专利名称：一种可抑制hiv-1反转录酶的蝉花蛋白酶及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种可抑制HIV-I反转录酶的蝉花蛋白酶及制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
蛋白酶是催化蛋白质水解反应的酶，能作用于蛋白质分子中的肽键，形成长度较短的肽链或是氨基酸。蛋白酶广泛存在于生物体内，对蛋白质的新陈代谢起调节作用，从细胞、器官、机体等各个水平上发挥各种各样的功能。蛋白酶种类繁多，应用领域也十分广泛， 主要涉及到去污剂、皮革、纺织、食品、医药、环保与资源等多方面。近年来，随着生物学研究技术的发展，开发蛋白酶资源，寻找新的高品质的蛋白酶一直是各国研究人员关注的焦点。蝉花(Cordyc印s sobolifera)又名蝉蛹草、蛹茸、虫花，是麦角菌科真菌大蝉草 (蝉拟青霉)及其寄主山蝉若虫的干燥体。医学上认为，蝉花是一种与冬虫夏草相近的珍贵药材。蝉花中分离的蝉拟青霉具有极为广谱并具较强的致病性，可以寄生鳞翅目、膜翅目中的很多昆虫，在害虫防治上显示很大的优越性，其作用机制可认为是菌丝体分泌蛋白酶侵染虫体，利用其中的蛋白养分完成生活史。艾滋病是严重威胁人类健康的病毒性传染病。艾滋病病毒HIV属于反转录病毒科的慢病毒亚科。反转录是HIV病毒最重要的特征之一，其过程就是在病毒体内反转录酶的作用下以病毒RNA为模板合成病毒DNA的过程。在反转录过程中，反转录酶起着重要作用， 这也是研究抗艾滋病药物的最佳靶点之一，目前正在研制的大部分药物都是以HIV的反转录为靶点的。Mitsuya等首先发现脱氧胸苷类AZT具有显著的抑制艾滋病病毒的作用，随后研究又陆续发现脱氧核苷、无环核苷、核苷类似物能有效的抑制HIV的复制，但这些抑制剂的耐药问题日益突出，并且具有严重的毒副作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抑制HIV-I反转录酶活性的蝉花蛋白酶及其制备方法。本发明提供的蝉花蛋白酶，其制备方法包括以下步骤1)破碎蝉花细胞；2)收集蛋白粗提物；幻从步骤幻中收集的蛋白粗提物中分离纯化蛋白酶，得到的蛋白酶即为蝉花提取物，所述蛋白酶的分子量为31KD且N末端序列见序列表序列1。所述蛋白酶为丝氨酸族蛋白酶，所述蛋白酶在如下条件下酶的活力最高pH值为 12-12. 5、温度为 55-650C ο所述破碎蝉花细胞可为破碎蝉花子实体的细胞。所述步骤2)中，采用离心的方式收集蛋白粗提物，所使用的离心力为 6010-15151g，具体为 12000g。从步骤2~)收集的蛋白粗提物中分离纯化蛋白酶包括如下a) c)三步a)将从步骤幻收集的蛋白粗提物进行阴离子交换柱层析，收集具有蛋白酶活性
4的洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，用pH8. 9-9. 9的碳酸氢铵缓冲溶液进行洗脱；所述碳酸氢铵缓冲溶液的溶质为9. 5-10. 5mM NH4HCO3,溶剂为水，用氨水调pH;b)将从步骤a)获得的洗脱峰进行阳离子交换柱层析，收集具有蛋白酶活性的洗脱峰；所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是SP，所采用的洗脱程序为进行 NaCl线性洗脱，所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为4. 5-5. 5，溶质为 NaCl，溶剂为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液；所述线性洗脱的时间是150分钟，所述线性洗脱中NaCl的浓度在150分钟内由OM线性升至0. 8M ；所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的溶质为4. 0-5. OmM柠檬酸和5. 0-6. OmM柠檬酸钠，溶剂为水；c)将从步骤b)获得的洗脱峰进行凝胶过滤层析，得到具有蛋白酶活性的洗脱峰； 所述凝胶过滤层析所用层析介质的分离范围包括31KD，所用的层析柱的柱长度和柱内径比为 25 1-50 1。