专利名称：西风小麦抗小麦黄花叶病毒主效qtl的分子标记方法
技术领域：
本发明公开了 ‘西风小麦’抗小麦黄花叶病毒主效QTL QYm.nmi-5A. 1饱分子标记方法，属于生物技术领域。可为小麦抗黄花叶病毒育种提供新的基因资源；与QYm. nau~5A. 1紧密连锁标记的引物可用于分子标记辅助选择育种。背景技术：
普通小麦(Jriticum aestivum D有21对染色体，每对包含两条一样的染色体，这 21 条染色体分别为 1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、;3B、3D、4A、4B、4D、5A、5B、5D、6A、6B、6D、7A、7B、 7D，普通小麦通常用AABBDD表示(图1)。每条染色体又包含长臂和短臂，分别用L和S表示，比如5A染色体包括长臂5AL和短臂5AS。幢(Jriticum aestivum L)作为世界性的重要粮食作物，在农业生产中具有举足轻重的地位，但由真菌一禾谷多黏菌graminis)(见参考文献=Inouye T (1969) Viral pathogen of the wheat yellow mosaic disease. Nogaku Kenkyu 53:61-68)介导的小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic bymovirus，WYMV)引起的小麦黄花叶病(Wheat yellow mosaic，WYM)对小麦的生长发育及产量造成了严重危害，正日益成为危害我国和日本等亚洲国家小麦生产的最严重的病害之一(见参考文献1、陶家凤，秦家忠，肖际亨，沈言章，赵福臻，李天眷，谢贻远，何代富，饶有后，黄显华(1980)四川土传小麦黄色花叶病的研究.植物病理学报10:5-25 ;2、于善谦，陈仲宜，徐来升，张若平，王鸣岐， 罗瑞梧(1986)发生在我国的小麦黄花叶病毒病.植物保护学报13:217-219 ;3、李大伟， 韩成贵，邢怡明，田兆丰，于嘉林，蔡祝南，刘仪(1997)中国小麦黄花叶病毒(WYMV)分布的 RT-PCR鉴定.植物病理学报27:303-307)。将抗性主效QTL/基因引入小麦栽培品种，培育和推广抗病毒品种是目前生产上防治小麦黄花叶病最经济有效的方法。普通小麦品种‘西风小麦’(公知公用，见参考文献钱存鸣，周朝飞，姚国才， 姚金保，盛培英，杨学明(1999)小麦新品种宁麦9号的选育与应用.江苏农业科学 3:19-20)具有抗倒伏、白粉病、赤霉病、条锈病、穗发芽等优异性状，抗病性状突出，综合性状优良。南京农业大学细胞遗传所对‘西风小麦’抗黄花叶病进行了鉴定，结果表明‘西风小麦’对小麦黄花叶病表现出高抗，‘镇9523’表现高感。为了进一步研究‘西风小麦’对小麦黄花叶病的抗性遗传机制和定位抗性QTL，南京农业大学细胞遗传所以高抗小麦黄花叶病的‘西风小麦’作母本、高感小麦抗黄花叶病的‘镇9523’(审定品种)作父本、通过单籽传法(Single-seed descent，SSD)构建了 F6 重组自交系群体(Recombinant inbred line, RIL)，并开展了利用该RIL群体进行抗性QTL定位以及与主效QTL紧密连锁分子标记的筛选工作，并开展了利用“RILV-6X镇9523”次级F2分离群体进一步评价抗病主效QTL QYm. nau~5A. 1的抗病效应的研究，最后进行了利用高抗小麦黄花叶病的‘西风小麦’衍生品种验证与QYm. nau~5A.紧密连锁分子标记的有效性等研究。
发明内容
技术问题本发明的目的在于公开来自普通小麦品种‘西风小麦’的抗小麦黄花叶病主效QTL QYm. nau~5A. 7，该QTL可为小麦抗病毒育种提供新的基因资源；同时，提供与QYm.nau~5A. 1紧密连锁分子标记CTMW^和CTMWM的引物和用法，可用于分子标记辅助选择育种。技术方案
1、本发明中的主效QTL QYm. nau~5A. 7来自抗小麦黄花叶病小麦品种‘西风小麦’，々7 . nau~5A. 1对小麦黄花叶病的抗性稳定，在四个环境中(2007在南京六合试验点；2008-2010 连续三年在江苏扬州试验点)均可检测到；贡献率大，可解释25. 9-53. 7%的表型变异。2、本发明中与抗小麦黄花叶病主效QTL /^^/-况.7紧密连锁的两个标记的引物是分别以小麦EST (BE426712和BE497829)序列为模板设计而得到的(图3)，其序列为，
