专利名称：用于检测棘阿米巴原虫的环介导等温扩增引物及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于常见病原微生物快速检测技术领域，具体是涉及一种用于检测棘阿米巴原虫的环介导等温扩增引物及试剂盒。
背景技术：
棘阿米巴原虫是一种广泛存在于自然界中的自生生活的微生物，有滋养体、包囊两个时相。滋养体普遍栖息在淡水、污水、海水或泥土中，环境不利时转化为包囊，包囊可存在于空气中。在一定条件下，棘阿米巴原虫可从皮肤伤口、穿透性角膜外伤、损伤的眼结膜或经呼吸道、生殖道等进入人体，多数寄生于眼、皮肤等部位，若机体免疫力减弱还可进一步引发脑炎。棘阿米巴性角膜炎是一种顽固的进行性角膜溃疡，患者有异物感、视力模糊、 流泪、畏光，并常有严重疼痛，严重时可致盲。它的发生与一定的危险因素有关，主要包括配戴角膜接触镜、接触污染的水源和角膜外伤等。近年来由于角膜接触镜的佩戴，棘阿米巴性角膜炎有明显上升趋势。棘阿米巴性角膜炎表现复杂多样，在感染早期由于其临床症状和单疱病毒、真菌等引起的角膜感染非常相似，所以经常被误诊而延误治疗。而棘阿米巴引发的脑炎好发于免疫抑制的病人，感染前有过头部或眼部外伤，其诊断也是相当困难。神经系统体征显示局灶性单侧损害，有严重的局灶性坏死和水肿。患者头痛、发热呕吐、颈强直、眩晕、嗜睡、精神错乱、共济失调直至昏迷和死亡。对于棘阿米巴原虫目前常用的实验室诊断方法有病灶组织刮片检查、分离培养和共聚焦显微观察。病变组织刮片的显微观察具有快速简单，不需特殊仪器等优点，但是阳性率不高，而且对于阿米巴包囊的检出需要很有经验。对病变组织或刮片中阿米巴原虫的分离培养是一种很确切的检验方法，但是培养过程繁琐，切需要较长时间，这也制约了此方法的广泛应用。共焦显微镜直接观察病灶处有无阿米巴包囊是一种很直接的检测方法，是由于角膜组织的低光水平反射和眼球的运动限制了图像的生成，而且共焦显微镜也不是很普及的检测仪器。环介导等温扩增方法可弥补这些不足，目前尚未见用环介导等温扩增方法检测棘阿米巴原虫的报道。
发明内容
本发明的目的是要提供一种用于检测棘阿米巴原虫的环介导等温扩增(LAMP)引物及试剂盒，以便快速精确的检测棘阿米巴原虫，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中， 使棘阿米巴原虫的检测更准确、灵敏、快速、安全。本发明的检测棘阿米巴原虫的环介导等温扩增引物，其引物序列分别为SEQ ID NO :1 4。特殊设计的LAMP引物包括可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(正向内引物和反向内引物)和两个外引物(正向外引物和反向外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链。本发明的棘阿米巴原虫核酸等温扩增检测试剂盒包括
1)DNA提取裂解液；提取裂解液为STEN裂解液，STEN裂解液是由以下组份组成10%的十二烷基硫酸钠，1 10份；IOOmM PH值为8. 0的三羟甲基氨基甲烷，1 10份；IOmM的乙二胺四乙酸二钠，1 10份；IM氯化钠，1 10份；双蒸水定容到100份；2)蛋白酶K，内装20mg/mL蛋白酶K;3)蛋白抽提液，为体积比为25 24 1的酚氯仿异戊醇；4)核酸沉淀液，为无水乙醇；5)核酸洗涤液，为70 %的乙醇；6)纯水，为灭菌纯水；7) UNG酶，为尿嘧啶DNA糖基化酶；8) LAMP反应液，LAMP反应液由以下组份组成dATP、dGTP和dCTP各1. 0 2. OmM, dTTP、dUTP 各 0. 5 1. 5mM, Tris-HCl 10 40mM，KCl 5 20mM，(NH4) 2S045 15mM，Triton X-1000. 05% 1· 0%, MgS044 12mM, Betaine 0· 8 1· 6M ；9)引物混合液，内装序列分别为SEQ ID NO :1_4的LAMP正反向内引物和正反向外引物；10)Bst DNA 聚合酶，内装 8U/y 1 的 Bst DNA 聚合酶；11)显色剂，内装核酸染料GeneFinder 。