专利名称：水体环境中铜绿微囊藻噬藻体的SYBR-Green荧光定量RT-PCR检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用STOR-Green荧光定量RT-PCR技术对水体环境中铜绿微囊藻噬藻体进行定量检测和分析的方法，属于分子生物学领域。
背景技术：
蓝藻是一类原核光合自养生物，具有细菌的一些特征，因此又称为蓝细菌(Cyanobacteria)。感染蓝藻的病毒称为噬藻体(Cyanophage)，这是由于噬藻体与噬菌体非常相似的缘故。蓝藻是水华暴发的主要原因。近年来，随着经济的发展，人类活动的增加以及水体富营养化程度的提高，蓝藻“水华”的发生日益严重。噬藻体在海洋与淡水中都大量存在，并且蓝藻水华消退前后其含量有十分明显的变化，噬藻体作为蓝藻“水华”潜在的特异性生物控制因子，影响水体初级生产力的生产，其重要性逐渐为人们所认知。因此噬藻体可能是控制蓝藻水华生消的重要生态因子。噬藻体作为蓝藻的致死剂、基因信息载体及群落结构的调解者，广泛存在于海洋和淡水生态系统中。其海水表层水中的含量能达到细菌数量的10倍以上。海洋中感染聚球藻的噬藻体对聚球藻的日致死率最高能达到对％。因此，噬藻体对初级生产力有着不可忽视的影响。因其对细菌与蓝藻宿主的高致死率，藻类病毒在自然水体中对微藻密度具有显著的调节作用，也使得噬藻体成为水华治理过程中的“明星”。研究发现，通常情况下蓝藻水华过程中含有大量的病毒粒子，噬藻体的增殖会裂解水华蓝藻，从而导致宿主蓝藻死亡，一方面蓝藻数量变化造成噬藻体数量变化，另一方面，噬藻体对水华蓝藻的死亡有促进作用，噬藻体与藻类的数量总是保持季节性的平行关系。在发生水华的水体中，铜绿微囊藻是形成水华的优势种之一。自上世纪90年代，人们发现噬藻体丰富存在于海洋中，并且其在水生态系统中具有重要作用。由于各种现代实验技术的运用，现今在噬藻体的生态，分子生物学以及与蓝藻水华关系的研究上已取得一些阶段性成果。但是有待解决的问题也很多，比如噬藻体数量及其时空分布、分子进化与遗传多样性、噬藻体的生物学功能基因(特别是感染和裂解宿主的功能)等等。未来将着重利用分子生物学方法对噬藻体分布、丰度和遗传多样性、与宿主在分子水平上存在何种依存或制约关系、对初级生产力和水华的种群结构的调节作用以及实时定量检测的研究，并将噬藻体作为防治蓝藻类水华的有效生物调控因子加以利用。在加强噬藻体各方面基础研究的同时，着重研究其在水华形成与消退过程中所起的作用。最初，噬藻体分子生物学的研究对象主要局限于海洋噬藻体，研究深度局限于利用衣壳组装蛋白基因进行病毒检测、生态分布和遗传多样性分析。近来对淡水噬藻体的研究也得到了其应有的重视，一些现代的研究技术也被运用到噬藻体的研究当中。但研究噬藻体实时数量变化的方法还不多
发明内容
本发明以云南滇池为研究对象，通过STOR-Green荧光定量PCR技术，设计特异性扩增铜绿微囊藻噬藻体尾鞘蛋白基因(g91)的定量PCR引物，现有研究主要是通过普通PCR定性研究，本发明基于STOR-Green定量PCR定量检测噬藻体的方法，从噬藻体分子生物学层面，对待检水体中噬藻体数量及其时空分布、分子进化与遗传多样性、噬藻体的生物学功能基因(特别是感染和裂解宿主的功能)进行研究且有重要作用，从而将噬藻体作为防治蓝藻类水华的有效生物调控因子加以利用。水体环境中噬藻体的荧光定量PCR检测方法，包括基于铜绿微囊藻噬藻体Ma-LMMOl的g91基因片段，设计得到定量PCR外参标准品引物SH-WF和SH-WR，定量PCR引物SH-RTF和SH-RTR ；提取待检水样浓缩液中噬藻体DNA基因片段；利用引物对该基因片段进行荧光定量PCR扩增；对定量PCR结果进行分析。特异性扩增铜绿微囊藻噬藻体g91基因寡聚核苷酸的定量外参标准品引物SH-WF/ SH-WR 和定量 PCR 引物 SH-RTF/SH-RTR 如下
SH-WF :5’ -CTACCAGTGGCCGATATTTCCTT-3’SH-WR :5’ -GGTAAAGCCTCTATTAGCAGTGTTG-3’SH-RTF :5’ -ACATCAGCGTTCGTTTCGG-3’SH-RTR :5’ -GTGACAATCTGGTTAGGTAGGTCG-3’
利用定量PCR外参标准品引物SH-WF和SH-WR扩增g91基因得到荧光定量的外参标准曲线，定量PCR引物SH-RTF和SH-RTF扩增g91基因，根据结果进行统计分析待测水样中噬藻体的数量。本发明是通过下述的技术方案得以实现的
