专利名称：一种高效去除腐殖质的环境样品总dna提取方法
技术领域：
本发明涉及一种高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法，属于生物技术领域。
背景技术：
土壤基因组DNA提取是环境宏基因组学研究的基础。可以通过两种途径实现土壤 DNA的提取，一是在裂解细胞前将土壤中的微生物细胞与土壤颗粒等分开，然后再裂解细胞，获得总DNA ；二是直接裂解细胞，从土壤中提取总DNA，这种途径获得的总DNA产量大，但纯度低，主要是腐殖酸等杂质的影响。目前，土壤DNA提取方法多，如液氮研磨法、微波破碎法、玻璃珠裂解法、酶裂解法、快速冻融法、离子交换法、溶剂-玻璃珠混勻法、SDS-玻璃珠法、SDS-GITC-PEG法、MS法、 Nycodenz 法、Blending 法、UltraClean Soil DNA kit (MoBio Laboratories, Inc. , Solana Beach, Calif. )、Fast DNA spin sample kit (for soil ；Bio 101, Lajolla, Calif.)等，所有这些方法要解决的关键问题是去除腐殖酸以及如何从裂解的细胞中提取总DNA。上述方法直接提取土壤总DNA的纯度低，需要后续的纯化步骤，费时费力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法。高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法，包括以下步骤(1)取0.3g过筛的土样于装有三颗2. 5mm-3. Omm灭菌玻璃珠的2mL的离心管中，加入ImL脱腐缓冲液 (IOOmmol/L Tris,100mmol/L Na4P2O7,IOOmmo1/L Na2EDTA,1. O % PVP,lOOmmol/LNaCl, 0. 05% Triton X_100，pH 10. 0), Vortex-Genie 2 (Mobio Laboratories Inc)涡旋 lmin， 12000r/min 离心 2min，弃上清；(2)力口入 ImL 0. 5mol/L 的氣化 丐溶液，Vortex—Genie 2 (Mobio Laboratories Inc)涡旋 2min, 12000r/min 离心 lmin，弃上清；(3)力口入 800yL DNA 提取缓冲液(lOOmmol/L Tris-HCl, 1. 5mol/L NaCl, 1 % CTAB, ρΗ 8. 0)，Vortex-Genie 2 (Mobio Laboratories Inc) y^M 5s ；(4)加入200yL SDS溶液(20% )，颠倒混勻，65°C温育lOmin，5min颠倒混勻一
次。；(5)取上清900yL于2mL离心管中，加入等体积的酚氯仿异戊醇 (25 24 1)，12000r/min 离心 5min ；(6)取上清SOOyL于2mL离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)， 12000r/min 离心 5min ；(7)取上清600yL于1.5mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，冰浴20min， 12000r/min 离心 5min ；
(8)弃上清，用70%的酒精洗沉淀，自然干燥或冷冻干燥；(9) 50 μ L TE 溶解沉淀。去除腐殖酸是土壤总DNA提取的重要环节，步骤1-3协同作用，能高效去除腐殖酸，提高土壤总DNA提取纯度。高效去除土壤中腐殖酸，提高总DNA提取纯度，为土壤宏基因组学研究提供基础技术。
图1为本发明方法提取4种不同土壤微生物基因组DNA电泳图(3个重复)；图2为本发明方法提取4种不同土壤微生物AOB基因组amoA基因片段扩增电泳图；图3为本发明方法提取4种不同土壤微生物AOA基因组amoA基因片段扩增电泳图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实验土壤供试土样采集于内蒙古高原锡林河流域中游，包括典型草原围封区土壤-1、退化草原区土壤-2、锡林河高河漫滩区湿地土壤-3和低河漫滩区湿地土壤_4试验土样，分别记为W1、W2、W3、W4。采集深度0-10cm，四种土壤样品的部分理化性质见表1。
权利要求
1. 一种高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤(1) 取0. 3g过筛的土样于装有三颗2. 5mm-3. Omm灭菌玻璃珠的2mL的离心管中，加入ImL脱腐缓冲液(IOOmmol/L Tris, 100mmol/L Na4P2O7, IOOmmo 1/L Na2EDTA, 1. 0% PVP, 1 OOmmo 1/L NaCl, 0. 05% Triton X-100, ρΗ 10. 0), Vortex-Genie 2 (MobioLaboratories Inc)祸旋 lmin, 12000r/min 离心 2min，弃上清；(2)力口入ImL 0. 5mol/L 的氣化 丐溶液，Vortex-Genie 2 (Mobio Laboratories Inc) 涡旋2min, 12000r/min离心lmin，弃上清；(3)加入800yL DNA 提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl, 1. 5mol/L NaCl, 1% CTAB,pH 8. 0), Vortex-Genie 2 (Mobio Laboratories Inc)祸旋 5s ；(4)加入200μ L SDS溶液(20% )，颠倒混勻，65°C温育lOmin，5min颠倒混勻一次。；(5)取上清900μL于2mL离心管中，加入等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1)， 12000r/min 离心 5min ；(6)取上清800μ L于2mL离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇(24 1), 12000r/min 离心5min ；(7)取上清600μ L于1. 5mL离心管中，加入0. 6倍体积的异丙醇，冰浴20min, 12000" min 离心 5min ；(8)弃上清，用70%的酒精洗沉淀，自然干燥或冷冻干燥；(9)50 μ L TE溶解沉淀。
全文摘要
本发明公开了高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法，包括以下步骤(1)取0.3g过筛的土样于装有三颗2.5mm-3.0mm灭菌玻璃珠的2mL的离心管中，加入1mL脱腐缓冲液，Vortex-Genie2(Mobio Laboratories Inc)涡旋1min，12000r/min离心2min，弃上清；(2)加入1mL 0.5mol/L的氯化钙溶液，Vortex-Genie2(MobioLaboratories Inc)涡旋2min，12000r/min离心1min，弃上清；(3)加入800μL DNA提取缓冲液，Vortex-Genie2(Mobio Laboratories Inc)涡旋5s。快速高效提取土壤总DNA，为土壤宏基因组学研究提供高纯度基因组DNA。
文档编号C12N15/10GK102286463SQ20111017877
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者于景丽, 李靖宇, 武琳慧, 赵吉 申请人:内蒙古大学