专利名称：控制花粉雄性不育钙波动的分子开关及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地涉及控制花粉雄性不育钙波动的分子开关及其应用。
背景技术：
花粉的正常萌发生长是精子细胞顺利到达胚囊、并实现受精作用的前提，并且对高等植物有性生殖起至关重要的作用。花粉管的生长涉及一系列复杂的过程，各种矿质元素在这其中起着重要的作用，大量研究表明花粉的离体萌发和花粉管生长需要适当的钙离子浓度。Ca2+可通过多种途径影响花粉萌发和花粉管的生长，其中涉及细胞骨架的组装、分泌小泡的运输、融合花粉管顶端脉冲式生长以及花粉管生长方向调控等各个方面。那么在这些现象的背后究竟存在什么样的分子机制来做到植物极性生长的精确调控。Ca2+作为植物细胞中最重要的第二信使，参与植物的极性生长发育以及对逆境信号的转导。在非生物逆境条件下，植物细胞质内的钙离子在时间、空间及浓度上会出现特异性变化，即诱发产生钙信号。钙信号再通过其下游的钙结合蛋白进行感受和转导，进而在细胞内引起一系列的生物化学反应来调节植物生长或者适应或抵制各种逆境胁迫。目前在植物细胞中发现Ca27CDH(、Ca27CaM和Ca2+/CBL 3类钙信号系统。其中CaM是植物细胞中最重要的一类钙信号传感元件，含有150个左右的氨基酸残基，并且不同钙调素之间结构非常保守。每个钙调素中都含有4个长度为12个氨基酸残基的EF手型结构，它们各与一个钙离子结合，引起钙调素构像发生变化从而激活钙调素行使信号转导功能。钙调素作为一类重要的信号传递信使主要是通过与CaM结合蛋白(CaMBP)结合来调节细胞内的一些生理生化反应。我们通过研究Ca2+、钙调蛋白、通道蛋白来说明介绍一种具有普遍生物学意义的钙信号波动控制与解码的分子开关。
发明内容
本发明的目的是提供一种Ca27Mg2+通道分子CAC-I。本发明的再一目的是提供上述Ca27Mg2+通道分子CAC-I的抑制剂CAC-2。本发明的另一目的是提供一种与上述Ca27Mg2+通道分子CAC-I和抑制剂CAC-2相互作用的钙结合蛋白CMA。本发明的另一目的是提供钙信号开关分子。根据本发明的Ca27Mg2+通道分子CAC-1，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。根据本发明的所述Ca2+/Mg2+通道分子CAC-I的抑制剂CAC-2，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。根据本发明的钙结合蛋白CMA，其氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示；其核苷酸序列如 SEQ ID No. 6 所示。根据本发明的钙信号开关分子，包含上述Ca27Mg2+通道分子CAC-l、Ca27Mg2+通道分子CAC-I的抑制剂CAC-2、以及钙结合蛋白CMA，其中，CAC-2抑制Ca2+/Mg2+通道分子CAC-I 的钙通道活性，CMA与CAC-2和CAC-I同时相互作用，解除了 CAC-2对CAC-I钙离子转运活性的抑制。本发明还提供了上述钙信号开关分子调节植物体内钙流波动的应用。本发明还提供了上述钙信号开关分子用于调控植物雄性不育的应用。根据本发明的具体实施例，以调节植物花粉管的极性生长的分子开关为例，进行详细描述，两个同源基因编码的蛋白互相调控与第三个钙结合蛋白组成精巧的钙信号开关分子，共同调节花粉管钙离子通道的活性和钙离子信号的波动与解码，从而精确控制植物花粉管的延伸或缩短，以调控植物的雄性不育，这不仅有重大的应用价值，更有普遍的生物学意义。发明的发明人经研究发现基因CAC-I是植物花粉管中的钙离子通道，并且同源体 CAC-2能抑制CAC-I的活性，但是在CMA存在的情况下能解除这种抑制，具体地1、CAC-I具有内向整流的钙离子和镁离子通道特性；2、同源体CAC-2能够与CAC-I相互作用并且抑制CAC-I钙通道的活性；3、根据本发明的钙信号开关分子的各个元件的相互作用有两种方式CAC_2与 CAC-I通过C-端直接作用，从而抑制CAC-I钙通道的活性；CAC-2通过CMA与CAC-I作用；4、CMA与CAC-2和CAC-I同时相互作用，解除了 CAC-I对CAC-I钙离子转运活性的抑制；5、钙离子内流可以与CMA结合，反馈调节CAC-I与CAC-2的亲和性，而导致钙离子内流的波动；6、两个同源基因编码的蛋白CAC-I、CAC_2互相调控与第三个钙结合蛋白CMA组成精巧的开关分子，由此控制的花粉管延伸或缩短，精确调控植物雄性不育；7、上述钙信号波动机制及解码，同样存在于植物根毛的延伸、保卫细胞的发育、病理的反应或其他的生理过程，具有普遍的生物学意义及其应用。
图1显示了 CAC-I和CAC-2的离子转运特性；图2显示CAC-2抑制了 CAC-I的钙离子转运活性，CMA解除了这种抑制作用；图3显示了 CAC-1、CAC-2和CMA之间的相互作用与作用特异位点。图4显示CAC-I与CAC-2相互作用维持花粉管的延长，CMA解除CAC-2抑制CAC-I 的作用，抑制花粉管延长；
具体实施例方式实施例1、CAC-1、CAC-2、CMA基因的克隆1、拟南芥的培养土壤中培养拟南芥时，将吸水饱和并经4°C处理2-3天后的种子均勻地播种于按照1/3比例混合蛭石的营养土上，黑暗避光萌芽生长，待长出真叶后移至正常光照下培养。 生长期间浇水保持土壤湿润。培养皿中无菌培养拟南芥时，要先对种子进行表面消毒。将适量干燥的拟南芥种子置于1.5mL小离心管中，先用适量的无水乙醇消毒30sec，再用ImL 10-15%的次氯酸钠溶液浸泡5-lOmin，然后用无菌水漂洗3_5次，置于4°C同步化处理2 3天后，均勻地点种于1/2MS培养基上。培养条件温度20_23°C，光照强度80-200 μ mol n^sec—1，光周期为16h光照/8h黑暗交替或者连续光照，湿度约为70%。2、总RNA的提取3、总RNA逆转录1)按hvitrogen Super ScripIII操作说明书进行，第一步反应体系为dNTP 混和物(各 IOmM)Ιμ OligodT-接头引物 Ιμ