所述步骤a)阴离子交换柱层析的载体为Cellulose，所述步骤b)阳离子交换柱层析的载体为kpharose，所述步骤c)凝胶过滤层析的介质为Superdex 75。所述步骤a)中洗脱用pH9. 4的所述碳酸氢铵缓冲溶液洗脱；所述碳酸氢铵缓冲溶液的溶质为IOmM碳酸氢铵，溶剂为水，用氨水调pH ；所述步骤b)中所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为5. 0，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的溶质为4. ImM柠檬酸和5. 9mM柠檬酸钠，溶剂为水；所述步骤C)中所述得到具有蛋白酶活性的洗脱峰是用如下溶液洗脱得到的pH 值为8. 5的0. 2M的NH4HCO3水溶液。所述步骤C)所用的层析柱的柱长度和柱内径比为30 1。本发明提供的蝉花提取物，其分子量为31KD且N末端序列见序列表序列1 ；所述蛋白酶为丝氨酸族蛋白酶，所述蛋白酶在如下条件下酶的活力最高PH值为12-12. 5、温度为 55-65 0C ο所述的蝉花提取物在制备下述任一产品中的应用也是本发明的保护范围A)抑制HIV-I反转录酶活性的产品；B)改善艾滋病患者健康状况的产品。依据本发明的制备方法所获得的蝉花蛋白酶对HIV反转录酶活性有非常明显的抑制作用，是以一种新型的抗病毒抑制剂，在抗艾滋病新药研究领域中具有重要价值。
图1为DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱层析洗脱图谱。图2为SP-S印harose强阳离子交换柱层析洗脱图谱。图3为FPLC-Superdex 75凝胶过滤层析洗脱图谱。图4为蝉花蛋白酶SDS-PAGE电泳鉴定图谱。标准分子量M(购自GE Healthcare 公司)从上到下依次为磷酸化酶b(94KD)，牛血清白蛋白(67KD)，卵清蛋白(43KD)，碳酸酐酶(30KD)，大豆胰岛素抑制剂(20KD)，乳白蛋白(14.4KD) ；P为蝉花蛋白酶。图5为蝉花蛋白酶在不同反应温度下的相对酶活力。图6为蝉花蛋白酶经不同温度处理40min后的相对酶活力。图7为蝉花蛋白酶在不同pH条件下的相对酶活力。
图8为不同剂量蝉花蛋白酶对HIV-I反转录酶的抑制率。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、蝉花(Cordyc印s sobolifera)蛋白酶的分离纯化与鉴定1、提取与粗级分离用0. 15M 的 NaCl 溶液悬浮蝉花(Cordyceps sobolifera) (Liu, Ζ. -Y.，Liang, Ζ. Q. , Whalley, A. J. S. , Liu, A. -Y. & Yao*, Y. -J. A new species of Beauveria, the anamorph of Cordyceps sobolifera. Fungal Diversity, 2001,7 :61-70.公众可从北京市农林科学院获得)子实体，利用组织捣碎机进行组织破碎至子实体为糊状，4°C条件下放置12小时后，SOOOrpm(12000g)离心15min，收集上清溶液，得到粗提液；向粗提液中加入 (NH4)2SO4至80%饱和度，于4°C条件下静置4小时，8000rpm(12000g)离心15min,收集沉淀，得到蛋白粗提物，蒸馏水溶解蛋白粗提物沉淀并在蒸馏水中透析12-16小时。2、离子交换柱层析分离纯化层析柱利用相应的缓冲溶液以^il/min的流速平衡8_10个柱体积后，利用pH计测定层析柱流出液的PH值以确定层析柱是否平衡好，透析后的蛋白粗样品以1.5ml/min的流速勻速上样，待样品上完后，将流速调制2. 5ml/min(SP-kphar0Se层析为lml/min)进行洗脱，各洗脱峰利用蛋白酶活性检测方法确定是否为活性峰。DEAE-Cellulose层析柱洗脱时选用添加0、0. IM和IM NaCl进行分步洗脱； SP-Sepharose层析柱洗脱时选用添加0_0. 8M NaCl进行线性洗脱。(I)DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱层析透析后的蛋白粗提物经过pH9. 