专利名称：一种牛乳粉中猪源掺加物的一重/双重pcr检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，是一种适用于牛乳粉中猪源掺加物的PCR扩增检测方法。
背景技术：
牛乳粉营养丰富，蛋白含量高质量优，受到消费者的喜爱。随着我国奶产业的快速发展，国内知名企业的竞争已将焦点集中到奶源的争夺上。少数奶农及一些不法商贩、甚至一些“无良企业”为了谋取暴利，常常在牛乳粉中掺假使杂，不惜危害消费者身心健康，甚至生命。以前常用的掺假物有水、食盐、芒硝、蔗糖、豆浆、米汤、防腐剂等。根据各种掺假物的理化性质进行相应的检验，可使掺假乳原形毕露。发展到后来则用动物(猪、牛、羊、鸡等) 或植物(大豆)水解蛋白来代替乳蛋白；利用植物脂肪(大豆油、菜籽油、玉米油等)及一些廉价的动物脂肪代替乳脂肪。由于理化检测方法存在检测对象单一、灵敏度低、易受外源因素干扰等缺点，无法准确、快速、高通量的进行区分鉴别。国标法对蛋白质检测则设备复杂，操作较繁琐，费用较高，耗时较长。
发明内容
本发明是为解决奶粉中猪源成分检测的化学方法存在灵敏度低，易受外源因素干扰等缺点，特别是目前食品中蛋白质、脂肪的测定方法不能将不同的动物来源区分开来的问题，进而提供一种适用于奶粉中的猪源掺加物的PCR检测方法。本发明解决其技术问题所采用的方案是一种牛乳粉中猪源掺加物的一重/双重PCR检测方法，首先对待测产品的DNA模板进行提取，然后采用牛特异性引物和猪特异性引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，同时对牛源DNA进行PCR扩增做为阴性对照组，对猪源DNA进行PCR扩增做为阳性对照组，然后对所有扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳分析；最后根据被测产品孔出现的电泳带与阳性对照组和阴性对照组进行比对，即可判定产品中是否添加了猪源掺加物。牛特异性引物1和猪特异性引物2具有的核苷酸序列为引物 1-1 5' -CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3'；引物 1-2 5' -AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCTAT-3 ‘；引物 2-1 5' -AAGTTAGAGATCGGGAGCCTAA-3‘；引物 2-2 5' -AAGGTGACAATAGGTAGTCC-3‘。PCR反应所用试剂还包括Taq酶、dNTPUOX缓冲液、MgCl2和灭菌水。所述的PCR引物浓度为0. 1-0. 4 μ mol/L，最佳浓度为0. 2 μ mol/L。所述PCR反应循环条件为预变性92 96°C 3 8min ；变性92 96°C 20 40s， 退火52 60°C 20 40s，延伸72°C 30 120s，共；35个循环，最后延伸72°C 3 lOmin。所述PCR反应循环最佳条件为预变性94°C 4min ；变性94°C 30s，退火56°C 30s，延伸72°C 60s， 共；35个循环，最后延伸72°C 7min。
进行琼脂糖凝胶电泳分析采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为1. 5 2. 0%，最佳质量浓度为1.7%。本发明采用分子生物学中的单一和双重PCR技术，可以快速、准确、灵敏地从基因角度对奶粉中猪源成分的掺入情况进行定性和半定量分析，为市场监督部门和检验检疫部门提供技术保障。此方法操作简单，费用低，耗时短，特异性好，灵敏度高，重复性好，能检测到奶粉中掺入的猪源成分低至0. 1%，适于推广应用。
具体实施例方式下面详细阐述本发明优选的实施例。实施例一本实施例所述检测方法依次包括以下步骤a.对待测产品的DNA模板进行提取，S卩，提取产品基因组的DNA。产品的DNA提取方法可以是本申请人于2011年4月1日申请的、申请号为 201110081615. 8、名称为“一种大豆分离蛋白基因组DNA的提取方法”中所阐述的方法，区别只在于用本发明所述的牛乳粉替换上述申请中的大豆分离蛋白。申请人在此将该方法阐述如下首先，将预先加入了已知量猪肉粉(添加量后面阐述)的待测奶粉与TE缓冲液 (浓度不限)充分混合制成TE混合液(混合比例无需限定)，所述TE缓冲液也可以用水代替；然后，加入液体二倍体积的异硫氰酸胍裂解液，充分混勻，室温裂解，裂解时间为 20 60min。所述异硫氰酸胍裂解液中含50 IOOmM pH 6. 0 8. OTris-HCl ；10 IOOmM pH 8. OEDTA ；5M 异硫氰酸胍；体积含量 1. 