模板RNA l-5ug (根据分光光度仪测的浓度计算需要的体积数)
水_
13.0μ1加热到65°C，5min。2)冰上放置至少Imin3)第二步反应体系为
5XFirst-strand buffer4μ1
0. IM DTTΙμ
RNase InhibitorIul
Super ScriptIIIIul
第一步反应产物_Iul_
20.0μ1反应条件为50°C90min ；70 °C 15min。4、CAC-I基因全长的获得 if 弓I · Primerl 5-CGGGATCCATGAATAAAATCCGGTCT-3, Primer2 5-GGAATTCTTAAACGTCTTCTTTATC-3，将上述反转录产物稀释50倍为摸板，反应体系及条件如下
RT模板 10XPCR缓冲 dNTP
TaKaRa ExTaq Primer 1 Primer 2
Ιμ 5μ1 5μ1 Ιμ 2ul 2ul
H2O
34ul
50μ1
反应参数
94 °C 94 °C 55 °C
72 °C
10 min 30sec 40sec 2 min
IOmin
1个循环
33个循环
1个循环
72 °C5、PCR产物的回收将PCR产物在1 %琼脂糖上电泳，紫外灯下切取目的条带并切碎胶块后，按OMEGA Gel Extraction Kit 操作(由 OMEGA 生产)。6、PCR产物的连接和转化取纯化后的PCR产物各1 μ 1，与Promega公司的pGEM -T easy vector连接(按照其产品说明书操作)。将连接产物热击转化入E. coli DH5 α感受态细胞，挑选阳性克隆测序。CAC-I基因的测序结果显示，该基因全长^07bp，具有2121bp的开放阅读框，编码 707个氨基酸的蛋白质。CAC-I基因具有以下开放阅读框核苷酸序列ATGAATAAAATCCGGTCTCTCCGCTGCCTCCTCCCGGAGACCATAACCTCCGCCTCCACCGCCGCCTCAAATCGAGGATCTGACGGTAGCCAATTCAGCGTCCTATGGCGGCATCAGATCCTGGACCCGGACAGCAACATCGTCACCTATTGGAACCACGTCTTTCTCATTACCTCAATCCTCGCTCTCTTCCTCGATCCTTTCTATTTCTACGTCCCTTACGTCGGTGGTCCGGCGTGTCTCTCCATCGACATCAGCCTCGCCGCTACTGTCACTTTCTTCCGTACAGTCGCCGATATCTTCCACCTCTTGCACATTTTCATGAAATTCAGAACTGCGTTCGTCGCGAGGAGTTCTCGTGTTTTTGGTCGCGGTGAGCTTGTTATGGATTCTAGAGAGATTGCTATGAGATACTTGAAGACAGATTTCCTCATTGATGTCGCCGCCATGCTTCCCCTTCCTCAGCTTGTTATTTGGCTAGTAATTCCAGCGGCCACAAATGGAACTGCTAATCATGCCAATAGCACTCTCGCACTTATCGTTCTTGTTCAATACATTCCAAGATCATTCATCATATTCCCACTCAACCAAAGGATTATC
AAAACAACCGGGTTTATCGCCAAGACTGCTTGGGCAGGAGCTGCATACAACCTCCTATTGTACATCCTTGCTAGTCACGTGTTAGGAGCAATGTGGTATCTGTCATCAATCGGGCGGCAGTTTTCGTGCTGGTCCAACGTATGCAAGAAAGACAACGCTTT
GAGAGTTTTGGATTGTCTTCCTAGCTTCTTGGATTGCAAGAGTTTAGAACAACCAGAGCGCCAGTATTGGCAGAACGTTACTCAGGTCCTTTCTCATTGTGATGCTACAAGCAGCACTACCAATTTCAAATTCGGAATGTTTGCTGAAGCCTTTACCACTCAAGTTGCTACAACAGATTTTGTGTCCAAGTACTTGTATTGTCTTTGGTGGGGTTTAAGAAATCTAAGTTCTTATGGACAGAATATAACCACAAGTGTATACCTTGGCGAGACCTTGTTCTGTATAACAATTTGTATTTTTGGGTTGATTCTCTTCACACTCCTGATTGGTAACATGCAATCTTCTCTGCAATCGATGTCAGTAAGAGTTGAGGAATGGAGAGTTAAGAGAAGAGACACTGAAGAATGGATGAGACATCGTCAACTACCTCCAGAGCTTCAAGAACGTGTCCGAAGATTTGTCCAATACAAATGGCTTGCAACCAGAGGTGTCGATGAAGAATCAATCCTCCATTCATTACCTACAGATTTACGCCGTGAAA