(1)基于铜绿微囊藻噬藻体Ma-LMMOl的g91基因片段，利用引物设计软件设计定量外参标准品引物SH-WF/ SH-WR和定量PCR引物SH-RTF/SH-RTR SH-WF :5’ -CTACCAGTGGCCGATATTTCCTT-3’SH-WR :5’ -GGTAAAGCCTCTATTAGCAGTGTTG-3’SH-RTF :5’ -ACATCAGCGTTCGTTTCGG-3’SH-RTR :5’ -GTGACAATCTGGTTAGGTAGGTCG-3’ ；
(2)提取待检水样浓缩液中噬藻体DNA基因片段；
(3)用定量外参标准品引物SH-WF:5，-CTACCAGTGGCCGATATTTCCTT-3，和 SH-WR5，-GGTAAAGCCTCTATTAGCAGTGTTG-3 ’扩增并构建铜绿微囊藻噬藻体g91基因定量检测的外参标准品，并根据标准品Ct值，得到g91基因定量标准曲线；
(4)用定量PCR 引物 SH-RTF :5’ -ACATCAGCGTTCGTTTCGG-3，禾口
SH-RTR :5，-GTGACAATCTGGTTAGGTAGGTCG-3，扩增待测样品中铜绿微囊藻噬藻体g91基因序列，将所测样品的Ct值与g91基因定量标准曲线对比得到检测水样中噬藻体g91基因拷贝数。本发明基于STOR-Green定量PCR定量检测噬藻体的方法，从噬藻体分子生物学层面，对待检水体中噬藻体数量及其时空分布、分子进化与遗传多样性、噬藻体的生物学功能基因(特别是感染和裂解宿主的功能)研究有重要作用，从而将噬藻体作为防治蓝藻类水华的有效生物调控因子加以利用。
图 1 为 SH-WF/SH-WR PCR 反应程序图2为SH-RTF/SH-RTR反应程序
图3为g91基因定量标准品线性关系，即外参标准品经外参引物扩增得到的标准曲线，图中所有标准品的Ct值基本在一条直线上，没有任何一个标准品出现偏差，R2达到0. 998。图4为g91基因定量标准品扩增曲线，1 XlO7Copies/μ L到1 X IO4Copies/μ L铜绿微囊藻噬藻体g91基因质粒标准品的变化趋势，显示为一组斜率相同，间距相等的平行曲线。图5为g91基因定量产物熔解曲线，除阴性对照(水)外，其他标准品的熔点峰都在86°C左右，曲线平稳，出峰尖窄。阴性对照PCR从65 ！到90 °C没有出现任何波动，熔点曲线为一条直线。图6为滇池全湖范围水样g91基因拷贝数随地点的变化情况图(由北向南)。
具体实施例方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步阐述本发明，但不以来限定本发明。实施例1
下列方法中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人的分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)或彭秀玲等人的基因工程实验技术(科学技术出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。噬藻体的基因序列来自分子生物学数据库(NCBI )。1. PCR引物设计
根据文献并结合Genebank中的BALST序列比对结果，参考铜绿微囊藻噬藻体Ma-LMMOl的尾鞘蛋白编码基因(g91)，NCBI序列号为AB242^1，利用Primer Premier 5. O和01igo6软件进行引物设计。设计得到定量PCR外参标准品引物SH-WF和SH-WR，定量引物SH-RTF和SH-RTF (表1)，设计好的引物由上海生工生物有限公司合成。表1.铜绿微藻噬藻体定量检测PCR引物2.噬藻体DNA的提取
(1).采集滇池的水样依次经纱布、0. 45um和0. 22um纤维滤膜过滤后置于4°C，黑暗条件下保存。
(2).水样过滤液以1. 5ml每管分装在1. 5ml的EP管(印pendorf tube)中，经冷冻干燥真空抽滤仪进行冷冻干燥，收集EP管底部水样过滤液的浓缩液至一新的EP管中，每管为250ul，并计算浓缩倍数。(3).使用上海华舜生物工程有限公司生产的小量病毒RNA/DNA抽提试剂盒完成水样过滤浓缩液中核酸的提取。具体操作步骤如下