标记67似^//於的引物 CINAU152F CTTGGTTTCGGTGTGTGTAT CINAU152R :CCATTCTGATGGAAGCAATA ； 或标记CINAUl53的引物 CINAU153F :GCAAAAATGTAATGCACCAT CINAU153R :GTTGCTATTGCCTTCAGTTG。其中，用标记CINAU152的引物从含有QYm. nau~5A. 7的抗病植株中扩增出约 IlOObp的特异条带，或者用标记CTMWM的引物从含有/^y-SA 1的抗病植株中扩增出约900bp的特异条带-MH CINAU 152琳CINAU 153与QYm. nau~5A. 1之间的遗传距离分别为 0. 0 和 0. IcM0上述引物用于‘西风小麦’中抗小麦黄花叶病主效QTL QYm. nau~5A. 1的分子标记方法，包括
(1)以待鉴定材料的DNA作为模板，用CTMW於或CTMWM作为引物进行PCR扩增； PCR 试剂组成为含 20-100ng DNA 的 1. Ομ DNA 模板，1. Ομ 10XPCR buffer, 0. 8μ
MgCl2,0. 8μ dNTP，左右引物各 0· 2μ ，0· 15μ Tag DNA polymerase, 5. 85 μ ddH20 ；
PCR程序为94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸1分10秒， 35个循环；72°C延伸10分钟；10°C保存；
PCR产物检测PCR产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比为39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法检测；
(2)两对标记引物鉴定QYm.nau~5A. 1的结果为
用标记CTMiZA^的引物进行PCR扩增，能扩增出约IlOObp特异条带的植株为含有 QYm. nau~5A. 1 的植株；
或者用标记CV^WM的引物进行PCR扩增，能扩增出约900bp特异条带的植株为含有 QYm. nau-5A. 1 的植株。有益效果
1、本发明中公开的来自‘西风小麦’的抗小麦黄花叶病主效QTL 0rm.naU-5A」对病毒的抗性稳定，在四个环境中(2007在南京六合试验点；2008-2010连续三年在江苏扬州试验点)均可检测到；贡献率大，可解释25. 9-53. 7%的表型变异。来自‘西风小麦’的抗小麦黄花叶病主效QTL QYm. nau~5A. 1在小麦抗病育种中具有较高的利用价值。2、本发明中公开的与‘西风小麦’中抗小麦黄花叶病主效QTL QYm. nau_5A. 1紧密连锁的两对分子标记的引物(CINAU152F/CINAU152R和CINAU153F/CINAU153R)是基于小麦 EST序列设计而成，用来鉴定植株中是否含有QYm. nau-5A. Λ简单易行、方便快捷、扩增稳定。3、标记引物 CINAU152F/CINAU152R 和 CINAU153F/CINAU153R 扩增的产物与 QYtn. /^ -况.7之间的遗传距离非常近，分别为0.0和0. lcM，所以用这两对标记引物进行PCR扩增，利用分子标记辅助选择1的准确性高。四
图1 普通小麦染色体示2 小麦抗黄花叶病单株抗性鉴定分级标准
图 3 两对标记引物 CINAU152F/CINAU152R和 CINAU153F/CINAU153R所对应的小麦 EST (BE426712和BE497829)序列及引物序列位置
图4 ‘西风小麦’中抗小麦黄花叶病主效QTL QYm. nau~5A. 7在5A染色体上的分布注左边的数字代表叠加的遗传距离(cM)，四个环境及其总平均值检测到的QTL峰值的位置用不同的三角符号标出。图5 用“西风小麦X镇9523”RIL群体双亲和部分抗、感家系的DNA作为模板，分别用本发明中的两对标记引物CINAU152F/CINAU152R(a)和CINAU153F/CINAU153R(b)进行PCR扩增，结果表明标记引物CINAU152F/CINAU152R在抗病亲本‘西风小麦’(泳道1)和抗病家系(泳道3、4、7、8、10、14、17、18、20和21)中均扩增出约1100 bp的特异条带，标记引物CINAU153F/CINAU153R均扩增出约900 bp的特异条带；而这两对标记引物在感病的亲本和家系中均未扩增出相应的特异条带。箭头所示为特异条带。注M. Marker ； 1.西风小麦；2.镇9523 ;3_24.部分抗、感家系；R.纯合抗病； S.纯合感病