TCCAACGTCATCTTTGTCTCTCCCTTGTTCGCCGGGTCCCGTTCTTCTCTCAAATGGATGATCAACTTCTTGATGCTATATGCGGATGCCTTGTCTCATCTTTAAGCACGGCCGGGACATACATATTCCGTGAAGGTGATCCGGTGAATGAGATGCTATTTGTGATCCGAGGACAAATAGAGAGCTCAACAACAAATGGAGGAAGATCTGGTTTCTTCAACTCCACTACTCTACGACCTGGCGATTTCTGTGGGGAAGAACTTCTTACATGGGCCTTAATGCCAAACTCTACACTCAATCTTCCGTCTTCAACACGAAGCGTCCGTGCCCTCTCTGAAGTAGAAGCCTTTGCATTAAGCGCAGAGGATCTTAAGTTTGTTGCTCATCAGTTCAAACGTCTTCAAAGCAAAAAGCTTCAACACGCTTTCAGGTACTACTCACATCAATGGAGAGCATGGGGAGCATGTTTTGTCCAATCTGCATGGAGAAGATACAAGCGAAGAAAGCTTGCGAAAGAGCTCAGCCTTCACGAGAGTAGCGGATACTATTACCCGGATGAAACAGGTTACAATGAAGAAGACGAAGAAACTAGAGAGTATTACTATGGAAGTGACGAGGAAGGCGGATCAATGGACAACACAAATCTGGGAGCAACGATCTTAGCATCTAAATTTGCGGCGAACACGAGAAGAGGAACAAATCAAAAGGCTTCAAGTAGTAGTACTGGTAAGAAAGATGGATCTTCCACCAGTTTGAAGATGCCTCAACTATTCAAACCAGATGAGCCTGATTTCTCTATAGATAAAGAAGACGTTTAA2121其编码的蛋白质的氨基酸序列为MNKIRSLRCLLPETITSASTAASNRGSDGSQFSVLWRHQILDPDSNIVTYWNHVFLITSILALFLDPFY FYVPYVGGPACLSIDISLAATVTFFRTVADIFHLLHIFMKFRTAFVARSSRVFGRGELVMDSREIAMRYLKTDFLID VAAMLPLPQLVIWLVIPAATNGTANHANSTLALIVLVQYIPRSFIIFPLNQR11KTTGFIAKTAWAGAAYNLLLYIL ASHVLGAMWYLSSIGRQFSCWSNVCKKDNALRVLDCLPSFLDCKSLEQPERQYWQNVTQVLSHCDATSSTTNFKFGM FAEAFTTQVATTDFVSKYLYCLWWGLRNLSSYGQNITTSVYLGETLFCITICIFGLILFTLLIG匪QSSLQSMSVRV EEWRVKRRDTEEWMRHRQLPPELQERVRRFVQYKWLATRGVDEESILHSLPTDLRREIQRHLCLSLVRRVPFFSQMD DQLLDAICGCLVSSLSTAGTYIFREGDPVNEMLFVIRGQIESSTTNGGRSGFFNSTTLRP⑶FCGEELLTWALMPNS TLNLPSSTRSVRALSEVEAFALSAEDLKFVAHQFKRLQSKKLQHAFRYYSHQWRAWGACFVQSAWRRYKRRKLAKEL SLHESSGYYYPDETGYNEEDEETREYYYGSDEEGGSMDNTNLGATILASKFAANTRRGTNQKASSSSTGKKDGSSTS
7LKMPQLFKPDEPDFSIDKEDV7、CAC-2基因全长的获得设计5，端引物 Primerl :5-CGGGATCCATGTCATCTAATGCTACG_3，3，端引物 Primer2 5-GCTCTAGATTAGTTCAAGTCATCTGT-3，将上述反转录产物稀释50倍为摸板，反应体系及条件如下
RT模板Ιμ
10XPCR 缓冲5μ1
dNTP5μ1
TaKaRa ExTaq1 μ
Primer 1 2ul Primer 2 2ul H2O_34ul
50μ1反应参数
94 0C10 min1个循环94 0C30sec55 0C40sec33个循环72 0C2 minlOsec72 0CIOmin1个循环CAC-2基因的测序结果显示，该基因全长^94bp，具有2262bp的开放阅读框，编码 753个氨基酸的蛋白质。CAC-2基因具有以下开放阅读框核苷酸序列ATGTACAAATCTCAATATATAAGTGGCCATAGAGAAAAATTCGTAAGATTAGATGATACAGATTCGAGGGTTTCAATGTCATCTAATGCTACGGGAATGAAGAAGCGATCATGTTTTGGATTGTTTAACGTAACTAGTCGTGGAGGAGGAAAGACAAAGAACACATCAAAATCATTTCGAGAAGGTGTTAAAATCGGATCAGAGGGTCTAAAAACGATCGGAAAATCATTCACATCAGGTGTAACAAGAGCTGTTTTCCCTGAAGATCTAAGAGTCTCCGAGAAGAAAATCTTTGATCCTCAAGACAAAACACTTTTATTATGGAACAGAATGTTTGTTATCTCTTGCATTCTTGCTGTCTCTGTTGATCCTCTGTTCTTCTATCTCCCTATTGTCGATAACTCAAAGAACTGCATTGGGATTGACTCTAAATTAGCTGTGACAACTACTACTCTAAGAACGATCATCGATGTTTTTTATCTTACACGAATGGCTCTTCAGTTCCGTACCGCTTACATTGCTCCTTCTTCTCGTGTGTTTGGAAGAGGTGAGCTTGTGATCGACCCTGCAAAGATCGCTGAACGGTATTTGACTCGTTATTTCATTGTCGATTTCCTCGCGGTTCTTCCTTTACCTCAGATTGCTGTGTGGAAGTTTCTTCACGGATCTAAAGGAACAGATGTATTACCAACAAAACAGGCGCTATTACACATTGTCATCACACAGTACATACCAAGATTCGTTAGGTTTATTCCATTAACT