a.在装有250ul水样过滤浓缩液的EP管中加入500ul裂解液RV，盖上盖子，高速振荡2分钟后，置于室温静置5分钟。b.加入750ul异丙醇，颠倒EP管以混勻。c.移取750ul至吸附柱，于室温、9，OOOg条件下离心15秒，倒掉收集管中的液体。d.将吸附柱移入同一个收集管中，将剩余的裂解物移入吸附柱中，于室温、9，OOOg条件下离心15秒后，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱移入同一个收集管中，于室温、9，OOOg条件下再离心15秒。e.加入500ul缓冲液RP，于室温、9，OOOg条件下离心30秒后将吸附柱移入一个干
净的收集管中。f.加入500ul洗脱液W3，静置1分钟后，于室温、9，OOOg条件下离心15秒后倒掉收集管中的液体，再将吸附柱移入同一个收集管中。g.加入500ul W3液，于室温、9，OOOg条件下离心15秒，倒掉收集管中的液体后将吸附柱移入同一个收集管中。h.于室温、9，OOOg条件下再离心1分钟。i.将吸附柱放入一个干净的1. 5ml的EP管中，在吸附膜中央加入30ul纯水，室温静置3分钟后，于室温、9，OOOg条件下再离心3分钟。j.用上一步的洗脱液再洗脱一次，提取所得的核酸产物储存于_80°C，待用。3.定量标准品产物的PCR扩增
使用TaKaRa公司生产的I^remix Taq PCR反应液进行PCR扩增铜绿微囊藻噬藻体g91基因上491bp序列构建铜绿微囊藻噬藻体定量PCR检测的标准品。反应条件和程序设置如表2和图1。
表2 SH-WF/SH-WR PCR反应条件
材料体积2XPremixTaq(TaKaRa)12. 5μ 1SH-WFPrimer(10u M)0. 5μ 1SH-WRPrimer(10 μ M)0. 5μ 1Template(sample)2. 0μ 1RnaseFreedH2O9. 5μ 1总计25 μ 1
4. PCR产物检测和纯化
PCR扩增所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(1).将1.5%琼脂糖凝胶加热溶化均勻，冷却到60-70°C加EB至浓度0. 5 μ g/ml ； (2).倒入封好的凝胶槽，厚度约3_5mm，在距底板0. 5 lmm的位置放置样品梳；C3).待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶2mm位置；(4). IOul SH-ffF/SH-ffR PCR产物加1/5体积的上样缓冲液，混勻，取10 μ 1加入凝胶点样孔中，同时加入分子量标准物Trans2K 4 μ 1 ； (5).电压< lOV/cm，电泳至溴酚兰移出样品槽到凝胶板的2/3距离时，关闭电源；(6).取出凝胶块，置紫外-可见凝胶成像系统(HoeferMacrovueUvis-20)上观察，即可见桔红的DNA区带，并拍照。
PCR产物纯化使用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒SK1132 (Sangon)完成。具体操作过程严格遵照试剂盒说明进行(1).配制琼脂糖凝胶，将上述PCR产物点样，80伏电压电泳25分钟；(2).紫外灯下切下含有目的DNA琼脂糖胶块，放入新的1.5ml EP管中；(3).加入500ul结合缓冲液Binding Buffer,置于50 60°C水浴中10分钟，使胶彻底融化；(4).将融化的胶溶液转移到套放于收集管内的纯化柱中，室温放置2分钟后SOOOrpm离心1分钟；( .取下纯化柱，倒掉收集管中的废液，将纯化柱放入同一个收集管中，加入500 μ 1 Wash Solution (洗液)后，8000rpm室温离心1分钟；(6).重复步骤円|一次。(7).取下纯化柱，倒掉收集管中的废液，将纯化柱放入同一个收集管中，12，OOOrpm室温离心15秒；(8).将纯化柱放入一个新的1.5ml EP管中，在柱子膜中央加入30 μ 1洗脱缓冲液Elution Buffer 在 37°C放置 5-10 分钟；(9). 12，OOOrpm 室温离心 1 分钟，将 30 μ 1 DNA 溶液吸入纯化柱中心膜上12，OOOrpm室温离心2分钟，于4°C保存待与质粒连接。5. g91基因重组质粒的构建1).受体菌的培养
本发明所用克隆载体为PMD18-T Vector (TaKaRa)，受体菌为万.co/i JM109 (公司购买，ftOmegEi，USA)。从LB平板上挑取新活化的五coli J1109单菌落，接种于3_5ml LB液体培养基中，37°C下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37°C振荡培养2-3小时至OD600 = 0 . 5左右。2).感受态细胞的制备(CaCl2法)