本发明的试剂盒中还有阳性对照核酸，内装棘阿米巴原虫阳性DNA。本发明根据棘阿米巴基因保守区序列设计的LAMP引物能够灵敏、快速、安全的检测棘阿米巴原虫，同时本发明的试剂盒中采用UNG酶能彻底消除多次检测过程中核酸污染导致的假阳性，解决了限制LAMP技术广泛应用的易被污染干扰的问题。使用本发明的试剂盒在3小时以内就可完成阿米巴性角膜炎中阿米巴原虫的检测，检测过程无需昂贵的仪器设备如PCR仪和凝胶成像系统，仅需有水浴锅或金属浴和离心机即可；而且检测结果非常容易判别；与已有检测技术相比，本发明的试剂盒成本低，整个过程不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都非常安全，并且检测灵敏度极高。
具体实施例方式本发明设计了 4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在一定温度下对核酸进行等温扩增。本发明的引物能有效检测棘阿米巴原虫的所有虫株，而且检测特异性好。另外本发明的试剂盒采用尿嘧啶糖基化酶消除LAMP扩增产物的污染，避免了由于LAMP检测方法的产物扩增量非常大，极易使被检样品污染，造成假阳性的结果，而大大限制了其在检测中的广泛应用；核心之三是优化了整个操作过程的技术参数，并将之标准化、配套化，形成检测试剂盒，以便于现场应用。下面对本发明的引物和试剂盒进行具体的描述。棘阿米巴原虫核酸等温扩增检测试剂盒的制备本发明的试剂盒由以下组成(5样份)(1) DNA提取裂解液，1管，内装500 μ 1 STEN裂解液，STEN裂解液是由以下组份组成10%的十二烷基硫酸钠(SDQ 10份；IOOmM的三羟甲基氨基甲烷(Tris · HC1，ρΗ8. 0) 10 份；IOmM的乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 10份；IM氯化钠(NaCl) 10份；双蒸水定容到100份；
(2)蛋白酶K，1管，内装5μ1蛋白酶K(20mg/mL)；(3)核酸抽提液，1管，内装500 μ 1酚氯仿异戊醇05 24 1)；(4)核酸提取液，1管，内装1000 μ 1无水乙醇；(5)核酸洗涤液，1管，内装1000 μ 170%的乙醇；(6)灭菌纯水，1管，内装200 μ 1灭菌纯水；(7) UNG酶，1管，内装25U的尿嘧啶DNA糖基化酶；(8) LAMP反应液，1管，内装80 μ 1 LAMP反应液，LAMP反应液由以下组份组成 dATP、dGTP 和 dCTP 各 1. 4mM，dTTP、dUTP 各 0. 7mM, Tris-HC120mM, KCl IOmM, (NH4) 2SO4IOmM, Triton X-1000. 1 %, MgS048mM, BetainelM ；(9)引物混合液，1管，内装20 μ L LAMP正反向内引物各10 μ M和正反向外引物各 1. 25μΜ ；(IO)Bst DNA聚合酶，1 管，内装 5μ L 8U/μ 1 的 Bst DNA 聚合酶；(11)显色剂，1管，内装5 μ 110倍稀释核酸染料GeneFinder ；(12)阳性对照核酸，1管，内装10 μ 1棘阿米巴原虫阳性DNA ；试剂盒中所述的LAMP引物的DNA序列分别为SEQ ID NO 1 4。本发明的棘阿米巴原虫的LAMP检测方法，可用于棘阿米巴性角膜炎中阿米巴原虫的检测，还可用于检测水体、食物中是否存在阿米巴原虫。具体步骤如下(1)取待测样品置于微型离心管中，加入100μ 1组织裂解液和1μ 1蛋白酶K， 60°C作用30 60min，其间反复吹打数次；(2)加入等体积核酸抽提液抽提后，12000rpm/min离心5 lOmin，吸取上层转入新的微型离心管；(3)加入-20°C预冷的2倍体积核酸提取液充分混合，以12000r/min离心5 lOmin，弃上清液保留沉淀物；(4)用核酸洗涤液洗涤上述沉淀物2次，然后以10000 15000r/min离心2 5min，弃去上清液并保留沉淀物；(5)将上述离心管底部的沉淀物于室温晾干，加入灭菌纯水溶解沉淀物，得到样品核酸；(6)取适量上述样品核酸及试剂盒中的阳性对照核酸，加入15 μ 1 LAMP反应液、 4 μ 1 LAMP引物混合液，然后再加入UNG酶0. 