3% TritonX-IOO0第三步采用酚、氯仿/异戊醇抽提蛋白，所述的酚、氯仿/异戊醇的体积比例为 25 24 1，所述的氯仿/异戊醇的体积比例为M 1。第四步采用异丙醇沉淀DNA，沉淀温度为-20 30°C，沉淀时间为20 60min。第五步乙醇洗涤，使用的乙醇体积浓度为70 95 % ；第六步室温晾干，晾干的时间为10 15min。第七步将第六步所得产品完全溶解于TE缓冲液(浓度不限)或灭菌水中，即得到基因组DNA的TE溶液，4°C或_20°C保存备用。b.对前述过程得到基因组DNA的TE溶液(即模板DNA溶液)进行PCR扩增，同时对牛源DNA和猪源DNA进行PCR扩增。PCR扩增所用试剂包括Taq酶、dNTP (脱氧核糖核苷三磷酸)、10 X缓冲液、MgCl2、 灭菌水、引物和模板DNA。本实施例为双重PCR反应体系，控制的工艺参数为
ddH20Π.8μΙ
4IOxPCR 缓冲液 + (NH4)2S04
MgC12(25mM)
dNTP(lOmM)
牛上、下游引物(ΙΟμΜ)
猪上、下游引物(ΙΟμΜ)
DNATaq聚合酶
模板DNA
l.OpL 0.5μ 0.5μ 0.2μL l.OpL对提取的基因组DNA进行PCR扩增采用牛特异性引物和猪特异性引物，所述的PCR 引物浓度为0. 1-0. 4 μ mol/L，较佳的引物浓度为0. 2 μ mol/L。牛特异性引物1和猪特异性引物2具有的核苷酸序列为引物 1-1 5' -CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3'；引物 1-2 5' -AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCTAT-3 ‘；引物 2-1 5' -AAGTTAGAGATCGGGAGCCTAA-3‘；引物 2-2 5' -AAGGTGACAATAGGTAGTCC-3‘。对牛源DNA进行PCR扩增做为阴性对照组，对猪源DNA进行PCR扩增做为阳性对照组，以判定待测产品猪源掺加物的阳性或阴性。对前述提取的基因组DNA、牛源DNA和猪源DNA进行PCR扩增都采用相同的温度及时间，g卩，循环条件为预变性92°C 3min ；变性92°C 20s，退火52°C 20s，延伸72°C 30s，共35 个循环，最后延伸72°C :3min。c.对所有扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳分析，该电泳分析方法为公知技术。进行琼脂糖凝胶电泳分析采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为1. 5%。最后根据被测产品孔出现的电泳带与阳性对照组和阴性对照组进行比对，即可判定待测产品猪源掺加物的阳性或阴性，从而可知产品中是否添加了猪源掺加物。本实施例添加的猪肉粉质量比例分别占奶粉的0. 1 %，0. 5 %，1 %，2. 5 %，5 %， 10%，然后以该奶粉为待测产品，采用本实施例所述的工艺过程及控制参数，申请人成功地检测出此系列奶粉中含有的猪源成分，最低检出限为0. 1%，其检测精度达到了 100%。实施例二 本实施例与实施例一的区别在于步骤b中，对提取的基因组DNA、牛源DNA和猪源DNA进行PCR扩增采用的反应条件为预变性94°C 4min ；变性94°C 30s，退火30s，延伸72°C 60s，共35个循环，最后延伸 72 0C 7min。步骤c中，进行琼脂糖凝胶电泳分析采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为1. 7%。本实施例仍为双重PCR反应体系，控制的工艺参数为ddH20IOxPCR 缓冲液 + (NH4)2SO42.5μ MgCl2(25mM)dNTP(lOmM)Ι.Ομ 牛上、下游引物(ΙΟμΜ)0.5μ 猪上、下游引物(ΙΟμΜ)1单DNA Taq聚合酶0.2μL模板DNAΙ.Ομ 本实施例添加的猪肉粉质量比例分别占奶粉的0. 1 %，0. 5 %，1 %，2. 5 %，5 %， 10%，然后以该奶粉为待测产品，采用本实施例所述的工艺过程及控制参数，申请人成功地检测出此系列奶粉中含有的猪源成分，最低检出限为0. 1%，其检测精度达到了 100%。实施例三本实施例与实施例一的区别仅在于步骤b中，对提取的基因组DNA、牛源DNA和猪源DNA进行PCR扩增采用的反应条件为预变性96°C 8min ；变性96°C 40s，退火60°C 40s，延伸72°C 120s，共35个循环，最后延伸 720C IOmin0步骤c中，进行琼脂糖凝胶电泳分析采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为2. 0%。本实施例采用单重PCR反应体系，控制的工艺参数为