图6 用“RILV-6X镇9523”次级F2分离群体双亲和抗、感池及部分抗、感单株的DNA作为模板，分别用本发明中的标记引物CINAU152F/CINAU152R (a)和CINAU153F/CINAU153R (b)进行PCR扩增，结果表明标记引物CINAU152F/CINAU152R在抗病亲本‘RILV-6，(泳道 1)、抗池(泳道3)、纯合抗病单株(泳道6、11和12)、杂合抗病单株(泳道7、9-10、13-14、16、 19-22和中均扩增出约1100 bp的特异条带，标记引物CINAU153F/CINAU153R均扩增出约900 bp的特异条带；而这两对标记引物在感病的亲本和单株中均未扩增出相应的特异条带。箭头所示为特异条带。注M.Marker ； 1. RIL5-6 ；2.镇 9523 ;3.抗池；4.感池；5-24.部分抗、感单株；R.纯合抗病；H.杂合抗病；S.纯合感病。图7 用抗小麦黄花叶病‘西风小麦’的衍生品种和感小麦黄花叶病品种的 DNA作为模板，分别用本发明中的标记引物CINAU152F/CINAU152R (a) 和CINAU153F/ CINAU153R(b)进行PCR扩增，结果表明标记引物CINAU152F/CINAU152R在‘西风小麦， (泳道1)及其衍生的抗病品种(泳道2-4)中均扩增出约1100 bp的特异条带，标记引物 CINAU153F/CINAU153R均扩增出约900 bp的特异条带；而这两对标记引物在感病品种(泳道5-16)中均未扩增出相应的特异条带。箭头所示为特异条带。注M. Marker ； 1. ‘西风小麦’；2_4.高抗小麦黄花叶病的‘西风小麦’衍生品种 ‘宁麦9号’、‘宁麦16号’和‘扬麦18号’ ；5-16.高感小麦黄花叶病品种‘镇9523’、‘皖麦36，、‘郑麦9094，、‘周麦18，、‘陕麦139，、‘蚂蚱麦，、‘扬麦10，、‘济南5号，、‘北京11，、‘有芒红18号’、‘观0089’和‘临农11’ ；R.纯合抗病；S.纯合感病。五具体实施例方式
1、‘西风小麦’中抗小麦黄花叶病主效QTL的发掘
小麦抗黄花叶病的抗性鉴定标准分为0-5级(图2)(参考文献刘伟华，何震天，耿波，侯明生，张敏，聂桓等(2004)小麦对黄花叶病的抗性鉴定及典型品种的遗传分析.植物病理学报34342447) :0级为植株无症状；1级为植株矮缩不明显，轻度花叶， 一般不产生明显的条纹坏死斑，叶片不黄化或少数黄化；2级为植株矮缩不明显，轻度花叶，产生明显的条纹坏死斑，叶片黄化明显；3级为植株轻度矮缩，花叶明显，条纹坏死斑占叶面积1/2左右，部分叶片黄化，少数枯死，分蘖黄化矮缩；4级为植株明显矮缩，严重花叶， 条纹斑占叶面积3/4左右，心叶细弱扭曲或呈缩顶状，部分叶片和分蘖枯死；5级为植株严重矮缩，大部分叶片和分蘖或整株枯死。‘西风小麦’对小麦黄花叶病表现高抗，抗性水平为0级；‘镇9523’则表现高感，抗级水平为5级。在四个环境中(2007在南京六合试验点； 2008-2010连续三年在江苏扬州试验点)对“西风小麦X镇9523”的RIL群体(重组自交系群体)进行了小麦黄花叶病抗性鉴定，结合构建的分子标记连锁图谱来定位‘西风小麦’中抗小麦黄花叶病的QTL，其中位于‘西风小麦’ 5AL染色体上的主效QTL QYm. nau~5A. 1在四个环境中均被检测到，可解释25. 9-53. 7%的表型变异(图4)。新检测到的QYm. nau~5A. 1是以往研究不曾报道过的，可作为小麦抗黄花叶病育种新的基因资源来加以利用。2、与QYm. nau~5A. 1紧密连锁分子标记引物的设计
在上述分子标记连锁图谱构建和抗小麦黄花叶病主效QTL QYm. nau~5A. 1发掘的研究中，两对分子标记CINAU 152和CINAU 153与QYm. nau~5A. 1紧密连锁(图4)，并且与其LOD峰值(52. IcM)的遗传距离分别为0. 0和0. 4cM0这两对标记的引物是根据小麦第五同源群上的两个EST序列(BE426712和BE497^9)(公知公用，见参考文献Qi LL, Echalier B, Chao S, Lazo GR, Butler GE, Anderson OD et al (2004) A chromosome bin map of 16, 000 expressed sequence tag loci and distribution of genes among the three genomes of polyploid wheat. Genetics 168:701-712)，采用在线引物设计软件 Primer3 V0. 4. 0 设计而成(http://frodo. wi. mit. edu/primer3/)。标记CINAUl52 的引物为 CINAU152F CTTGGTTTCGGTGTGTGTAT 和 CINAU152R CCATTCTGATGGAAGCAATA ；(图 3)