5 μ 1，50°C反应3min，作为污染模板消除方法以酶解其中可能存在的污染模板；(7)将上述酶解后的样品核酸和阳性对照核酸反应管于95°C保温3 6min，然后再迅速置于碎冰块中2 lOmin，灭活UNG酶；(8)将上述处理后的样品核酸和阳性对照核酸反应管分别加入1 μ 1 Bst DNA聚合酶；(9)将上述小管于60 65°C保温40 70min，然后于80°C保温5 IOmin进行 LAMP反应；(IO)LAMP反应结束后，在每个小管中加入GeneFinder ，然后用眼睛观察被测样品的LAMP反应产物，如果显示绿色则表示该样品中棘阿米巴原虫检测结果为阳性，若显示橙黄色则表示该样品中棘阿米巴原虫检测为阴性。实施例1 本发明的引物和试剂盒对阳性样品的检测该试剂盒中的阳性核酸样品是包含棘阿米巴原虫核酸的DNA质粒。其制备的具体操作是在PCR扩增棘阿米巴基因组DNA后，用试剂盒回收目的片段，连接到克隆质粒上，转入大肠杆菌E. coli中，经氨苄培养基平板筛选培养，挑取阳性克隆测序验证，提取阳性克隆的质粒即可作为阳性核酸。将阳性核酸梯度稀释为IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2, IO1,10°copies/uL,直接采用本发明的LAMP引物和试剂盒中LAMP反应液进行LAMP敏感性检测，具体方法如下DLAMP反应液15 μ 1，LAMP引物混合液4 μ 1，各梯度棘阿米巴阳性核酸1 μ 1，加入UNG酶0. 5 μ 1，灭菌纯水4 μ 1，50°C反应3min，酶解可能存在的污染模板；2) 95°C保温3 6min，然后迅速置于碎冰块中2 lOmin，灭活UNG酶；3)每个浓度梯度的反应管中加入1μ 1 Bst DNA聚合酶，60 65°C保温40 70min，然后于80°C保温5 IOmin ；4) LAMP反应结束后，在各浓度梯度反应管中加入GeneFinder ，然后用眼睛观察被测样品的LAMP反应产物。结果显示，本发明的引物和LAMP反应体系对微量的棘阿米巴核酸就可扩增出阳性结果，灵敏度可达10个阳性核酸拷贝数(101)，在实际操作中使用本发明的引物检测的时候不会出现假阴性。实施例2 本发明的引物和试剂盒对阴性样品的检测利用眼科常见的病原微生物包括细菌绿脓杆菌，真菌茄病镰刀菌，病毒单纯疱疹病毒1型，棘阿米巴原虫及人角膜上皮细胞基因组DNA对本发明的引物和试剂盒进行LAMP 特异性检测。具体操作同实施例1的具体方法，结果显示，本发明的引物和LAMP反应体系只对棘阿米巴原虫的DNA有扩增，对其他眼科常见细菌、真菌、病毒及角膜本身无扩增，即上述的扩增反应管中不会变成绿色，说明本发明的引物在检测的时候不会出现假阳性。实施例3 本发明的引物和试剂盒对病变组织样品的检测利用临床上高度怀疑棘阿米巴性角膜炎的病变角膜组织刮取物对本发明的引物和试剂盒进行有效性验，具体方法如下(1)取角膜病变组织刮取物置于微型离心管中，加入100 μ L组织裂解液和1 μ L蛋白酶K，60°C作用60min，其间反复吹打数次；(2)加入等体积核酸抽提液抽提后，12000rpm/min离心5，吸取上层转入新的微型离心管；(3)加入-20°C预冷的2倍体积核酸提取液充分混合，以12000r/min离心5，弃上
