专利名称：一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种细胞分选方法，具体地说，是指一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法，建立分离拟南芥根尖处于细胞分裂周期中的细胞(以下简称分裂细胞)的实验系统。
背景技术：
流式细胞仪技术(Flow Cytometry)是一种对处在液流中的单个细胞或其他生物颗粒等进行快速定量分析和分选的技术。FACS Aria是BD公司2003年推出的世界首款台式高速多荧光检测和分选的流式细胞仪，其主要用途是从细胞群中高速分选出被指定的细胞，以便作进一步鉴定、功能研究或细胞培养。目前，流式细胞仪分选技术已被广泛用于医学研究和应用，但其在植物学领域的应用较少。植物是由复杂的组织和器官构成，构成植物组织或器官的细胞又可以分为多种不同类型，见参考文献[1]Scheres B, Benfey P, Dolan L(2002). Root Development. The Arabidopsis Book, First published on September 30, doi 10. 1199/tab. 0101 ；参考文献[2]Scheres B,van den Toorn H,Heidstra R(2004). Root genomics :towards digital in situ hybridization. Genome Biol 5 :227 ；参考文献[3]Galbraith D. W. , Birnbaum K. (2006). Global studies of cell type-specific gene expressionin plants. AnnualRev Plant Biol 57:451-475。植物的发育是通过调控基因表达及决定细胞命运而实现的，因此建立不同类型细胞的基因表达谱对研究植物发育具有重要的意义，见参考文献[4]Birnbaum K, Shasha DE, Wang JY, Jung Jff, Lambert GM, Galbraith Dff, Benfey PN(2003). A gene expression map of the Arabidopsis root.Science 302:1956-1960; 参考文献[5]Nawy Τ, Lee JY, Colinas J, Wang JY, Thongrod SC, Malamy JE, Birnbaum K, Benfey PN(2005). Transcriptional profile ofthe Arabidopsis root quiescent center. Plant Cell 17 :1908-1925 ；参考文献[6]Galbraith Dff, Birnbaum K(2006). Global studies of cell type-specific geneexpression in plants. Annual Rev Plant Biol 57 :451-475 ；参考文献[7]Zhang C, Barthelson RA, Lambert GM, Galbraith Dff(2008). Global Characterization of Cell-Specific Gene Expressionthrough Fluorescence-Activated Sorting ofNuclei. PlantPhysiology 147 :30—40。才直·白勺砠会只、 器官及整体生长是通过细胞分裂增加细胞数量和通过细胞伸长增加体积(即细胞周期)来实现的。细胞周期中的主要事件是DNA复制成两个拷贝，通过有丝分裂分配到两个子代细胞中。细胞周期被划分为Gl期(M期结束到S期之间的间隙)、S期(DNA合成期)、G2期 (S期结束到M期之间的间隙)和M期(有丝分裂期)。