专利名称：一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法
技术领域：
本发明涉及饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种利用啤酒废酵母自溶并添加微生物酶制备甘露寡糖的方法。
背景技术：
我国的啤酒工业经过近几十多年的迅猛发展，目前啤酒生产厂家已发展至800多家。自2001年以来，我国已成为世界上第一大啤酒生产国，而且啤酒产量每年还在以5%
的速度增长。2010年，啤酒生产量已达到4483万吨。啤酒废酵母是啤酒生产中的重要副产物，酵母泥的产量约占啤酒总产量的H每年我国啤酒生产企业排弃的废酵母泥多达90万吨 135万吨。啤酒废酵母的主要成分为蛋白质、多糖、核酸、维生素、微量元素和酶，其中多糖主要存在于酵母细胞壁中，占细胞壁的60%。目前，对啤酒废酵母的综合利用大多数集中在对其中的蛋白质、核酸、维生素、微量元素和酶方面，而对其细胞壁多糖的开发应用研究很少。以啤酒废酵母为原料来制备细胞壁多糖的方法大体可归纳为化学破壁(酸解、碱解)、物理破壁(液体剪切、固体剪切等)、生物破壁(酶解、自溶)。其中，化学破壁不仅会造成一些营养成分的破坏，而且增大了有效成分提取的难度；物理破壁虽然方法简单、成本低， 能完整保留营养成分，但其破壁效果较差；而生物破壁中的酶解法会增加提取成本，故上述细胞壁多糖的制备方法均不便于工业上的广泛应用。自溶法是以存在酶活性的新鲜活酵母为原料，利用酵母细胞本身的酶系，在一定条件下，将酵母体内的糖类物质、蛋白质和核酸分解为还原糖、氨基酸、肤类、核苷酸等小分子物质并从酵母细胞内提取出来的一种方法。 自溶法工艺简便，应用广泛，生产成本低，对环境污染小，适合于工业化提取。甘露寡糖(M0S，即Mannose-oligosaccharides)是甘露糖或甘露糖与葡萄糖通过 α-1,2, α-1,3, α _1，6或β _1，3、β _1，4糖苷键组成的寡聚糖，具有调节动物胃肠道微生态环境和动物机体免疫调节的功能。在食品、医药和动物饲料等方面具有重要的应用价值。由于酶解法反应条件温和及容易控制等优点，因此，采用甘露聚糖酶水解甘露聚糖制备甘露寡糖是生产甘露寡糖的主要方法。甘露聚糖酶的来源较广泛，包括细菌、真菌、放线菌、 植物以及软体动物等。其中，微生物来源的甘露聚糖酶具有PH最适点、温度范围和底物专一性等显著特点，其活性高、成本低、来源稳定、提取方便，且比动植物具有更广泛的应用， 是产生甘露聚糖酶的主要来源。目前，细菌中的芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌，真菌中的曲霉、 木霉、酵母、青霉、多孔菌、核盘菌和放线菌中的链霉菌都是产生甘露聚糖酶的常见种类。根据其作用底物不同，甘露聚糖酶可分为甘露聚糖酶和异甘露聚糖酶，其中，甘露聚糖酶的作用底物为魔芋粉、槐豆胶等植物多糖，异甘露聚糖酶的作用底物为异甘露聚糖，这类异甘露聚糖主要存在于酵母等微生物的细胞壁中。目前，甘露寡糖主要是以甘露聚糖酶水解魔芋粉、槐豆胶等植物多糖制备而成，生产成本较高。而以异甘露聚糖为原料，采用异甘露聚糖酶水解法制备甘露寡糖并未见文献记载。
发明内容
针对现有的以β -甘露聚糖酶水解植物多糖制备甘露聚糖，生产成本高的问题， 本发明的目的是提供一种利用啤酒废酵母制得异甘露聚糖，并结合异甘露聚糖酶进行水解制备甘露寡糖的方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法步骤如下
(1)由啤酒废酵母制得酵母细胞壁液体或固体；
(2)制备异甘露聚糖酶粗酶液；