标记 CINAU153 的引物为 CINAU153F GCAAAAATGTAATGCACCAT 禾Π CINAU153R GTTGCTATTGCCTTCAGTTG)。(图 3)
3、标记引物 CINAU152F/CINAU152R 和 CINAU153F/CINAU153R 在“西风小麦 X 镇 9523”RIL群体中的分子检测
利用标记引物CINAU152F/CINAU152R在RIL群体的164个家系及其双亲中进行PCR扩增检测。结果表明在高抗亲本‘西风小麦’和83个家系中均扩增出约IlOObp的特异条带， 而在高感亲本‘镇9523’和剩下的81个家系中均未扩增出该特异条带(图fe)。利用标记引物CINAU153F/CINAU153R在RIL群体的164个家系及其双亲中进行 PCR扩增检测。结果表明在高抗亲本‘西风小麦’和84个家系中均扩增出约900bp的特异条带，而在高感亲本‘镇9523’和剩下的80个家系中未扩增出该特异条带(图恥)。
PCR 试剂组成为含 20_100ng DNA 的 1. Ομ DNA 模板，1. OPLIOXPCR buffer, 0. 8pLMgCl2，0. 8μ χΙΝΤΡ，左右引物各 0· 2μ ，0· 15μ Taq DNA polymerase, 5. 85μ dd H20。PCR程序为94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸1分10 秒，35个循环；72°C延伸10分钟；10°C保存，PCR产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比为 39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法进行染色。4、标记引物 CINAU152F/CINAU152R 和 CINAU153F/CINAU153R 在 F2 分离群体中的分子检测
为了进一步评价1的抗病效应，本实验室又根据检测到的3个QTL置信区间内的分子标记在RIL群体及双亲中的扩增结果，并结合各家系在四个环境中的抗性鉴定结果，共鉴定出12个仅含有主效QTL QYm. nau~5A. 1而不含其它微效QTL、黄花叶病抗性水平为0级的高抗家系，任择其中一个高抗家系‘RILV-6，，构建了 “RILV-6 X镇9523”次级 F2分离群体(280个单株)。遗传分析表明，nau~5A. 1在次级F2分离群体中呈显性单基因遗传。利用标记引物(讯々肌52 /(讯4肌521 在F2群体双亲和抗、感池及群体单株中进行 PCR扩增检测(条件和方法同上)。结果表明在280个F2单株中，60株纯合抗病单株均扩增出与高抗亲本‘RILV-6’ 一致的特异条带(约1100bp)，77株纯合感病单株均扩增出与高感亲本‘镇9523’ 一致的特异条带(约850bp)，而143株杂合抗病单株能同时扩增两种特异条带(图6a)。利用标记引物CINAU153F/CINAU153R在&群体的双亲和抗、感池及群体单株中进行PCR扩增检测(条件和方法同上)。结果表明在280个F2单株中，203株抗病单株均扩增出与高抗亲本‘RILV-6’ 一致的特异条带(约900bp)，而77株感病单株均未扩增出该特异条带(图6b)。根据扩增结果和连锁分析，结果表明标记CINAU152和CINAU153与QYm. nau-5A. 1之间的遗传距离分别为0. 0和0. lcM。次级F2分离群体和RIL群体的结果互相验证，即QYm. nau~5A. 1既是‘西风小麦’ 中抗小麦黄花叶病的主效QTL，又是高抗家系‘RILV-6’中抗小麦黄花叶病基因，并且标记 CINAUl52 和 CINAU153 与 QYtn. nau~5A. 1 紧密连锁。5、利用抗小麦黄花叶病‘西风小麦’的衍生品种和感小麦黄花叶病品种验证标记引物 CINAU152F/CINAU152R 和 CINAU153F/CINAU153R 的有效性