要建立不同时期细胞的基因表达谱首先需要将不同类型的细胞分离开，然后收集所需细胞类型并获得足够量的mRNA，才能够进行表达谱分析。目前分选特定细胞的技术还有激光捕获技术，利用该技术必须对所研究的组织或器官进行杀死、固定、包埋和切片，暴露出所研究的目标细胞，然后通过激光捕获仪进行切割并分离该目标细胞，见参考文献[8]Kerk NM, Ceserani T，Tausta SL, SussexIM, Nelson TM. LaserCapture Microdissection of Cells from Plant tissues. Plant Physiology 132:27-35。由于分离细胞花费的时间很长，大约需要4_5天时间，并且实验过程繁杂，细胞经过切片，分离出的RNA完整度大大降低，实验的准确性不能完全保证。
发明内容
本发明利用流式细胞仪成功收集到了拟南芥根尖发育早期正在分裂的细胞，为从中分离出高质量的RNA奠定基础，可用于后续基因表达谱的研究。利用本发明提供的方法能够快速、大量富集所研究的目标细胞，整个过程仅需要2-3个小时，大大减少收集细胞所花费的时间，提高了实验效率，同时提高实验的准确性。本发明建立了分离拟南芥根尖分裂的细胞的实验系统。选择在分裂细胞中G2/ M特异表达的基因CyclinBl (CycBl)，用其启动子以及它的N端的部分序列(Destruction Box，这段序列确保CycBl功能完成后能够及时被识别降解)与GFP (绿色荧光蛋白)构建融合基因表达载体，获得CycBl::GFP转基因纯系植株，见参考文献[9] Colon-Carmona Α.， You R. , Hurst R. D. , Haimovitch-Gal Τ. ,Doerner P. (1999). Saptio-temporal analysis ofmitotic activity with a labilecyclin-GUS fusion protein。CycBl 是植物细胞周其月检验点基因，主要在G2和M早期表达，随后被迅速降解，它在G2/M期的转变中起作用。为了分离拟南芥根尖分裂细胞，需要分别将正在分裂的细胞进行荧光标记，才能够利用流式细胞仪收集。本发明以在根尖发育早期的正在分裂的细胞中表达CYCB: :GFP绿色荧光蛋白的拟南芥转基因植物为材料，使用流式细胞仪分选出了较多G2/M期的细胞，可以为建立特定时期细胞的基因表达谱研究奠定技术基础。本发明提供的采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法，主要用于分离拟南芥根尖分裂的细胞，具体步骤如下第一步、将拟南芥幼苗用10μ g/mL的propidium iodide染色，制成水封装片，用激光共聚焦扫描显微镜Leica SP2观察，确定原生质体位置；第二步，根尖原生质体的制备；具体为(1)将70微米孔径的滤膜放入小培养皿，加入酶解缓冲液；(2)用刀片切取根尖放入上述的酶解缓冲液中，在水平摇床上以80-100转/分钟的转速摇动，25 °C避光酶解60分钟，形成酶解混合物；(3)将酶解混合物转入离心管中，2_8°C，200-600 Xg离心5_10分钟收集细胞，除去上清液，加入ImL的等渗缓冲液；(4)重悬，70微米孔径的滤网和40微米孔径的滤网各过滤一次，得到根尖原生质体；所述的酶解缓冲液具体为质量分数为1.2-1.5%纤维素酶，质量分数为 0. 1-0. 15%果胶酶，300-600mmol ·厂1 甘露醇，1. 5-2mmol · I^MgCl2，质量分数为 0. 牛血清白蛋白，1. 5-2mmol ‘ U1CaCl2 水溶液，2mmol 'L"1 的 2-吗啉乙磺酸，10-15mmol ‘ U1KCl 水溶液，PH 5. 5，上述的百分数均为质量百分比；所述的等渗缓冲液具体为:300-600mmol · L—1甘露醇，1. 5-2讓ο 1 · LlgCl2， 质量分数为0. 1 %牛血清白蛋白，1. 5-2mmol · L^1CaCl2, 2謹ol · Γ12-吗啉乙磺酸，10-15mmol · L-1KCl, pH 5. 