a.将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4°C下3000g离心10分钟；b.弃去上清，用预冷的0. 05mol/L的CaCl2溶液IOml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，4°C下3000g离心10分钟；c.弃去上清，加入細1预冷含15%甘油的0. 05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；d.感受态细胞分装成200 μ 1的小份，部分贮存于4°C以供近期使用，部分贮存于-70°C以供较长时期内使用。3).纯化PCR产物的连接
使用PMD18-T Vector (TaKaRa)与纯化的SH-WF/SH-WR PCR产物进行连接反应，先用0. 2 ml PCR管将1. 0 μ 1 pMD18_T Vector和4· 0 μ 1 PCR纯化产物混合均勻，再加入5 μ 1Solution I (溶解液I)混合均勻，16°C连接过夜。4).连接产物的转化
a.取200 μ 1感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上；b.加入10 μ 1连接反应液轻轻摇勻，冰上放置30分钟后；c.42°C水浴中热击60秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟；d.向管中加入Iml SOC培养液(不含氨苄青霉素Amp)，混勻后37°C振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr) ； e.将上述菌液摇勻后取100 μ 1涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养16- 小时。同时做两个对照对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替d步骤中的菌液，其它操作与上面相同，此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现；对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替d步骤中的菌液，但涂板时只取5μ 1菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。5).阳性重组子的筛选和鉴定
a.挑取在Amp+选择培养基上长出的菌落若干(4-6个/样品)，置于Iml含有Amp的LB液体培养基中，于37°C振荡培养，并设置一个阴性对照，即挑取空菌落加入含Amp的ImlLB液体培养基中；b.待菌液有浑浊之后取2ul菌液利用引物进行阳性重组子的菌落PCR快速鉴定，PCR扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。6).阳性重组质粒的提取
使用质粒提取试剂盒Rapid Plasmid DNA Daily Mini-Prep Kit(V-gene)完成阳性重组质粒的提取，具体步骤如下ill.取扩大培养M小时的1 細1重组质粒菌液PCR阳性菌液，12，OOOrpm离心2分钟，弃上清。(2) ·用250 μ 1的Solution I (溶解液I)(含RNaseAl)充分悬浮细菌沉淀。131 .加入250 μ 1的Solution II (溶解液II)轻轻地上下翻转混合5 6次，使菌体充分裂解，形成透明液体。f4].加入400 μ 1的4°C预冷的SolutionIII (溶解液III))，轻轻地上下翻转混合5 6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。旧室温12，OOOrpm离心5分钟，取上清。IH.将试剂盒中的离心柱安置于收集管上。丨 ).将上述操作四中上清液转移至离心柱中12，OOOrpm离心1分钟，弃滤液。[8].将500 μ 1 Rinse A加入离心柱中，12，OOOrpm离心30秒，弃滤液。(9}.将700 μ 1 Rinse B加入离心柱Spin Column中，12，OOOrpm离心30秒，弃滤液。IlUl .重复操作步骤(9)。(II).将离心柱Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60 μ 1的Elution Buffer,室温静置1分钟。(123 · 12, OOOrpm离心1分钟洗脱重组质粒DNA,重复一次。7).质粒拷贝数的确定拷贝数的计算