(3)将经步骤(2)制得的异甘露聚糖酶粗酶液加入经步骤(1)制得的酵母细胞壁液体中水解制备甘露寡糖。所述步骤(1)中制备酵母细胞壁固体的步骤如下
(a)啤酒废酵母预处理将洗涤后的啤酒废酵母进行离心分离得到酵母泥；
(b)制备酵母细胞壁液体将质量浓度为50g/L 150g/L的酵母泥、质量浓度为400g/ L 500g/L的醋酸-醋酸钠缓冲液和蒸馏水混合，将制得的混合液置入密封容器中，搅勻后静止0. Ih，并在温度30° C 80° C下，水浴加热1 48h ；酵母泥、醋酸-醋酸钠缓冲液和蒸馏水三种物料按1:3. 5:4. 5配比组成；
(c)制备酵母细胞壁固体将经步骤(b)制得的酵母细胞壁液体进行离心分离，弃上清液，将沉淀部分在温度40° C 80° C下干燥1 48h，制得酵母细胞壁固体。所述步骤(b)中所述醋酸-醋酸钠缓冲液是将质量浓度分别为2. 4g/L的醋酸、 109. 2g/的醋酸钠、20g/L的氯化钠和IL蒸馏水混合制得，所述醋酸-醋酸钠缓冲液的pH 值为6。所述步骤(2)中制备异甘露聚糖酶粗酶液的步骤如下 (a)制备种子培养基溶液和发酵培养基溶液
按如下质量份的原料制备种子培养基溶液酵母细胞壁0. 5g 20g、
蛋白胨Ig 40g、氯化钠0. 5g 20g、水1000 ml，种子培养基溶液pH值为5. 0
8. 0。按如下质量份的原料制备发酵培养基溶液酵母细胞壁0. 5g 20g、
蛋白胨Ig 40g、氯化钠0. 5g 20g、水1000ml，发酵培养基溶液pH值为5.0 8.0。(b)种子液的制备将枯草芽孢杆菌菌株接种到经步骤(a)制得的种子培养基溶液中，在温度25° C 45° C下培养12h 72h，按质量浓度为10g/L 200g/L的接种量接种到经步骤(a)制得的发酵培养基溶液培养，振荡器中温度为25° C 45° C、振荡频率为lOOr/min 250r/min，振荡培养时间为12h 72h，制得发酵液。(c)异甘露聚糖酶粗酶液的制备对经步骤(b)制得的发酵液进行离心分离，取上清液制得异甘露聚糖酶粗酶液。所述步骤(3)中甘露寡糖的制备步骤如下
取质量浓度为200g/L 700g/L的异甘露聚糖酶粗酶液加入质量浓度为10g/L 200g/L的酵母细胞壁液体制得混合液，所述混合液pH值为5 8，水解温度为30° C 80° C，水解时间为池 10h，水浴加热所述混合液至粘稠状，在30° C 100° C下烘干至恒重，粉碎制得甘露寡糖粉末。
所述异甘露聚糖酶粗酶液和酵母细胞壁液体的混合液的pH值为 5 8 ；所述混合液的水解温度为40-70° C，水解时间为4-6 h。在实际应用中种子液制备中采用的枯草芽孢杆菌菌株，也可以用安全性蜡样芽孢杆菌或其他分泌异甘露聚糖酶的安全微生物替代。本专利的效果在于利用啤酒废酵母自溶法来制备酵母细胞壁，在适宜条件下利用其自身的酶体系加水即可，减少了不必要的成本，再加入微生物来源的异甘露聚糖酶进行水解制备甘露寡糖。从社会效益来看是一个解决啤酒工业污染、变废为宝，改善环境的有效措施；从经济效益来看，以废啤酒酵母提取生物蛋白质后的残渣再利用制取甘露聚糖，提高了废啤酒酵母综合利用的附加值。产品稳定性好、产率高，且其工艺简单、零污染， 并降低了生产成本。
具体实施例方式实施例1 本发明的利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法包括以下步骤
一、酵母细胞壁的制备