5 ；第三步、FASC细胞分选；用FACS Aria流式细胞仪分选原生质体中带GFP的细胞，分选时所采取的参数为 100 μ m喷嘴，488纳米蓝光激发，鞘液压力为20psi ；细胞直接分选至RNA buffer中，混勻立刻冻存于_80°C ；第四步，总RNA的提取；使用RNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取分选细胞的总RNA，按照试剂盒上的说明进行操作，并做以下修改将RLTbuffer的体积调整为细胞悬浮液的3. 5倍，每ImL RLTbuffer中加入10 μ L0^me,并省略步骤QIAshredder，具体总RNA的提取过程如下(1)将分选得到的细胞悬浮液与RTL buffer充分混勻，涡旋震荡使细胞破碎，得到混合液；(2)加入与上述混合液相同体积的质量百分比浓度为70%的乙醇，混勻；(3)将液体转移至RNeasy柱，10, OOOrpm离心lmin，弃去流下的液体；(4)往 RNeasy 柱中加入 700 μ LRPE buffer, 10，OOOrpm 离心 30sec，弃去流下的液体；(5)往 RNeasy 柱中加入 500 μ LRfflbuffer, 10，OOOrpm 离心 30sec，弃去流下的液体；(6)重复步骤(5)；(7)最大转速使RNeasy柱离心lmin，以除去残留的乙醇；(8)将 RNeasy 柱放入 1. 5mL 离心管中，加入 30 μ LDEPC 水，10, OOOrpm 离心 lmin， 洗脱RNA ；(9)将 RNA 置于-80 V 保存。本发明提供的方法的优点在于(1)可以在较短时间内收集到较多的处于分裂期的细胞，显著提高了实验效率。(2)与传统的分离方法相比，可以更准确的分离到处于正在分裂的细胞。(3)利用分选出的细胞提取的RNA完整度高，质量好，用于后续基因表达谱的研究更可靠。
图1为激光共聚焦显微扫描检测拟南芥转基因株系CYCB GFP基因的表达部位扫描图；图2为拟南芥根尖分裂细胞原生质体的收集的显微观察结果；图3为FACS分选散点图；图4为总RNA纯度、完整度的检测及RT-PCR。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
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下面通过实施例来说明本发明提供的一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法，主要用于分离拟南芥根尖分裂的细胞，具体通过如下步骤实现步骤1、激光共聚焦显微观察，确定正在分裂细胞的位置。本发明以在根尖发育早期的正在分裂的细胞中表达CYCB::GFP绿色荧光蛋白的拟南芥转基因植物，拟南芥幼苗用lOyg/mLWpropidium iodide (PI,sigma)染色2分钟， 制成水封装片，用激光共聚焦扫描显微镜Leica SP2(德国Leica)观察。将上述制成的水封装片，置于激光共聚焦扫描显微镜Leica SP2下观察，观察结果显示正在分裂的细胞位于拟南芥幼苗初生根的分生区，如图1所示为生长5天的拟南芥幼苗初生根激光共聚焦显微扫描图。图1中，图A为野生型拟南芥初生根激光共聚焦显微镜观察结果，无GFP荧光；图B为转基因拟南芥CycBl GFP初生根激光共聚焦显微镜观察结果， GFP荧光只存在于根尖分生区的部分细胞中，如图B中箭头所示灰色点部分，Bar = SOym0步骤2、根尖原生质体的制备。具体为(1)将70微米孔径的滤膜放入小培养皿，并在小培养皿中加入酶解缓冲液；所述的酶解缓冲液具体配方为质量分数为1.2-1. 5%纤维素酶，质量分数为