TCAGAGCTCAAGAAAACAGCAGGAGCTTTCGCTGAAGGTGCTTGGGCTGGTGCTGCTTATTACCTCCTCTGGTATATGCTTGCAAGTCACATAACTGGAGCGTTCTGGTACATGTTGTCAGTGGAACGTAACGATACATGCTTGAGATCCGCTTGTAAAGTCCAGCCTGATCCCAAGGTCTGTGTTCAGATTCTTTATTGTGGCAGCAAATTAATGAGCAGTCGCGAAACCGACTGGATCAAATCAGTCCCTGATCTTTTTAAGAACAATTGTTCTGCTAAAAGCGATGAGTCTAAATTCAACTACGGGATCTATAGCCAGGCTGTGTCTTCCGGTATTGTATCTTCGACAACGTTTTTCTCCAAGTTTTGTTATTGTCTATGGTGGGGTCTCCAAAATCTCAGCACGTTAGGTCAAGGGCTGCAAACAAGTACATATCCAGGAGAAGTTTTGTTTTCAATTGCAATTGCTGTAGCTGGACTTCTTTTGTTTGCTCTTCTCATTGGGAATATGCAAACTTATCTTCAGTCACTTACGGTTCGCTTAGAGGAAATGAGGATTAAAAGACGTGATTCCGAACAGTGGATGCATCACAG GTCACTTCCACAAAACCTGAGGGAACGAGTCAGACGTTATGATCAATACAAATGGTTGGAAACAAGAGGAGTCGACGAAGAAAACATAGTCCAGAGTTTACCAAAAGATCTTAGAAGAGACATCAAACGCCATCTCTGTCTAAATTTAGTTCGCAGGGTTCCTCTGTTTGCTAATATGGATGAGAGATTACTAGACGCAATATGTGAGAGACTAAAGCCAAGTCTATACACAGAGAGCACTTACATAGTGCGAGAAGGAGACCCGGTTAACGAAATGCTCTTCATAATCCGAGGCCGGTTAGAGAGTGTAACAACAGATGGTGGAAGAAGCGGTTTCTTTAACAGAGGTTTATTGAAAGAAGGTGACTTTTGTGGTGAAGAGCTTCTGACTTGGGCACTTGACCCTAAAGCAGGCTCAAACTTACCTTCTTCCACACGAACAGTGAAGGCTCTAACTGAAGTAGAGGCTTTCGCTTTAGAAGCGGAAGAGCTCAAGTTTGTGGCTAGTCAGTTCAGGCGTCTTCACAGTCGTCAGGTTCAACAAACTTTCAGGTTTTACTCTCAACAATGGAGGACTTGGGCTGCTTGTTTCATCCAAGCCGCTTGGCGTAGACATTTAAGAAGGAAAATCGCAGAGCTTAGACGTAAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAATGGATTATGAAGATGATGAATATTATGATGATAATATGGGTGGTATGGTTACAAGGAGTGATAGTTCTGTTGGATCAAGTTCTACATTACGTTCCACGGTATTTGCATCAAGATTTGCTGCTAACGCGCTTAAGGGTCATAAACTAAGGGTCACCGAGAGTTCAAAGAGTTTAATGAATTTAACAAAGCCATCAGAACCTGACTTTGAGGCTCTTGATACAGATGACTTGAACTAA其编码的蛋白质的氨基酸序列为MYKSQYISGHREKFVRLDDTDSRVSMSSNATGMKKRSCFGLFNVTSRGGGKTKNTSKSFREGVKIGSE GLKTIGKSFTSGVTRAVFPEDLRVSEKKIFDPQDKTLLLWNRMFVISCILAVSVDPLFFYLPIVDNSKNCIGIDSK LAVTTTTLRTIIDVFYLTRMALQFRTAYIAP S SRVFGRGELVIDPAKIAERYLTRYFIVDFLAVLPLPQIAVWKF LHGSKGTDVLPTKQALLHIVITQYIPRFVRFIPLTSELKKTAGAFAEGAWAGAAYYLLWYMLASHITGAFWYMLSVE RNDTCLRSACKVQPDPKVCVQILYCGSKLMSSRETDWIKSVPDLFKNNCSAKSDESKFNYGIYSQAVSSGIVSSTTF FSKFCYCLWWGLQNLSTLGQGLQTSTYPGEVLFSIAIAVAGLLLFALLIG匪QTYLQSLTVRLEEMRIKRRDSEQWM HHRSLPQNLRERVRRYDQYKffLETRGVDEENIVQ SLPKDLRRDIKRHLCLNLVRRVPLFANMDERLLDAICERLKP SLYTESTYIVRE⑶PVNEMLFIIRGRLESVTTDGGRSGFFNRGLLKE⑶FCGEELLTWALDPKAGSNLPSSTRTVKA LTEVEAFALEAEELKFVASQFRRLHSRQVQQTFRFYSQQWRTWAACFIQAAWRRHLRRKIAELRRKEEEEEEMDYED DEYYDDNMGGMVTRSDSSVGSSSTLRSTVFASRFAANALKGHKLRVTESSKSLMNLTKPSEPDFEALDTDDLN
8、CMA基因全长的获得设计5，端引物 Primerl :5_ATGTCAGAAA CATCAAAGTC AGAGTC_3，3，端引物 Primer2 :5-CTATGAGTGGCTATCTTGTCCTGAACCTTG_3，将上述反转录产物稀释 50 倍为摸板，反应体系及条件如下
RT模板 10XPCR缓冲 dNTP
TaKaRa ExTaq Primer 1 Primer 2
Ιμ 5μ1 5μ1 Ιμ 2ul 2ul
H2O
34ul反应参数
94 °C 94 °C 55 °C
72 °C 72 °C