国内育种工作者通过常规育种方法直接或间接利用‘西风小麦’育成了一些广泛推广的高抗小麦黄花叶病的小麦品种，如‘宁麦9号’(公知公用，审定品种)、‘宁麦16号’(公知公用，审定品种)和‘扬麦18号’等(公知公用，审定品种)。而‘镇9523’(公知公用，审定品种)、‘皖麦36’(公知公用，审定品种)、‘郑麦9094’ (公知公用，审定品种)、‘周麦18’(公知公用，审定品种)、‘陕麦139’(公知公用，审定品种)、‘蚂蚱麦’(公知公用，审定品种)、‘扬麦10’(公知公用，审定品种)、‘济南5号’(公知公用，审定品种)、‘北京11’(公知公用，审定品种)、‘有芒红18号’(公知公用，审定品种)、 ‘观0089’(公知公用，审定品种)和‘临农11’(公知公用，审定品种)则为感小麦黄花叶病品种。为了检测标记CINAU152和CINAU153追踪‘西风小麦’衍生品种抗小麦黄花叶病 QTL QYm. nau~5A. 1的有效性，本研究利用抗小麦黄花叶病‘西风小麦’的衍生品种和感小麦黄花叶病品种为测试材料，结果发现标记CINAU152和CMAU153的引物在所有抗小麦黄花叶病‘西风小麦’的衍生品种中分别扩增出约IlOObp (图7a)和900bp特异条带(图7b)，在感黄花叶病品种中未扩增出相应的特异条带。该实验证明了标记CINAU152和CINAU153 的引物可用于分子标记辅助选择育种，特异性地追踪‘西风小麦’ 5AL染色体上的抗小麦黄花叶病 QTL QYm. nau~5A. 1。
权利要求
1.‘西风小麦’中抗小麦黄花叶病主效QTL QYm. nau~5A. 1的分子标记引物，其序列为， 标记67似^//於的引物CINAU152F CTTGGTTTCGGTGTGTGTAT CINAU152R :CCATTCTGATGGAAGCAATA ； 或标记CINAUl53的引物 CINAU153F :GCAAAAATGTAATGCACCAT CINAU153R :GTTGCTATTGCCTTCAGTTG。
2.根据权利要求1所述‘西风小麦’中抗小麦黄花叶病主效QTLQYm. nau~5A. 1分子标记引物，其特征在于，用标记的引物从含有nau~5A. 1的抗病植株中扩增出约 IlOObp的特异条带，或者用标记CTMWM的引物从含有/^y-SA 1的抗病植株中扩增出约900bp的特异条带-MH CINAU 152琳CINAU 153与QYm. nau~5A. 1之间的遗传距离分别为0. 0和0. IcM, QTL QYm. nau~5A. 1对小麦黄花叶病的抗性稳定，解释25. 9-53. 7%的表型变异。
3.权利要求1或2所述引物用于‘西风小麦’中抗小麦黄花叶病主效QTLQYm. nau~5A. 1 的分子标记方法，包括(1)以待鉴定材料的DNA作为模板，用CINAU152或CINAU153的引物进行PCR扩增； PCR 试剂组成为含 20-100ngDNA 的 μ DNA 模板，1. Ομ 10XPCR buffer,0. 8μ MgCl2,0. 8μ dNTP，左右引物各 0· 2μ ，0· 15μ Tag DNA polymerase, 5. 85μ ddH20 ；PCR程序为94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸1分10秒， 35个循环；72°C延伸10分钟；10°C保存；PCR产物检测PCR产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法检测；(2)两对标记引物鉴定QYm.nau~5A. 1的结果为用标记CTMiZA^的引物进行PCR扩增，能扩增出约IlOObp特异条带的植株为含有 QYm. nau~5A. 1 的植株；或者用标记CV^WM的引物进行PCR扩增，能扩增出约900bp特异条带的植株为含有 QYm. nau-5A. 1 的植株。
全文摘要
本发明公开了‘西风小麦’抗小麦黄花叶病毒主效QTLQYm.nau-5A.1的分子标记方法，属于生物技术领域。首先公开了‘西风小麦’抗小麦黄花叶病毒主效QTLQYm.nau-5A.1，同时公开了与该QTL紧密连锁的两个分子标记CINAU152和CINAU153。在含有QTLQYm.nau-5A.1的材料中，标记引物CINAU152F/CINAU152R扩增出约1100bp的产物与QYm.nau-5A.1紧密连锁，遗传距离为0.0cM，标记引物CINAU153F/CINAU153R扩增出约900bp的产物与QYm.nau-5A.1紧密连锁，遗传距离为0.1cM。本发明公开的QYm.nau-5A.1可为小麦抗黄花叶病毒育种提供新的基因资源；与QYm.nau-5A.1紧密连锁标记的引物，可用于分子标记辅助选择育种。
文档编号C12N15/11GK102260669SQ201110194389
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月12日 优先权日2011年7月12日
发明者刘洋洋, 吴真真, 曹爱忠, 朱晓彪, 王海燕, 王秀娥, 王耀南, 聂明娟, 郭娇, 陈佩度 申请人:南京农业大学