a.将纯化好的质粒100倍稀释测量OD值，吸取2 μ 1纯化质粒，加入198 μ 1的双蒸水混合均勻，测量其OD值，OD260为0. 004。b.克隆质粒核苷酸片段长度计算公式
M (bp) =原质粒片段长度(bp) +插入片段长度(bp)克隆质粒分子量的计算X (MW)
lbp=330daltons ； X (MW) = M (bp) X330daltonsX2nt/bp质量浓度=0拟60 X 50 μ g/ml X稀释倍数(lbp=50 μ g/ml)摩尔浓度=质量浓度/ X (MW)
拷贝数/ μ 1=摩尔浓度X 6. 02 X 1023 (阿佛加德罗常数)8).质粒DNA梯度稀释
将已知拷贝数的重组阳性质粒用DEPC水(焦碳酸二乙酯水)按照10倍梯度稀释关系，g91 基因从 1 X IO8Copies/ μ LUX IO7Copies/ μ LUX IO6Copies/ μ LUX IO5Copies/ μ L、1 X IO4Copies/ μ L拷贝数浓度用DEPC水进行10倍系列稀释，得到不同分子含量的PMD-18TCD81阳性质粒浓度样品，保存于-80°C作为铜绿微囊藻噬藻体定量检测的外参标准品，在荧光定量PCR时，需要检测的样品与外参标准品进行比较，从而得出要检测的样品的拷贝数。6.定量PCR反应条件
使用TaKaRa (宝生物工程公司)的STOR Premix Ex Taq定量PCR反应液，在荧光定量PCR仪ABI PRISM 7300 Real-Time PCR System测定定量标准曲线和产物融解曲线分析，从而得到样品的拷贝数和熔解温度。使用SH-RTF/SH-RTR引物特异扩增铜绿微藻噬藻体尾鞘蛋白编码基因(g91)上656bp到791bp之间的一段长为的DNA序列。结合引物本身特性和实验结果，确定具体反应条件和程序(见表3和图2)。表3 SH-RTF/SH-RTR 反应条件
权利要求
1.水体环境中铜绿微囊藻噬藻体的STOR-Green荧光定量RT-PCR检测方法，包括下列步骤(1)基于铜绿微囊藻噬藻体Ma-LMMOl的g91基因片段，利用引物设计软件设计定量外参标准品引物SH-WF/ SH-WR和定量PCR引物SH-RTF/SH-RTR SH-WF :5’ -CTACCAGTGGCCGATATTTCCTT-3’SH-WR :5’ -GGTAAAGCCTCTATTAGCAGTGTTG-3’SH-RTF :5’ -ACATCAGCGTTCGTTTCGG-3’SH-RTR :5’ -GTGACAATCTGGTTAGGTAGGTCG-3’ ；(2)提取待检水样浓缩液中噬藻体DNA基因片段；(3)用定量外参标准品引物SH-WF:5，-CTACCAGTGGCCGATATTTCCTT-3，和 SH-WR5，-GGTAAAGCCTCTATTAGCAGTGTTG-3 ’扩增并构建铜绿微囊藻噬藻体g91基因定量检测的外参标准品，根据标准品Ct值，得到g91基因定量标准曲线；(4)用定量PCR 引物 SH-RTF :5’ -ACATCAGCGTTCGTTTCGG-3，禾口SH-RTR :5，-GTGACAATCTGGTTAGGTAGGTCG-3，扩增待测样品中铜绿微囊藻噬藻体g91基因序列，将所测样品的Ct值与g91基因定量标准曲线对比得到检测水样中噬藻体g91基因拷贝数量。
全文摘要
本发明公开了一种水体环境中铜绿微囊藻噬藻体的SYBR-Green荧光定量RT-PCR检测方法，属于分子生物学领域。本发明基于铜绿微囊藻噬藻体Ma-LMM01的尾鞘蛋白基因g91片段，利用Premier5.0和Oligo6软件设计了定量PCR外参标准品引物SH-WF和SH-WR和定量PCR引物SH-RTF和SH-RTR，对水体环境中铜绿微囊藻噬藻体数量进行检测，旨在分析水体中铜绿微囊藻噬藻体的数量随时间、空间变化规律。
文档编号C12Q1/68GK102382901SQ20111020642
公开日2012年3月21日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者冯悦, 刘丽, 刘腾腾, 向安, 夏雪山, 魏大巧 申请人:昆明理工大学