0.1-0. 15%果胶酶，300-600mmol ·厂1 甘露醇，1. 5-2mmol · I^MgCl2，质量分数为 0. 牛血清白蛋白，1. 5-2mmol · L-1CaCl2^mmol · Γ1 的 2-吗啉乙磺酸，10_15mmol · L-1KCl, pH 5. 5， 上述的百分数均为质量百分比，其余为水溶剂。优选的，选择酶解缓冲液具体配方为1. 5%纤维素酶，0. 果胶酶，600mmol · Γ1 甘露醇，2mmol · L^1MgCl2jO. 牛血清白蛋白(BSA)，2mmol · L-1CaCl2^mmol · Γ1 的 2-吗啉乙磺酸(MES)，IOmmol · L^lKCl, pH 5. 5，上述的百分数均为质量百分比，其余为水溶剂。(2)用刀片切取根尖(3毫米)放入酶解缓冲液中，在水平摇床上以80 100转/ 分钟(优选85转/分钟)的转速摇动，25 °C避光酶解60分钟，形成酶解混合物。(3)将酶解混合物转入离心管中，2_8°C (优选2_4°C或4°C )，200_600Xg(优选200-350 X g或350 X g)条件下离心5_10分钟收集细胞，除去上清液，继续向离心管中加入ImL的等渗缓冲液，所述的等渗缓冲液配方为300-600mmol · L—1甘露醇，
1.5-2mmol .I^MgCl2，质量分数为 0. 牛血清白蛋白，1. 5_2mmol 'L-1CaCl2^mmol .1^2-吗啉乙磺酸，10-15mmol · L^1KCl, pH 5. 5，其余为水溶剂。优选的，选择等渗缓冲液配方为:600mmol · L-1甘露醇，2mmol · I^1MgCl2，质量分数为0. 1 %牛血清白蛋白(BSA)，2匪ol · L^1CaCl2, 2匪ol · 吗啉乙磺酸(MES)， IOmmol · L^1KCl, pH 5. 5，其余为水溶剂。(4)重悬，采用70微米孔径的滤网和40微米孔径的滤网各过滤一次，在显微镜下观察细胞完整性。细胞的完整性如图2所示，图2中A图为CYCB: :GFP根尖细胞原生质体， 明场观察结果；B图为图A所示视野CYCB: GFP植物根尖细胞原生质表达绿色荧光蛋白(图中灰色的点所示，488nm激发)；C图为野生型拟南芥根尖原生质体，明场观察结果；D图为图C所示视野中野生型拟南芥根尖原生质体在488nm下无荧光。Bar = 40 μ m,结果表明所分离的拟南芥根尖整体原生质体分离完全，可以用于下一步的分选。步骤3、FASC细胞分选。用FACS Aria流式细胞仪(美国BD FACS Aria)分选原生质体中带GFP的细胞。分选时所采取的参数为100μπι喷嘴，488纳米蓝光激发，鞘液压力为20psi。细胞直接分选至RNAbuffer中^liagen RLT buffer)，混勻立刻冻存于_80°C，具体实现步骤如下(1)流式细胞仪的调试。调节主液流选定100 μ m喷嘴，超声清洗1分钟。开机后，打开主液流断点窗口， 点击主液流，调节液流振动幅度(Ampl)，使液滴间隔值(Gap值)稳定，调试参数至主液流的连续性和稳定性。调节分选液流主液流稳定后，打开侧液流窗口电压，点击Test Sort，调整参数， 使液流分束清晰。安装四路分选装置，打开侧液流窗口电压，点击Test Sort，收起废液抽屉，调整侧液流窗的电压滚动条，使偏转的分选液流落入相应的收集管中。将主液流窗中实际调出的Dmpl值添到默认窗口中。确定液滴延迟运行流式细胞仪配套的标准质控物Accrodrop Beads,调整Drop delay 值。(2)分选门的设定。以野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana Columbia-O)根尖原生质体作阴性对照，转基因植株Wer: :GFP根尖原生质体作阳性对照，建立分选门。分选门的确定基于以下几个原则完整的原生质体具有较高的前向角(FSC)和侧向角(SSC)比值；相对于阴性对照，GFP阳性细胞在绿光荧光通道( 530纳米)有强烈的发射光，使得每秒钟大于100个阳性细胞落在分选门内。一般认为，前向角应该在50 IOOX IO3处，最好落于100X 103。