4的碳酸氢铵缓冲溶液(溶质为IOmM NH4HCO3，用氨水调PH，溶剂为水)平衡后，经DEAE-Cellulose (Sigma公司，D0909)弱阴离子交换柱层析。 该离子交换柱的柱体积为100ml。进行三步洗脱，流速2. 5ml/min。第一步洗脱用pH9. 4的碳酸氢铵缓冲溶液(溶质为IOmM NH4HCO3，用氨水调pH，溶剂为水)洗脱2个柱体积；第二步洗脱用PH9. 4的如下溶液洗脱1. 5个柱体积溶质是0. IM NaCl，溶剂是碳酸氢铵缓冲溶液(溶质为IOmM NH4HCO3，用氨水调pH，溶剂为水)；第三步洗脱用pH9. 4的如下溶液洗脱 1. 3个柱体积溶质是1. OM NaCl，溶剂是碳酸氢铵缓冲溶液(溶质为IOmM NH4HCO3,用氨水调PH，溶剂为水)。收集得到的洗脱峰进行蛋白酶活性检测，结果表明第一步洗脱得到的第一洗脱峰 Dl (图1中洗脱体积为第40-120ml，即第0. 4-1. 2个柱体积)为目标提取物的活性峰(其蛋白酶活性为1949. 83U/mg)，将Dl活性峰在蒸馏水中透析10-12小时。(2) SP-Sepharose强阳离子交换柱层析进行SP-S印harose (GE Healthcare公司，17_07四-10)强阳离子交换柱层析。先用PH 5. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(溶质为4. ImM柠檬酸和5. 9mM柠檬酸钠，溶剂为水)平衡离子交换柱(该离子交换柱的柱体积为10ml)，将Dl组分上样，再用100ml pH 5.0 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(溶质为4. ImM柠檬酸和5. 9mM柠檬酸钠，溶剂为水)平衡， 流速lml/min。然后，再进行150分钟的NaCl线性洗脱，流速lml/min。该NaCl线性洗脱溶液PH值为5. 0，溶质为NaCl，溶剂为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(溶质为4. ImM柠檬酸和5. 9mM柠檬酸钠，溶剂为水)，NaCl的浓度在150分钟内由OM线性升至0. 8M。收集得到的洗脱峰进行蛋白酶活性检测，结果表明得到的第三洗脱峰SP3 (图2中洗脱体积为第160-180ml，即第16-18个柱体积)为目标提取物的活性峰(该活性峰的蛋白酶活性为36395. 35U/mg)，将SP3活性峰在蒸馏水中透析10-12小时。3、凝胶过滤层析SP3 组分经 FPLC-Superdex 75 (GE Healthcare 公司，17-5174-01)凝胶过滤层析， 洗脱液为PH8. 5 0. 2M NH4HCO3溶液，层析柱规格30cm(柱长)X lcm(内径)，上样体积为 0. anl，流速为0. Sml/min。收集得到的洗脱峰进行蛋白酶活性检测，结果表明得到的第一洗脱峰SUl (图3中洗脱体积为第11. 2-14. 4ml,即第0. 47-0. 61个柱体积)为目标提取物的活性峰(该活性峰的蛋白酶活性为56780. 98U/mg)。经过阴、阳离子交换柱层析和凝胶过滤层析，以25g干蝉花子实体为材料，得到纯化的蝉花蛋白酶活性为56780. 98U/mg,回收率为7. 37% (表1)。表1蝉花蛋白酶回收率与纯化倍数干蝉花子实体)
权利要求
1.蝉花(Cordyc印ssobolifera)提取物的制备方法，包括以下步骤1)破碎蝉花细胞；2)收集蛋白粗提物；3)从步骤幻收集的蛋白粗提物中分离纯化蛋白酶，得到的蛋白酶即为蝉花提取物，所述蛋白酶的分子量为31KD且N末端序列见序列表中序列1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述蛋白酶为丝氨酸族蛋白酶。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述蛋白酶在如下条件下酶的活力最高PH值为12-12. 5、温度为55-650C ο