1)啤酒废酵母预处理将啤酒废酵母从发酵罐中取出后用自来水洗涤，水温一般不超过10° C，以防止酵母自溶，对洗涤后的废酵母进行离心分离得到酵母泥，离心机转速 3000r/min，离心分离时间为30min，处理好的酵母泥为灰白色奶油状，低温保存。2)制备酵母液将质量浓度分别为2. 2g/L 2. 6g/L的醋酸、99. 2g/L 119. 2g/ 的醋酸钠、10g/L 30g/L的氯化钠和蒸馏水混合制得醋酸-醋酸钠缓冲液，醋酸-醋酸钠缓冲液的PH值为5 8。然后，由质量浓度为50g/L 150 g/L的酵母泥、质量浓度为400g/ L 500g/L的醋酸-醋酸钠缓冲液和蒸馏水按1:3. 5:4. 5配比组成制备酵母液，将制得的酵母液置入密封不锈钢桶中，搅勻后静止0. 5h lh，并在温度30° C 80° C下，水浴加热 12h 48h。3)提取酵母细胞壁将酵母液进行离心分离，离心机转速为lOOOr/min 9000 r/ min，离心分离时间为5min 30min。弃上清液，将沉淀部分转移到培养皿上并放入烘干箱，在温度40° C 80° C下干燥1 48h，制得酵母细胞壁固体，酵母细胞壁的得率为 99. 56%。二、异甘露聚糖酶的制备
根据其作用底物不同，甘露聚糖酶可分为甘露聚糖酶和异甘露聚糖酶，其中， 甘露聚糖酶的作用底物为魔芋粉、槐豆胶等植物多糖，这类甘露聚糖是由不同数量的甘露糖、葡萄糖和半乳糖等单糖分子通过β -1，4-D-甘露吡喃糖苷键连接而成的直链或支链聚合糖。异甘露聚糖酶的作用底物为异甘露聚糖，这类甘露聚糖主要存在于酵母等微生物的细胞壁中，为高度分支的多聚体，以α -1，6-D-甘露糖为骨架链，其中大部分甚至全部的残基具有α-1，2-或-1，3-连接的含有2 5个甘露糖残基的侧链。本发明中的异甘露聚糖酶是利用枯草芽孢杆菌来制备，具体包括以下步骤
1)制备种子培养基溶液和发酵培养基溶液按如下质量份的原料制备种子培养基酵母细胞壁0. 5g 20g、蛋白胨Ig 40g、氯化钠0. 5g 20g、水1000 ml，溶液pH值为5. 0 8. 0 ；按如下质量份的原料制备发酵培养基酵母细胞壁0. 5g 20g、蛋白胨Ig 40 g、氯化钠0. 5g 20g、水1000ml，溶液pH值5. 0 8. 0。2)种子培养基溶液的制备将菌株(枯草芽孢杆菌)接种到种子培养基的试管中， 在温度25° C 45° C下培养12h 72 h，按质量浓度为10g/L 200g/L的接种量接种到发酵培养基溶液培养，振荡器中温度为25° C 45° C、振荡频率为100 r/min 250r/ min，振荡培养时间为1 72h，制得发酵液。3)异甘露聚糖酶粗酶液的制备对发酵液进行离心分离，低温下离心机转速为 4000 r/min 13000 r/min，离心时间为5min 20min，取上清液即为异甘露聚糖酶粗酶液。其中，蛋白胨是有机化合物，它是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂。蛋白胨富含有机氮化合物及一些维生素和糖类，可以作为微生物培养基的主要原料。步骤2中的枯草芽孢菌株也可为安全性蜡样芽孢杆菌或其他分泌异甘露聚糖酶的安全微生物。三、甘露寡糖的制备
取质量浓度为200g/L 700g/L的异甘露聚糖酶粗酶液加入质量浓度为10g/L 200g/L的酵母细胞壁液体，混合液取样测pH值为5.0 8.0，水解温度为30° C 80° C， 水解时间为池 10h，水浴加热混合液至粘稠状，在30° C 100° C下烘干至恒重，粉碎制得甘露寡糖粉末。实施例2 =Ikg甘露寡糖的制备
取Ikg啤酒废酵母，向其中加入4. 375 L蒸馏水和5. 625 L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH =6.0)，在温度50° C下，水浴Mh，以转速3000 r/min对混合液进行离心分离，离心时间为 IOmin,弃上清液，将沉淀部分转移到培养皿上并放入烘干箱，在60° C下干燥24h后制得酵母细胞壁固体。取酵母细胞壁固体1kg，加入异甘露聚糖酶粗酶液6. 875L和蒸馏水5. 625 L，调节pH值为6.0，在温度55° C下，水浴水解4. 后取出烘干，并粉碎制得重量为1 kg 的甘露寡糖，甘露寡糖的有效含量为6.06 %。实施例2 :1000kg甘露寡糖的制备