10 min
30sec
40sec
2 min IOmin
50μ1
1个循环
33个循环
1个循环CMA基因的测序结果显示，该基因全长1165bp，具有486bp的开放阅读框，编码162 个氨基酸的蛋白质。CMA基因具有以下开放阅读框核苷酸序列ATGGCGGATCAGCTCACAGACGATCAGATCTCAGAATTCAAGGAAGCCTTCAGCTTATTCGACAAGGATGGTGATGGTATGCTTCATCCTCCCTTTCCCTCTATCATCGTAGGTTGCATTACCACAAAGGAGCTTGGTACCGTGATGCGTTCCCTCGGTCAAAACCCAACCGAAGCTGAGCTTCAGGACATGATCAACGAAGTTGATGCGGATGGTAACGGAACCATTGATTTCCCGGAGTTCTTGAACCTAATGGCTAGGAAAATGAAGGACACTGACTCTGAGGAAGAACTCAAGGAAGCTTTCAGAGTTTTCGACAAAGACCAGAACGGTTTCATCTCAGCTGCTGAATTGAGACATGTGATGACTAACCTCGGCGAGAAGCTTACTGATGAAGAAGTTGATGAGATGATTAAGGAAGCTGATGTTGATGGTGATGGTCAGATCAACTACGAAGAGTTTGTGAAGGTTATGATGGCTAAGTGA其编码的蛋白质的氨基酸序列为MADQLTDDQISEFKEAFSLFDKD⑶GMLHPPFPSIIVGCITTKELGTVMRSLGQNPTEAELQDMINEVD ADGNGTIDFPEFLNLMARKMKDTD SEEELKEAFRVFDKDQNGFISAAELRHVMTNLGEKLTDEEVDEMIKEADVDG DGQINYEEFVKVMMAK
实施例2、CAC-2、CMA调节CAC-I钙离子转运活性验证1、pGEMHE载体构建及Capping RNA的制备pGEMHE质粒上有T7启动子，将CAC-I、CAC_2、CMA基因构建到该质粒中，可以利用体外转录试剂盒 mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit，得到 CAC-I、CAC-2、CMA基因全长的mRNA。具体方法是将CAC-1和CAC-2基因分别插入pGEMHE 质粒中，获得pGEMHE- CAC-I、CAC-2、CMA。并且作为PCR为模板，用引物M13/M13R扩增目的片断，使得纯化后的DNA约1 2 μ g进行体外转录，按照体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit 所提供的试剂和步骤进行。一次转录可获得20 μ 1约15 20 μ gmRNA,取1 μ 1用biophotometer测量其浓度，然后用经DEPC 处理并经高温高压的双蒸水稀释至需要的浓度(0. 5 μ g/ μ 1)，分装到1. 5mL离心管中，每管2-3yL，-80°C保存备用。2、非洲爪蟾的培养与蛙卵的制备非洲爪蟾的来源为美国Nasco公司1)冰块麻醉非洲蟾蜍后，外科手术取出适量的卵块；2)在室温条件下用I型胶原蛋白酶消化取出的卵块1. 5h，酶解过程中置于低速摇床上，以促进卵块的解离；3)用无钙ND96培养液冲洗后，移入盛有ND96的培养皿中。置于18°C培养过夜。3、电压钳浴液的配方1)蛙卵培养溶液配方ND96
NaCl96mmolMgCl1.8mmolKCl2mmolCaCl2mmolHEPES5mmolNaOH 调节 PH 至Ij 7. 42)、Bath Solution 配方CaCl 30mmolMgCl 30mmolMES IOmmol4、双电极电压嵌电压钳纪录与分析首先向取出的蛙卵中注射CAC-I和CAC-2基因的mRNA，每个卵母细胞注射46nl cRNA，对照组注射等体积的去离子水。注射后，卵母细胞被放回18°C孵箱培养48 72h，然后记录电信号。注射有CAC-I基因mRNA的卵母细胞在30mM氯化钙溶液中可以记录到一个内向的电流，并且在-HOmV的电压刺激下会激发出IOOOrnA的电流。这个电流就是由CAC-I 基因的钙离子内向转运特性引起的，具有电压和时间的依赖性。而对照细胞只有卵母细胞本底电流大约300mA。注射有CAC-2基因mRNA的卵母细胞在30mM氯化钙溶液中记录到的电流大小与对照细胞一致。所以CAC-2基因不具有钙离子转运特性。在30mM氯化钙溶液中记录CAC-1，CAC-2基因mRNA同时表达的卵母细胞，我们发现原先由CAC-I产生的钙离子电流消失，表现出和对照细胞同样的整流特性，可以看出CAC-2能抑制CAC-I的钙离子电流。CAC-I和CAC-2具有CMA结合位点，那么是否他们三者之间有什么关系呢？我们将这三者同时表达在卵母细胞中，通过电压钳记录我们发现由于CMA的表达CAC-I的钙离子转运特性被恢复，也就是说CMA解除了 CAC-2对于CAC-I的抑制。实施例3、CAC-I、CAC-2、CMA相互作用的验证酵母双杂交实验1、诱饵基因转化筛库宿主菌AH1091)3个Imm克隆接种于;3mlYPD液体培养基30°C振荡培养20小时(过夜)，0D600 达到1. 2左右；2)将此3ml菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPD中培养4小时左右，使培养液0D600达到0. 6 ；3)50ml 离心管收集菌液(Falcon, BD), Eppendorf Centrifuge 5810R, 700g(1865rpm)，5分钟离心收集菌体，弃上清；4) 20ml ddH20 重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R，700g，5 分钟离心收集菌
