所涉及的实验器材均可经高温高压灭菌，可重复使用，大大降低了实验成本，利用本发明构建的共培养模型可更为仿生的观察细胞在三维培养体系中的生长、 迁移、增殖与分化等生物学行为，揭示细胞-细胞、细胞-细胞外基质和细胞-可溶性因子间的相互作用。
图1是用复合微囊模型进行细胞共培养的示意图。图2是传统微囊化细胞三维体外培养光镜图。图3是内部区域含细胞而外层区域不含细胞的复合微囊模型光学显微照片。图4是用复合微囊模型进行异种细胞共培养的光学显微照片。图1中，1内部微囊内细胞A，2外部微囊内细胞B，3微囊的选择性半透膜，4可自由透过膜的低分子量物质，如氧气、营养物质及一些低分子量活性因子和细胞代谢产物，5 不能透过膜的高分子量物质，如抗体、免疫细胞、免疫球蛋白等。
具体实施例方式实施例1
如图1所示，本发明通过两步微囊化将异种细胞分别培养在复合微囊模型的内、外区域。复合微囊模型的构建方法包括
第1、将经过滤、灭菌的海藻酸钠溶液滴入到多价阳离子溶液中凝胶化处理，形成海藻酸钠凝胶微球；所述的海藻酸钠溶液中添加有细胞A并分散均勻；海藻酸钠溶液的质量体积浓度为0. 5%-5%，内层凝胶微球的粒径控制在50-600 μ m范围；
第2、收集凝胶化的海藻酸钠凝胶微球，用生理盐水(0. 9%NaCl溶液)洗涤，将海藻酸钠凝胶微球再次分散到经过滤灭菌的海藻酸钠溶液中，然后将含有海藻酸钠凝胶微球的海藻酸钠溶液滴入到多价阳离子溶液中再次凝胶化处理，形成球包球式复合微囊模型；所述的海藻酸钠溶液中添加有细胞B并分散均勻；海藻酸钠溶液的质量体积浓度为0. 1%_3%，外层凝胶微球的粒径控制在100-3000 μ m范围；
第3、收集凝胶化处理后的复合微囊模型，生理盐水洗涤，置入细胞培养板内，加入细胞培养基，置于二氧化碳培养箱(37°C、5% C02、100%湿度)静置培养。以上第1步、第2步中所述的海藻酸钠溶液采用高压静电滴液、气流吹喷滴液或手工注射器滴液的方法滴入到多价阳离子溶液中凝胶化处理，所述的多价阳离子是钙、锌、 钡、铜、镁、铁、锰离子。本发明还可以在第1步、第2步凝胶化处理后得到的海藻酸钠凝胶微球表面选择性包覆一层半透性膜，具体方法是
将生理盐水洗涤后的海藻酸钠凝胶微球分散到质量浓度为0. 01%-2%的阳离子型高分子溶液中处理l-30min分钟即可；所述的阳离子型高分子溶液是多聚赖氨酸溶液或壳聚糖溶液。本发明利用微囊化技术，不仅可以为细胞的生存提供三维立体微环境，还可以利用复合微囊模型中半透膜的分子截断作用使细胞与宿主免疫系统隔离，在治疗相关疾病时，减少甚至避免免疫排斥反应的发生；另一方面，复合微囊模型的半透膜可以允许诸如氧气、营养物质、电解质、有生物活性的分泌物以及细胞代谢产物等低分子量物质的顺利通过而进行物质传递，保证了囊内细胞的生长存活，并延长了其形态和功能的维持时间。本发明可有效的克服传统共培养方式中存在的同种与异种细胞间相互作用不可控、后期研究时异种细胞难于分离以及存在细胞依赖性等缺点，可在三维立体环境下研究细胞的生长、增殖、迁移及胞间作用等生物学行为。图2所示为利用现有技术该构建的传统微囊化细胞模型，该模型可用于细胞的三维体外培养，也可通过多种细胞的共同微囊化实现细胞三维体外共培养。该体系用于共培养时，异种细胞在空间上处于同一微囊内，具有传统接触式共培养的许多缺点，如同型与异型细胞间相互作用在空间与比例上均不可调控，后期研究时异种细胞难于分离等。
实施例2
如图3所示，本实施例提供的是仅复合微囊模型内部包裹OTH3T3细胞的情况下光学显微照片。复合微囊模型的构建方法同实施例1。利用本发明构建的三维复合微囊模型形状规整，表面光滑，粒径均勻，基本上可保证复合微囊模型体系中每个大囊内包裹一个小微囊，且该培养体系可将细胞分别固定在复合微囊模型的特定区域。实施例3
如图4所示，利用本发明构建的复合微囊模型(构建方法同实施例1)将异种细胞进行体外共培养。复合微囊模型的中心区域与外层区域分别为NIH3T3细胞和HepG2细胞，从中可以看出，两种细胞均勻的分布在复合微囊模型的不同区域内，彼此相邻且相互分开，可用于研究异种细胞间的相互作用及细胞分泌产物对其它细胞行为的影响，同时可更为仿生的模拟体内组织或器官细胞在三维空间上的分布和异种细胞彼此间相互作用。