(3) FASC 分选参数；前向角FSC指示细胞大小，前向角电压(FSC Voltage) :184V ；侧向角SSC指示细胞复杂度，侧向角电压(SSC Voltage) :120V ；设定前向角阈值排除细胞碎片，前向角阈值(FSC Threshold value) :1000 ；绿色荧光通道FITC指示细胞绿色荧光强度，绿色荧光通道电压(FITC Voltage) 368V ；橙色荧光通道PE指示细胞橙色荧光强度，橙色荧光通道电压(PE Voltage) 430V ；鞘液压力(Sheath pressure) :20psi ；流速(Flow rate) :2，000-5，OOOevents per secend ；此参数下的FSC vs. SSC散点图如图3所示，图3中A 野生型拟南芥原生质体双参数分析，说明野生型拟南芥细胞自发荧光，在绿色荧光通道(横坐标)和橙色荧光通道 (纵坐标)有近似相等的荧光强度；B =Wer :GFP原生质体双参数分析，说明ffer :GFP转基因植物分选门Pl中的细胞散射出的绿色荧光远大于橙色荧光，这些细胞是对照的GFP阳性细胞；C-D =CycBl :GFP原生质体的FASC分选。步骤4、总RNA的提取。使用RNeasy Plant Mini Kit ^liagen)试剂盒提取分选细胞的总RNA，按照试剂盒上的说明进行操作，并做以下修改将RLT buffer的体积调整为细胞悬浮液的3. 5倍，每 ImLRLTbuffer中加入10 μ Lj^me，并省略步骤QIAshredder，具体总RNA的提取过程如下(1)将分选得到的细胞悬浮液与RLTbufTer充分混勻，涡旋震荡使细胞破碎，得到混合液；
(2)加入与上述混合液相同体积的乙醇，混勻；所述乙醇的质量百分比浓度为 70% ；(3)将液体转移至RNeasy柱，10, OOOrpm离心lmin，弃去流下的液体；(4)往 RNeasy 柱中加入 700 μ LRPE buffer, 10，OOOrpm 离心 30sec，弃去流下的液体；(5)往 RNeasy 柱中加入 500 μ LRfflbuffer, 10，OOOrpm 离心 30sec，弃去流下的液体；(6)重复步骤(5)；(7)离心转速设置为14000g以上使RNeasy柱离心lmin，以除去残留的乙醇；(8)将RNeasy柱放入1. 5mL离心管中，加入30 μ L焦碳酸二乙酯(DEPC)水， 10，OOOrpm 离心 lmin，洗脱 RNA ；(9)将 RNA 置于 _80°C保存。超微量分光光度计(NanoDrop)检查RNA的量和纯度，Agilent 2100生物分析仪检测其完整性，进行总RNA的定量和质量检测。如图4所示，A 总RNA在Agilent 2100生物分析仪中的检测结果；B 看家基因UBQ的RT-PCR扩增产物电泳图。M :DL2000maker ；UBQ UBIQUITIN，结果显示，RNA分离完整，并且可以用于后续的基因表达分裂。根据上述的制备方法，改变第二步中所述的酶解缓冲液的配方为质量分数为 1. 2%纤维素酶，质量分数为0. 15%果胶酶，300mmol 甘露醇，1. 5mmol ^r1MgCl2,质量分数为 0. 牛血清白蛋白，1. 5mmol 'T1CaCl2^mmol .171 的 2-吗啉乙磺酸，15mmol 'U1KCl, PH5. 5，上述的百分数均为质量百分比，其余为水溶剂。改变等渗缓冲液配方为300mmol · L—1甘露醇，1. 5mmol · L4MgCl2,0. 牛血清白蛋白，1.5mmol 'T1CaCl2^mmol .1^2-吗啉乙磺酸，15mmol · L-1KCl, pH 5. 5，其余为水溶剂。其余的条件不变，得到的拟南芥根尖RNA仍然是分离完整的。本发明中，酶在植物原生质体分离中不可缺少，目前主要应用的酶有纤维素酶、果胶酶、离析酶、半纤维素酶、崩溃酶、蜗牛酶等。而酶的选取、搭配，尤其是浓度配比在植物原生质体的分离中起到至关重要的作用，本发明中采取纤维素酶和果胶酶两种，取得了较好的分离结果，并且二者的浓度配比，在1.2 1,1.3 1,1.4 1,1.5 1的情况下，均可以分离得到该类分裂细胞，即可以扩展到1.2-1. 