取IOOOkg啤酒废酵母，向其中加入4375 L蒸馏水和5625 L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH =6. 0)，在温度50° C下，水浴Mh，以转速3000 r/min对混合液进行离心分离，离心时间 lOmin，弃上清液，将沉淀部分转移到烘干箱，在60° C下干燥24h后制得酵母细胞壁固体。 取酵母细胞壁固体1000 kg，加入异甘露聚糖酶粗酶液6875 L和蒸馏水5625 L，调节pH值为6.0，在温度55° C下，水浴水解4. 后取出烘干，并研碎制得重量为1000 kg的甘露寡糖。实施例3 20吨甘露寡糖的制备
取25吨啤酒废酵母，向其中加入87500 L蒸馏水和112500L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH =6. 0)，在温度50° C下，水浴Mh，以转速3000 r/min对混合液进行离心分离，离心时间 lOmin，弃上清液，将沉淀部分转移到烘干箱，在60° C下干燥24h后制得酵母细胞壁固体。 取酵母细胞壁固体20吨，加入异甘露聚糖酶粗酶液137500L和蒸馏水112500L，调节pH值为6. 0，在温度55° C下，水浴水解4.证后取出烘干，并粉碎制得重量为20吨的甘露寡糖。将利用上述技术获得的本产品作为饲料添加剂，以5g/kg的用量添加到奥尼罗非鱼的饲料中，其稚鱼和鱼种的增重率分别提高了 14. 3%和19. 2%，提高了血清超氧化物歧
7化酶(S0D)，溶菌酶和碱性磷酸酶活性。研究表明，饲料中添加0. 50% 0. 75%本专利制备的甘露寡糖，可显著提高罗非鱼生长性能，改善肠道结构功能，提高营养物质消化率和机体非特异性免疫功能，奥尼罗非鱼饲料中的甘露寡糖适宜添加量推荐为0. 50%。
本领域技术人员应该认识到，上述的具体实施方式
只是示例性的，是为了使本领域技术人员能够更好的理解本专利内容，不应理解为是对本专利保护范围的限制，只要是根据本专利所揭示精神所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利保护范围。
权利要求
1.一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，包括如下步骤(1)由啤酒废酵母制得酵母细胞壁液体或固体；(2)制备异甘露聚糖酶粗酶液；(3)将经步骤(2)制得的异甘露聚糖酶粗酶液加入经步骤(1)制得的酵母细胞壁液体或固体中，进行水解制备甘露寡糖。
2.根据权利要求1所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于所述步骤(1)中制备酵母细胞壁液体和固体的步骤如下(a)啤酒废酵母预处理将洗涤后的啤酒废酵母进行离心分离得到酵母泥；(b)制备酵母细胞壁液体将质量浓度为50g/L 150g/L的酵母泥、质量浓度为400g/ L 500g/L的醋酸-醋酸钠缓冲液和蒸馏水混合，将制得的混合液置入密封容器中，搅勻后静止0. Ih，并在温度30° C 80° C下，水浴加热1 48h ；酵母泥、醋酸-醋酸钠缓冲液和蒸馏水三种物料按1:3. 5:4.5配比组成；(c)制备酵母细胞壁固体将经步骤(b)制得的酵母细胞壁液体进行离心分离，弃上清液，将沉淀部分在温度40° C 80° C下干燥1 48h，制得酵母细胞壁固体。