清液；(4)用核酸洗涤液洗涤上述沉淀物2次，然后以lOOOOr/min离心5min，弃去上清液；(5)将上述离心管底部的沉淀物于室温晾干，加入10 μ L TE缓冲液溶解沉淀物， 得到样品核酸；(6)取5 μ L上述样品核酸及1 μ L试剂盒中的阳性对照核酸，加入15 μ LLAMP反应液、4μ L LAMP引物混合液，然后再加入UNG酶0. 5μ L，50°C反应:3min，同时做不加模板的阴性对照；(7)将上述酶解后反应管于95°C保温5min，然后再迅速置于碎冰块中^iiin ；(8)将上述处理后反应管分别加入IyL Bst DNA聚合酶，于63°C保温60min ；然后于80°C保温IOmin进行LAMP反应；(9)LAMP反应结束后，在每个小管中加入1 μ L GeneFinder ，用眼睛观察被测样品的LAMP反应产物。结果病变角膜组织样品核酸和阳性对照核酸反应管均显绿色呈阳性，而阴性对照管显橙色。实施例4 本发明的引物和试剂盒对污染水体样品的检测利用高度怀疑污染棘阿米巴原虫的角膜接触镜浸泡液对本发明的引物和试剂盒进行有效性验，具体方法如下取2ml角膜接触镜的浸泡液，10000r/min离心lOmin，弃上清保留沉淀；向沉淀中加入100 μ L组织裂解液和1 μ L蛋白酶K，60°C作用30min，其间反复吹打数次；余步骤同实施例3中( (9)，结果显示污染的角膜接触镜浸泡液与阳性对照核酸均显绿色，而阴性对照显橙色。
权利要求
1.一种用于检测棘阿米巴原虫的环介导等温扩增引物，其引物序列分别为SEQ ID NO 1 4。
2.一种棘阿米巴原虫环介导等温扩增检测试剂盒，包括如下组分1)DNA提取裂解液；提取裂解液为STEN裂解液，STEN裂解液是由以下组份组成10%的十二烷基硫酸钠， 1 10份；IOOmM pH值为8. 0的三羟甲基氨基甲烷，1 10份；IOmM的乙二胺四乙酸二钠， 1 10份；IM氯化钠，1 10份；双蒸水定容到100份；2)蛋白酶K，内装20mg/mL蛋白酶K;3)蛋白抽提液，为体积比为25 24 1的酚氯仿异戊醇；4)核酸沉淀液，为无水乙醇；5)核酸洗涤液，为70%的乙醇；6)纯水，为灭菌纯水；7)UNG酶，为尿嘧啶DNA糖基化酶；8)环介导等温扩增反应液，反应液由以下组份组成dATP、dGTP和dCTP各1.0 2. OmM，dTTP、dUTP 各 0. 5 1. 5mM, Tris-HCl 10 40mM，KCl 5 20mM，(NH4)2S045 15mM， Triton X-1000. 05% 1· 0%, MgS044 12mM，Betaine 0· 8 1· 6M ；9)引物混合液，内装序列分别为SEQID NO :1-4的等温扩增正反向内引物和正反向外引物；10)BstDNA聚合酶，内装8U/y L的Bst DNA聚合酶；11)显色剂，内装核酸染料GeneFinder 。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于上述的试剂盒还包括有阳性对照核酸，所述的阳性对照核酸为棘阿米巴原虫阳性DNA。
4.权利要求2或3所述的试剂盒用于水体、食物中棘阿米巴原虫的检测。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测棘阿米巴原虫的环介导等温扩增引物及试剂盒，其引物序列分别为SEQ ID NO1-4。本发明根据棘阿米巴基因保守区序列设计的环介导等温扩增引物能够灵敏、快速、安全的检测棘阿米巴原虫，同时本发明的试剂盒中采用UNG酶能彻底消除多次检测过程中核酸污染导致的假阳性，解决了限制环介导等温扩增技术广泛应用的易被污染干扰的问题。使用本发明的试剂盒在3小时内就可完成阿米巴性角膜炎中阿米巴原虫的检测，检测过程无需昂贵的仪器设备，仅需有水浴锅或金属浴和离心机即可；而且检测结果非常容易判别；与已有检测技术相比，本发明的试剂盒成本低，整个过程不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都非常安全，并且检测灵敏度极高。
文档编号C12Q1/04GK102230016SQ20111016891
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者孙士营, 谢立信, 赵格, 陈豪 申请人:山东省眼科研究所