灭菌 ddH20
IOxPCR 缓冲液2.5pL
MgC12(25mM)1.5μΙ
dNTP(lOmM)0.5μ
牛或猪特异性上、下游引物(ΙΟμΜ) 0.5μ DNATaq 聚合酶0.2μ
模板 DNAΙ.Ομ 本实施例添加的猪肉粉质量比例分别占奶粉的0. 1 %，0. 5 %，1 %，2. 5 %，5 %， 10%，然后以该奶粉为待测产品，采用本实施例所述的工艺过程及控制参数，申请人成功地检测出此系列奶粉中含有的猪源成分，最低检出限为0. 1%，其检测精度达到了 100%。
权利要求
1.一种牛乳粉中猪源掺加物的一重/双重PCR检测方法，其特征在于，首先对待测产品的DNA模板进行提取，然后采用牛特异性引物和猪特异性引物对提取的基因组DNA进行 PCR扩增，同时对牛源DNA进行PCR扩增做为阴性对照组，对猪源DNA进行PCR扩增做为阳性对照组，然后对所有扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳分析；最后根据被测产品孔出现的电泳带与阳性对照组和阴性对照组进行比对，即可判定产品中是否添加了猪源掺加物。
2.根据权利要求1所述的牛乳粉中猪源掺加物的一重/双重PCR检测方法，其特征在于，牛特异性引物1和猪特异性引物2具有的核苷酸序列为引物 1 -1 5' -CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3 ‘；引物 1-2 5' -AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCTAT-3 ‘；引物 2-1 5' -AAGTTAGAGATCGGGAGCCTAA-3 ‘；引物 2-2 5' -AAGGTGACAATAGGTAGTCC-3 ‘。
3.根据权利要求1所述的牛乳粉中猪源掺加物的一重/双重PCR检测方法，其特征在于，PCR反应所用试剂还包括Taq酶、dNTPUOX缓冲液、MgCl2和灭菌水。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的牛乳粉中猪源掺加物的一重/双重PCR检测方法，其特征在于，所述的PCR引物浓度为0. 1-0. 4μ mol/L。
5.根据权利要求4所述的牛乳粉中猪源掺加物的一重/双重PCR检测方法，其特征在于，所述的PCR引物浓度为0.2 μ mol/L。
6.根据权利要求1-3任意一项所述的牛乳粉中猪源掺加物的一重/双重PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应循环条件为预变性92 96 °C 3 8min ；变性92 96 °C 20 40s，退火52 60°C 20 40s，延伸72°C 30 120s，共；35个循环，最后延伸72°C 3 lOmin。
7.根据权利要求6所述的牛乳粉中猪源掺加物的一重/双重PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应循环条件为预变性94°C 4min ；变性94°C 30s,退火30s,延伸 72°C 60s，共；35个循环，最后延伸72°C 7min。
8.根据权利要求1-3任意一项所述的牛乳粉中猪源掺加物的一重/双重PCR检测方法，其特征在于，进行琼脂糖凝胶电泳分析采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为1. 5 2. 0%。
9.根据权利要求8所述的牛乳粉中猪源掺加物的一重/双重PCR检测方法，其特征在于，进行琼脂糖凝胶电泳分析采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为1. 7%。
全文摘要
本发明提供一种牛乳粉中猪源掺加物的一重/双重PCR检测方法，属于食品生物技术领域。所用试剂包括Taq酶、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)、10×缓冲液、MgCl2、灭菌水、引物和模板DNA。按照如下步骤进行检测对待测产品的DNA模板进行提取、PCR扩增及对扩增产物进行分析，从而判定是否有猪源掺加物，该方法的检出限为0.1％。本发明提供的方法可快速、准确地检测出被检样品中的猪源掺加物，以有效解决乳品企业现有的掺假检测漏洞，为实现从分子水平对牛乳粉质量的控制提供研究基础。本方法成本低、敏感性高、操作简便、耗时短，适用于食品质量和安全检测领域。
文档编号C12Q1/68GK102367473SQ20111018917
公开日2012年3月7日 申请日期2011年7月7日 优先权日2011年7月7日
发明者仇丽亚, 徐伟丽, 李启明, 汪家琦, 马莺 申请人:哈尔滨工业大学