权利要求
1.一种用于体外细胞共培养的复合微囊模型，其特征在于该模型是以天然多糖海藻酸钠为基质材料，经过两次将多糖海藻酸钠滴入到多价阳离子溶液中凝胶化处理，形成由内外两层海藻酸钠凝胶微球构成的球包球式复合微囊模型，在其中一层凝胶微球中包含或不包含一种细胞，在另一层凝胶微球中包含或不包含另一种细胞。
2.根据权利要求1所述的复合微囊模型，其特征在于所述的多价阳离子是钙、锌、钡、 铜、镁、铁、锰离子。
3.根据权利要求1或2所述的复合微囊模型，其特征在于所述的内层凝胶微球的粒径范围在50-600 μ m,外层凝胶微球的粒径范围在100-3000 μ m。
4.一种权利要求1所述的复合微囊模型的构建方法，其特征在于包括第1、将经过滤灭菌的海藻酸钠溶液滴入到多价阳离子溶液中凝胶化处理，形成海藻酸钠凝胶微球；所述的海藻酸钠溶液中选择性添加或不添加细胞A ；第2、收集凝胶化的海藻酸钠凝胶微球，用生理盐水洗涤，将海藻酸钠凝胶微球再次分散到经过滤灭菌的海藻酸钠溶液中，然后将含有海藻酸钠凝胶微球的海藻酸钠溶液滴入到多价阳离子溶液中再次凝胶化处理，形成球包球式复合微囊模型；所述的海藻酸钠溶液中选择性添加或不添加细胞B;第3、收集凝胶化处理后的复合微囊模型，生理盐水洗涤，置入细胞培养板内，加入细胞培养基，置于二氧化碳培养箱静置培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于第1步、第2步中所述的海藻酸钠溶液采用高压静电滴液、气流吹喷滴液或手工注射器滴液的方法滴入到多价阳离子溶液中凝胶化处理，所述的多价阳离子是钙、锌、钡、铜、镁、铁、锰离子。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于第1步制备内层凝胶微球的海藻酸钠溶液的质量体积浓度为0. 5%-5%，制备外层凝胶微球的海藻酸钠溶液的质量体积浓度为 0. 1%-3%。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于第1步制备的内层凝胶微球的粒径控制在 50-600 μ m范围，第2步制备的外层凝胶微球的粒径控制在100-3000 μ m范围。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其特征在于将第1步、第2步凝胶化处理后得到的海藻酸钠凝胶微球表面选择性包覆一层半透性膜，具体方法是将生理盐水洗涤后的海藻酸钠凝胶微球分散到质量浓度为0. 01%-2%的阳离子型高分子溶液中处理l_30min分钟即可。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的阳离子型高分子溶液是多聚赖氨酸溶液或壳聚糖溶液。
10.一种权利要求1所述的复合微囊模型的应用，其特征在于用于考察细胞-细胞、细胞-细胞外基质以及细胞-可溶性因子间的相互作用，体外构建肿瘤模型、组织工程化各类组织器官类似物或等同物。
全文摘要
一种用于细胞体外共培养的复合微囊模型。该模型以天然多糖海藻酸钠为基质材料，将多糖海藻酸钠滴入到多价阳离子溶液中经两次凝胶化处理，形成由内外两层海藻酸钠凝胶微球构成的球包球式复合微囊模型，其中一层凝胶微球中可包含一种细胞，另一层中可包含另一种细胞。该模型可用于各种细胞间的体外共培养研究，克服了传统共培养模型中同种与异种细胞间相互作用不可控、后期研究时异种细胞难于分离以及存在细胞依赖性等诸多缺点，可在三维立体仿生条件下模拟细胞-细胞、细胞-细胞外基质以及细胞-可溶性因子间的相互作用，为体外构建肿瘤模型、优化细胞体外培养方式和组织工程化构建各类组织器官类似物或等同物提供理论和技术支持。
文档编号C12N11/10GK102286422SQ20111016887
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者杨军, 毛宏理, 郑俊坤 申请人:南开大学