体，弃上清；5) 20ml ΙΧΤΕ/LiAc 重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R，700g5 分钟离心收集
菌体，弃上清；6)根据每个转化需要50 μ 1菌液的量加入ΙΧΤΕ/LiAc重悬菌体，分装到 Eppendorf管中，每管50 μ 1菌液；7)每管加约 IOOng Bait 基因质粒，5 μ 1 预变性的 Carrier DNA, 500 μ 1 IXTE/ LiAc/PEG ；8)放置于30°C培养箱或者水浴中孵育30分钟，15分钟时混勻一次；9) 30分钟后，每管加入15 μ 1 DMSO (DIMETHYL SULFOXIDE)，轻轻上下颠倒混勻；10) 42°C水浴热激20分钟，每10分钟上下颠倒混勻一次；11)冰浴5分钟;12) 700g, 5分钟离心收集菌体，弃上清；13) ddH20 洗涤一次菌体；14)利用残余液体重悬菌体，涂布于SD/_Trp平板上；15. 30°C培养箱培养。第2天即可观察到克隆长出，第3天克隆即长到所需大小；Carrier DNA =Herring Testes Carrier DNA, Denatured。Clontech。10mg/mlo未使用过的Carrier DNA先100。C变性10分钟，立即置于冰浴2分钟，然后再100°C变性10分钟，之后置于冰浴上备用。已经使用过的Carrier DNA只需要100°C 变性一次即可。ΙΧΤΕ/LiAc :V10XTE VlOXLiAc VH20 = 1 1 81XTE/LiAc/PEG VlOXTE VlOXLiAc V50% PEG = 1 1 850% PEG :50%为质量体积比。PEG3350 溶于 ddH20 中一般需要加热溶解 10XTE :0. IM Tris-HCl, IOmM EDTA，pH7. 5IOXLiAc :1M LiAc， ρΗ7· 52、含Bait基因质粒的AH109保种Bait基因长出克隆后，一般用诱饵基因特异性引物直接在酵母菌落中PCR鉴定是否转入正确的Bait基因的质粒，然后把经鉴定正确的克隆进行保种。3、酵母菌落PCR1)用含Bait基因的质粒作为阳性对照，用宿主菌AH109作为阴性对照。2)按照下列反应体系进行 PCR =ExTaq Premix (Takara) 10 μ 1 (2X)5' Primer 0· 5 μ 1 (10 μ Μ) 3，Primer 0· 5 μ 1 (10 μ Μ) ddH208. 9 μ 1 菌 0· 1 μ 13)按照下列反应条件进行PCR:95°C5 分钟94°C30 秒58°C30 秒72°C2 分钟30个循环72°C 10分钟72°C延伸2分钟是针对小于Ib的Bait基因，对于长于Ib的Bait 基因要相应延长时间。4) PCR产物进行电泳检测。4、阳性克隆保种1)将阳性克隆接种到3ml相应液体培养基中，30°C振荡培养2_3天；2) 700g, 5分钟，离心收集菌体；3)加入1 1的液体培养基和Sterile Glycerol Solution混合溶液；4)充分悬浮菌体，放于 _80°C 保存。Sterile Glycerol Solution 65 % (V/V) glycerol,0. IM MgS04，0. 5mM Tris-HCl, pH7.45、Bait基因的自激活检测一般采用膜检的方法，检测LacZ基因的表达情况。膜检方法如下1)将阳性克隆菌落影印于滤纸上；2)将滤纸完全浸于液氮中，时间长于30秒，取出后晾干。3)培养皿加入适量显色液(新鲜配制)，垫一层滤纸，让其完全湿润，将冻溶后的滤纸铺在上面，使显色液渗透到表层。9CMa培养皿加2ml显色液，15CMa培养皿加5ml显色液；4)盖上皿盖，放置在37 °C培养箱中，避光放置；5)20分钟后开始观察有无变蓝的阳性结果并记录，一般以3小时为准，特殊情况下可以看过夜是否变蓝；6)反应过后打开皿盖，将滤纸烘干，保存并记录；显色液100ml Z buffer, 0.27ml β -mercaptoethanol,1. 67ml X-gal Z buffer :16.lg/L Na2HPO4 · 7H20,5.50g/ LNaH2PO4 · H20,0. 75g/LKCl，0. 246g/L MgS04 · 7H20, pH7. 0。室温可以存放一年。 X-gal :X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactopyranoside)溶于 DMF(N, N-dimethylformamide)中，终浓度为 20mg/ml。6、诱饵基因筛库1) 5-10个2mm克隆接种于Iml SD/_Trp液体培养基中，混勻后转入150mlSD/_Trp 振荡培养20小时(过夜)，至0D600 = 1. 2左右；2) 150ml 培养液转入 1000ml YPDA (YPD+Adenine)中混勻，此时 0D600 = 0. 2-0. 3 ；