5 1范围内。其中在1.5 1的条件下效果最佳。在流式细胞分选前的参数设定和调试是细胞分选的关键性工作，其中前向角散射 (FSC)可以用来检测细胞的大小，通过调试，本发明将前向角电压设置为184，前向角阈值设置为1000，不仅有效的分离了正在分裂的细胞，而且排除了样品中的各种碎片和小颗粒物质对被分离细胞的干扰，提高了分选的效率、纯度和精度，适用于该类分裂细胞的分选。本发明采用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取分选细胞的总 RNA，并做出适当调整，由于样品中无高粘度的植物裂解物，故省略QIAshredder分离柱离心步骤；本方法调整RLT buffer的体积为细胞悬浮液的3. 5倍，为分离得到的该类细胞提供一个最适的缓冲空间，并能够使得到的细胞混合物中的RNA酶(RNase)迅速失活，保证了分离RNA的完整性。
权利要求
1.一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法，其特征在于包括如下步骤 第一步、将拟南芥幼苗用lOyg/mLWpropidium iodide染色，制成水封装片，用激光共聚焦扫描显微镜Leica SP2观察，确定原生质体位置； 第二步，根尖原生质体的制备； 具体为(1)将70微米孔径的滤膜放入小培养皿，加入酶解缓冲液；(2)用刀片切取根尖放入上述的酶解缓冲液中，在水平摇床上以80-100转/分钟的转速摇动，25 °C避光酶解60分钟，形成酶解混合物；(3)将酶解混合物转入离心管中，2-80C，200-600X g离心5_10分钟收集细胞，除去上清液，加入ImL的等渗缓冲液；重悬，70微米孔径的滤网和40微米孔径的滤网各过滤一次，得到根尖原生质体； 所述的酶解缓冲液具体配方为质量分数为1.2-1. 5%纤维素酶，质量分数为 0. 1-0. 15%果胶酶，300-600mmol ·厂1 甘露醇，1. 5-2mmol · T1MgCl2，质量分数为 0. 牛血清白蛋白，1. 5-2mmol · L-1CaCl2^mmol · Γ1 的 2-吗啉乙磺酸，10_15mmol · L-1KCl, pH 5. 5， 上述的百分数均为质量百分比，其余为水溶剂；所述的等渗缓冲液具体为300-600mmol · L—1甘露醇，1. 5-2mmol · I^1MgCl2，质量分数为 0. 牛血清白蛋白，1. 5-2mmol 'L-1CaCl2^mmol d 吗啉乙磺酸，10_15mmol .L-1KCl, PH 5. 5，其余为水溶剂;第三步、FASC细胞分选；用FACS Aria流式细胞仪分选原生质体中带GFP的细胞，分选时所采取的参数为 100 μ m喷嘴，488纳米蓝光激发，鞘液压力为20psi ；细胞直接分选至RNA buffer中，混勻立刻冻存于_80°C ；第四步，总RNA的提取；使用RNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取分选细胞的总RNA，按照试剂盒上的说明进行操作，并做以下修改将RLHxiffer的体积调整为细胞悬浮液的3. 5倍，每ImL RLTbuffer 中加入10 μ Le_ME，并省略步骤QIAshredder，具体总RNA的提取过程如下(1)将分选得到的细胞悬浮液与RLTbufTer充分混勻，涡旋震荡使细胞破碎，得到混合液；(2)加入与上述混合液相同体积的质量百分比浓度为70%的乙醇，混勻；(3)将液体转移至RNeasy柱，10,OOOrpm离心lmin，弃去流下的液体；(4)往RNeasy柱中加入700μ L RPE buffer, 10，OOOrpm离心30sec，弃去流下的液体；(5)往RNeasy柱中加入500μ L Rffl buffer, 10，OOOrpm离心30sec，弃去流下的液体；(6)重复步骤(5)；(7)离心转速设置为14000g以上使RNeasy柱离心lmin，以除去残留的乙醇；(8)将RNeasy柱放入1.5mL离心管中，加入30 μ L DEPC水，10，OOOrpm离心lmin，洗脱RNA ；(9)将RNA置于-80°C保存。