3.根据权利要求2所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于所述步骤(b)中所述醋酸-醋酸钠缓冲液是将质量浓度分别为2. 4g/L的醋酸、109. 2g/的醋酸钠、20g/L的氯化钠和IL蒸馏水混合制得，所述醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值为6。
4.根据权利要求1所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于所述步骤(2)中制备异甘露聚糖酶粗酶液的步骤如下(a)制备种子培养基溶液和发酵培养基溶液；按如下质量份的原料制备种子培养基溶液酵母细胞壁0.5g 20g、蛋白胨Ig 40g、氯化钠0. 5g 20g、水1000 ml，种子培养基溶液pH值为5.0 8.0 ；按如下质量份的原料制备发酵培养基溶液酵母细胞壁0.5g 20g、蛋白胨Ig 40g、氯化钠0. 5g 20g、水IOOOml，发酵培养基溶液pH值为5. 0 8. 0 ；(b)种子液的制备将枯草芽孢杆菌菌株接种到经步骤(a)制得的种子培养基中，在温度25° C 45° C下培养1 72h，按质量浓度为10g/L 200g/L的接种量接种到经步骤(a)制得的发酵培养基培养，振荡器中温度为25° C 45° C、振荡频率为100 r/min 250r/min，振荡培养时间为1 72h，制得发酵液；(c)异甘露聚糖酶粗酶液的制备对经步骤(a)制得的发酵液进行离心分离，取上清液制得异甘露聚糖酶粗酶液。
5.根据权利要求1所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于所述步骤(3)中甘露寡糖的制备步骤如下取质量浓度为200g/L 700g/L的异甘露聚糖酶粗酶液加入质量浓度为10g/L 200g/L的酵母细胞壁液体制得混合液，所述混合液pH值为5 8，水解温度为30° C 80° C，水解时间为池 10h，水浴加热所述混合液至粘稠状，在30° C 100° C下烘干至恒重，粉碎制得甘露寡糖粉末。
6.根据权利要求5所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于所述异甘露聚糖酶粗酶液和酵母细胞壁液体的混合液的PH值为5-8。
7.根据权利要求5所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于所述混合液的水解温度为30-70° C，水解时间为3H
8.根据权利要求4所述的一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，其特征在于枯草芽孢菌株也可为安全性蜡样芽孢杆菌或其他分泌异甘露聚糖酶的安全微生物替代。
全文摘要
本发明公开了一种利用啤酒废酵母制备甘露寡糖的方法，涉及饲料添加剂技术领域。针对现有的以β-甘露聚糖酶水解植物多糖制备甘露寡糖，生产成本高的问题。本发明的制备方法步骤如下(1)由啤酒废酵母制得酵母细胞壁液体或固体；(2)制备异甘露聚糖酶粗酶液；(3)将经步骤(2)制得的异甘露聚糖酶粗酶液加入经步骤(1)制得的酵母细胞壁液体或固体中水解制备甘露寡糖。本发明的方法用于生产可作畜禽及水产饲料添加剂的甘露寡糖。
文档编号C12P19/14GK102268468SQ20111020270
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者冷向军, 汪立平, 穆昭艳, 赵勇 申请人:上海海洋大学