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3)培养约 4-5 小时至 0D600 > 0. 6 ；4) 500ml 离心管收集菌液。Beckman Coulter Centrifuge Avanti J_25(以下步骤均使用此离心机)，700g, 5分钟，RT (室温)。同时将2000 μ 1 Carrier DNA预变性两次；5) 500ml ddH20 洗涤一次，700g, 5 分钟，RT,收集菌体；6) 30ml IX TE/LiAC 洗涤菌体(预先配制 50ml IX TE/LiAC)，转入 IOOml 离心管;7)700g，5 分钟，RT。(预先配制 50ml lXTE/LiAC/PEG)；8)加入 12ml IX TE/LiAc 重悬菌体；9)加入 100-500 μ g 文库 DNA，2000 μ 1 预变性的 Carrier DNA,轻轻混勻；10)加入 50ml lXTE/LiAc/PEG，剧烈涡旋混勻；11) 30°C孵育45分钟，每15分钟混勻一次；12)加入 3. 2ml DMS0，轻轻混勻；13) 42°C热激20分钟，每10分钟混勻一次；14)冰浴5分钟；15) 700g, 5分钟，收集菌体；16)加入 1000ml YPDA，30°C振荡培养 60 分钟；17) 700g，5分钟，收集菌体；18)加入aiil 0.9% NaCl悬浮菌体，终体积约5ml左右。取20 μ 1菌液做滴度测定，其余菌液 200 μ 1/ ±夬，涂布于 15CMa SD/-Trp/-Leu/-His/+30mM3-AT (3-amino-l, 2, 4-triazole)平板上。第三天起要注意观察平板酵母克隆生长状态；19)滴度(转库效率)测定20μ1+180μ1 NaCl (0. 9 % )1 10; 20 μ 1+180 μ INaCl (0.9% )1 100 ；20 μ 1+180 μ 1 NaCl (0. 9% ) 1 1000 ；20 μ 1+180 μ 1 NaCl(0. 9 % ) 1 10000 20 μ 1+180 μ 1 NaCl(0. 9 % ) 1 1000001 1000 ； 1 10000 ； 1 100000三种浓度各取100 μ 1涂布SD/-Trp/-Leu平板20)转库效率的计算对生长在SD/-Trp/-LeU平板上的克隆计数，挑选克隆数在 30-300之间稀释度计算转库效率21)筛库完成，菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT平板上生长7-14天后，会克隆数(Cfu)X总悬浮体积涂板体积X稀释度X文库用量(μ g)= cfu/ μ g DNA有阳性克隆生长出来，阳性克隆一般大于3mm。挑取少量菌做膜检。从膜检变蓝的酵母菌中抽提prey质粒与Bait质粒做共转验证。7、抽提酵母质粒1)膜检变蓝的阳性克隆用牙签涂布在SD/-Trp-Leu-HiS+30mM3-AT平板上，约 2CMa2，然后放置于30°C培养箱中培养3_4天；2)取一 Eppendorf 管，加入 30 μ 1 的 5u/μ 1 Lyticase。把菌用牙签刮到 lyticase 中，Vortex充分悬浮。37°C孵育30分钟；3)加入170 μ 1 Lysis Buffer使终体积为200 μ 1。再加入200 μ 1玻璃珠 (425-600microns)，200 μ 1 酚 / 氯仿 / 异戊醇(25 24 1), vortex 剧烈振荡 5 分钟；4) 12，OOOrpm离心10分钟，将上清转入一干净Eppfendorf管中。注意，不要把蛋白转移过去；5)加入8 μ 1 IOM NH4Ac和500 μ 1无水乙醇，混勻，_80°C放置1小时；6) 12，OOOrpm离心10分钟，去上清；7)加入500 μ 1 70%乙醇洗涤沉淀，12，OOOrpm离心5分钟；8)弃上清，真空抽干沉淀；9)将沉淀重悬于10 μ 1 ddH20中，一般取2_3 μ 1转化大肠杆菌；Lyticase 将 Lyticase 干粉溶解在 IXTE 中，终浓度为 5u/μ 1 ；Lysis Buffer :50mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)， 0. 1% Triton X-100,0. 5% SDS8、酵母质粒的扩增一般用电转的方法，把从筛库所得的阳性克隆中抽提的质粒在大肠杆菌中扩增。大肠杆菌电转感受态制备1)挑一单克隆接入3ml LB培养基，摇培14-16小时至0D600 = 1. 0-1. 2 ；2)将摇培后的菌液转接IL LB培养基，摇培4_5小时至0D600 = 0. 7-0. 8 ；3)离心收菌，IOml冰水溶解；4) 5000g, 4°C离心10分钟收菌，400ml冰水将菌重悬，冰浴10分钟；5)5000g，4°C离心10分钟收菌，40ml预冷10%甘油重悬，冰浴10分钟；6)5000g，4°C离心10分钟收菌，加Iml 10%甘油重悬;7)用枪测量重悬后的菌液体积，加入与菌液等体积的10%甘油(注等体积10% 甘油指重悬后的菌液体积减去1ml。例加入lmll0%甘油后重悬菌液体积为細1，则加入 10%甘油量为3ml)；8)分装到Eppendorf管中，每管100 μ 1，冰上操作；9. _80°C冰箱保存；10.取出两管做阴性、阳性对照；10%甘油V甘油V水=1 9。9、电击转化1)从_80°C冰箱取出感受态，至冰上溶解。同时，将电转杯至冰上冷却，打开电转仪准备30分钟；2)感受态溶解后，将要转化的质粒(或连接产物或其他要转化的物质)加入感受态，用枪吹打均勻。电转时有必要进行阴性对照、阳性对照，以检验感受态是否被污染及感受态是否正常；3)将混合后的感受态加入预冷的电转杯；4)擦干电转杯上电极两边的壁；5)将电转杯放入电转仪，电击；6)电击后，用Iml SOC将感受态洗出，37 °C孵育45分钟；