2.根据权利要求1所述的一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法，其特征在于所述的第三步FASC细胞分选的过程包括流式细胞仪的调试、分选门的设定、FASC分选参数设定三部分，具体如下(1)流式细胞仪的调试；调节主液流选定100 μ m喷嘴，超声清洗1分钟；开机后，打开主液流断点窗口，点击主液流，调节液流振动幅度；使液滴间隔值稳定，调试参数至主液流的连续性和稳定性；调节分选液流主液流稳定后，打开侧液流窗口电压，点击Test Sort，调整参数，使液流分束清晰；安装四路分选装置，打开侧液流窗口电压，点击Test Sort，收起废液抽屉，调整侧液流窗的电压滚动条，使偏转的分选液流落入相应的收集管中，将主液流窗中实际调出的Dmpl值添到默认窗口中；确定液滴延迟运行流式细胞仪配套的标准质控物Accrodrop Beads，调整Drop delay值；(2)分选门的设定；以野生型拟南芥根尖原生质体作阴性对照，转基因植株ffer: :GFP根尖原生质体作阳性对照，建立分选门，分选门的确定基于以下几个原则完整的原生质体具有较高的前向角和侧向角比值；相对于阴性对照，GFP阳性细胞在绿光荧光通道有强烈的发射光；(3)FASC分选参数；前向角FSC指示细胞大小，前向角电压184V;侧向角SSC指示细胞复杂度，侧向角电压120V;设定前向角阈值排除细胞碎片，前向角阈值1000 ；绿色荧光通道FITC指示细胞绿色荧光强度，绿色荧光通道电压368V ；橙色荧光通道PE指示细胞橙色荧光强度，橙色荧光通道电压430V ；鞘液压力20psi ；流速:2, 000-5, OOOevents per secend ；
3.根据权利要求2所述的一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法，其特征在于所述的强烈的发射光是满足每秒钟大于100个阳性细胞落在分选门内；较高的前向角和侧向角比值为满足前向角在50 100X IO3处。
4.根据权利要求1所述的一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法，其特征在于所述的酶解缓冲液具体为^；^纤维素酶…^^果胶酶力。。 “ · L—1甘露醇， 2匪ol · L^1MgCl2jO. 1 %牛血清白蛋白，2匪ol · L-1CaCl2, 2匪ο · Γ1的2-吗啉乙磺酸， IOmmol · L^lKCl, ρΗ 5. 5，上述的百分数均为质量百分比，其余为水溶剂；所述的等渗缓冲液具体为600mmol · L—1甘露醇，2mmol · L-1MgCl2，质量分数为0. 牛血清白蛋白，2mmol ‘ L-1CaCl2^mmol · L、-吗啉乙磺酸，IOmmol · I^KCl，pH 5. 5，其余为水溶剂。
全文摘要
本发明公开了一种采用流式细胞仪分选正在分裂细胞的方法，属于生物技术领域，该方法首先将拟南芥幼苗用10μg/mL的propidium iodide染色，制成水封装片，用激光共聚焦扫描显微镜Leica SP2观察，确定原生质体位置；然后进行根尖原生质体的制备；利用FASC细胞分选；并最后进行总RNA的提取。本发明提供的方法可以在较短时间内收集到较多的处于分裂期的细胞，显著提高了实验效率。与传统的分离方法相比，可以更准确的分离到处于正在分裂的细胞。利用分选出的细胞提取的RNA完整度高，质量好，用于后续基因表达谱的研究更可靠。
文档编号C12N5/04GK102250825SQ201110169028
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者何奕騉, 姚涛, 李斐, 李苗苗, 白素兰, 胡勇 申请人:首都师范大学