4.根据权利要求1-3中任一所述的制备方法，其特征在于所述从步骤幻收集的蛋白粗提物中分离纯化蛋白酶包括如下步骤a)将从步骤幻收集的蛋白粗提物进行阴离子交换柱层析，收集具有蛋白酶活性的洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，用pH8. 9-9. 9的碳酸氢铵缓冲溶液洗脱；所述碳酸氢铵缓冲溶液的溶质为9. 5-10. 5mM碳酸氢铵，溶剂为水；b)将从步骤a)获得的洗脱峰进行阳离子交换柱层析，收集具有蛋白酶活性的洗脱峰； 所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是SP，所采用的洗脱程序为进行NaCl 线性洗脱，所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为4. 5-5. 5，溶质为NaCl， 溶剂为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液；所述线性洗脱的时间是150分钟，所述线性洗脱中 NaCl的浓度在150分钟内由OM线性升至0. 8M ；所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的溶质为 4. 0-5. OmM柠檬酸和5. 0-6. OmM柠檬酸钠，溶剂为水；c)将从步骤b)获得的洗脱峰进行凝胶过滤层析，得到具有蛋白酶活性的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用层析介质的分离范围包括31KD，所用层析柱的柱长度和柱内径比为 25 1-50 1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述步骤a)阴离子交换柱层析的载体为Cellulose，所述步骤b)阳离子交换柱层析的载体为kpharose，所述步骤c)凝胶过滤层析的介质为Superdex 75。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于所述步骤a)中洗脱用pH9. 4的所述碳酸氢铵缓冲溶液洗脱；所述碳酸氢铵缓冲溶液的溶质为IOmM碳酸氢铵，溶剂为水，用氨水调pH;所述步骤b)中所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为5. 0，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的溶质为4. ImM柠檬酸和5. 9mM柠檬酸钠，溶剂为水；所述步骤c)中所述得到具有蛋白酶活性的洗脱峰是用如下溶液洗脱得到的pH值为 8. 5的0. 2M的NH4HCO3水溶液。
7.根据权利要求4-6中任一所述的制备方法，其特征在于所述步骤c)所用的层析柱的柱长度和柱内径比为30 1。
8.由权利要求1-7中任一所述的制备方法得到的提取物。
9.根据权利要求8所述的提取物，其特征在于所述提取物的分子量为31KD且N末端序列见序列表序列1 ；所述提取物为丝氨酸族蛋白酶；所述提取物在如下条件下酶的活力最高:pH值为12-12. 5、温度为55-650C。
10.权利要求8或9所述的提取物在制备下述任一产品中的应用Α)抑制HIV-I反转录酶活性的产品； B)改善艾滋病患者健康状况的产品。
全文摘要
本发明公开了一种可抑制HIV-1反转录酶的蝉花(Cordyceps sobolifera)蛋白酶及制备方法，包括以下步骤1)破碎蝉花细胞；2)收集蛋白粗提物；3)从步骤2)收集的蛋白粗提物中分离纯化蛋白酶，得到的蛋白酶即为蝉花提取物，所述蛋白酶的分子量为31KD，N末端氨基酸序列见序列表序列1，属于丝氨酸族蛋白酶，在如下条件下酶的活力最高pH值为12-12.5、温度为55-65℃。依据本发明的制备方法所获得的蝉花提取物对HIV-1反转录酶有极其明显的抑制作用，在抗艾滋病新药研究领域中具有重要价值。
文档编号C12R1/79GK102268422SQ20111018796
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月6日 优先权日2011年7月6日
发明者刘宇, 孟莉莉, 张国庆, 王兰青, 王守现, 王贺祥, 耿小丽, 许峰, 赵爽 申请人:中国农业大学, 北京农学院, 北京市农林科学院