7) 6，OOOrpm, 3 分钟离心收菌；8)涂板，不同电转杯的最适电压各不相同，经实验1mm电转杯的最适电压为 1900-2200V 4mm电转杯的最适电压为2300-2500V 8mm电转杯的最适电压为2500-2700V SOC :20g/L 蛋白胨，5g/L酵母提取物，0. 5g/L NaCl, 2. 5mM KCl，pH7. 0。121°C，20 分钟灭菌。 冷却至60°C以下时，每升加入20ml灭菌的IM葡萄糖溶液。该溶液使用前每升加入5ml灭菌的 2M MgCl2。双分子荧光互补实验分子焚光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)分析技术，是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术.该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达， 如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用.其后发展出的多色荧光互补技术(multicolorBiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.目前，该技术已用于转录因子，G蛋白β Y亚基的二聚体形式，不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上.利用黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接，如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响。将CAC-I和CAC-2的碳末端分别构建在pGADT7和pGBKT7中用于做酵母双杂交。在亮氨酸，色氨酸，组氨酸缺失的培养基上表达了 CAC-I和CAC-2的酵母可以生长，说明CAC-I 和CAC-2能够相互作用。同时CAC-I和CAC-2都可以和CMA相互作用，但是CAC-2与CMA 的互做更加强烈。同样在双分子荧光互补实验中可以看出，在转有CAC-I-YFPn和CAC_2_YFPe的原生质体中有绿色的荧光且定位在细胞膜上。在CAC-2-YFPn和CMA-YFPe表达的原生质体也有绿色荧光且定位在细胞膜上。但在CAC-I-YFPn和CMA-YFPe表达的原生质体没有明显的绿色荧光。通过这两个实验我们可以得出在这样的结论CAC-1和CAC-2可以向互作用，CMA 与CAC-2的相互作用要强于CAC-I。实施例4、CAC-1、CAC-2、CMA调控花粉管伸缩、影响雄性不育的验证花粉的萌发和培养1)配置花粉萌发培养基 ImM CaCl2, ImM Ca (NO3)2, ImM MgSO4, 0. 01% (w/v) H3BO3, and 18% (w/v) sucrose 0. 8% (w/v) agar, pH 7.0。2)收集20朵烟草花放入IOmL离心管中，震荡1分钟，500g离心2分钟。3)将收集的花粉撒在培养基上培养30分钟。基因枪轰击1)将已构建的含有GFP的CAC-I，CAC-2以及CM质粒用金粉包被(30ug的质粒使用用:3mg的金粉)2)使用Bio-Rad公司的PDS-1000/He biolistic系统将包被有金粉的质粒轰击进入培养好的花粉管中，每个样本轰击2次。设置参数为28英尺的Hg真空室，1100-psi安全膜，0. 25英尺殉爆距离。3)培养30分钟后用激光共聚焦显微镜观察。与对照相比，CAC-I过表达的花粉管明显变的有粗又短，可能是由于钙离子的积累所致。但同时表达CAC-I和CAC-2的花粉管恢复了与对照一样的表型。如果同时过表达 CAC-I, CAC-2和CMA花粉管变的又短有粗，与过表达CAC-I的花粉管表型一致。
权利要求
1.一种Ca2VMg2+通道分子CAC-1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.根据权利要求1所述的Ca2VMg2+通道分子CAC-I，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
3.权利要求1所述Ca2+/Mg2+通道分子CAC-I的抑制剂CAC-2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
4.根据权利要求3所述的Ca2+/Mg2+通道分子CAC-I的抑制剂CAC-2，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
5.一种钙结合蛋白CMA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示。
6.根据权利要求5所述的钙结合蛋白CMA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo. 6 所示。
7.钙信号开关分子，其特征在于，包括权利要求1所述的Ca2VMg2+通道分子CAC-I、权利要求3所述的Ca2+/Mg2+通道分子CAC-I的抑制剂CAC-2、以及权利要求5所述的钙结合蛋白CMA，其中，CAC-2抑制Ca2+/Mg2+通道分子CAC-I的钙通道活性，CMA与CAC-2和CAC-I 同时相互作用，解除了 CAC-2对CAC-I钙离子转运活性的抑制。
8.权利要求7所述的钙信号开关分子调节植物体内钙流波动的应用。
9.权利要求7所述的钙信号开关分子用于调控植物雄性不育的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地涉及控制花粉雄性不育钙波动的分子开关及其应用。根据本发明的钙信号开关分子，包含上述Ca2+/Mg2+通道分子CAC-1、Ca2+/Mg2+通道分子CAC-1的抑制剂CAC-2、以及钙结合蛋白CMA，其中，CAC-2抑制Ca2+/Mg2+通道分子CAC-1的钙通道活性，CMA与CAC-2和CAC-1同时相互作用，解除了CAC-2对CAC-1钙离子转运活性的抑制。
文档编号C12N15/29GK102260341SQ201110172530
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月24日 优先权日2011年6月24日
发明者李乐攻, 潘亚军 申请人:首都师范大学