专利名称：一种分泌结晶型纤维素的蓝藻工程菌及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌结晶型纤维素的蓝藻工程菌及其制备方法和应用。
背景技术：
细菌纤维素近几十年来一直是国内外生物材料领域研究的热点。英国科学家 Brown早在1886年就发现静置培养的木醋杆菌培养基表面有一层片状的纤维素物质漂浮。随着研究的逐渐深入，人们发现这种纤维素物质具备高度有序的晶体排列结构(X射线衍射结果证实这种纤维素的结晶型为I型)，高物理强度，高吸水性等特质。所以人们逐渐将此种细菌纤维素工厂化生产，进而用于生产乙醇，用于制造人造皮肤，高质量的膜类物质 (如音响振动膜)，以及食品添加剂等等。但是木醋杆菌的培养成本极其昂贵，而且其生长过程中产生的各种次级代谢物，使培养废弃物的排放对环境产生严重污染，因此大规模的生产培养始终受限。菌种的改良工作一直在世界各国进行。蓝藻作为一种能够光合自养的微生物，其低廉的培养成本，高效的生长速率以及特殊的细胞结构，为其作为产生纤维素的工程菌提供了很大潜力。木醋杆菌分泌结晶型纤维素的能力与蓝藻光合作用的特性可以进行有机的结合。
发明内容
本发明旨在提供一种分泌结晶型纤维素、培养成本低的蓝藻工程菌。本发明提供的技术方案如下一种蓝藻工程菌，其特征在于，所述蓝藻工程菌为cesA基因(SEQ ID N0:1)缺失的蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002突变体；该突变体的基因组上整合并表达木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582的包括7个连续的纤维素合成相关基因 cmcase (SEQ ID NO :4)、ccp (SEQ ID NO :5)、acsA (SEQ ID NO :6)、acsB (SEQ ID NO :7)、 acsC(SEQ ID NO :8)、acsD (SEQ ID NO :9)、bglxA (SEQ ID NO :10)在内的基因组片段 CG27 ;所述基因组片段CG27的长度为100392bp，起始序列为SEQ ID NO 12，终止序列为 SEQID NO :13ο上述蓝藻工程菌的制备方法，包括如下步骤1)将蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002 自身的纤维素合成基因 cesA (SEQ ID NO 1)敲除或破坏，得到蓝藻突变体；2)构建BAC载体，所述载体上连入红霉素抗性基因(Em)以及1段与蓝藻 (Synechococcus sp.) PCC 7002的基因组同源的1. 2kb大小的DNA区域，是图4中的 Homologous Region(SEQ ID NO :11)；3)将木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 5；3582 基因组中包括连续 7 个纤维素合成相关基因 cmcase (SEQ ID NO 4)、ccp (SEQ ID NO 5)、acsA(SEQ ID NO 6)、 acsB(SEQ ID NO :7)、acsC (SEQ ID NO :8)、acsD (SEQ ID NO 9)和 bglxA(SEQ ID NO :10)在内的基因组片段CG27构建在步骤2)所述BAC载体上(图4)；所述基因组片段CG27的长度为100392bp，起始序列为SEQ ID NO 12，终止序列为SEQ ID NO 13 ；4)将上一步得到的BAC载体转化至步骤1)产生的蓝藻突变体中，即得到了所需的
蓝藻工程菌。上述步骤1)中，用同源双交换的方法敲除所述蓝藻的cesA基因。一种生产结晶型纤维素的方法，其特征在于，包括如下步骤a)用上面所述的方法制备出蓝藻工程菌；b)将所得的蓝藻工程菌培养在A+培养基中约1周时间，使蓝藻工程菌生长到OD 值达到1. 0 2. 0 ；c)将所述蓝藻工程菌离心富集，转移到适合于蓝藻生长的淡水培养基BGll中约2 周；d)从所述蓝藻工程菌提取纤维素。e)经过X射线衍射检测，此纤维素与木醋杆菌纤维素都为结晶良好的I型。在所述A+培养基和BGll培养基的培养过程中始终进行吹气培养，气体成分为空气占98% 99%，CO2占1 % 2% ；培养过程始终保证温度25°C ，光照强度30 μ E/ m2s 300μ E/m2s。本发明还提供蓝藻工程菌在生产纤维素方面的应用。该纤维素可以用于生产乙醇，进而用作生物能源。同时，本发明生产的纤维素具有良好的结晶型，有更加广泛的应用领域，可以用于生产人造皮肤，用于生产高质量的膜材料，用于制造食品添加剂等。经检测， 野生型蓝藻Synechococcus sp. PCC 7002的纤维素含量占细胞壁干重的质量百分比约为 2%，而本发明构建的蓝藻工程菌，纤维素含量可以达到自身细胞壁干重的约7%，同时，该蓝藻工程菌生产纤维素的生长周期短(总共约3周时间)，而且不存在木材中的木质素的污染问题，其提取和纯化过程可以大大简化，并且对环境的污染程度也可以相应的大大减少， 是一种理想的生产纤维素的生物工程菌。所述纤维素用于生产醇，进而用作生物能源。同时，经过X射线衍射检测发现，此种纤维素结晶型良好，为I型，为日后更广泛的应用打下了 ■石出。
图 1 (a)野生型 Synechococcus sp. PCC 7002 ； (b)Synechococcus sp. PCC 7002cesA缺失突变体。图 2 (a)野生型 Synechococcus sp. PCC 7002 ； (b) Synechococcus sp. PCC 7002 蓝
藻工程菌。图3实施例的蓝藻工程菌纤维素X射线衍射图与木醋杆菌(GluconacetcAacter xylinum)ATCC 53582的X射线衍射图对比。其中三个箭头的指向分别表示结晶型纤维素的 3个典型衍射峰。图4本发明构建的BAC载体质粒图。
具体实施例方式1.首先，通过生物学中常用的“同源双交换”的方法将蓝藻Synechococcus sp. PCC7002自身的纤维素合成基因cesA(SEQ ID NO 1)敲除(同源双交换，也就是在需要敲除的目的基因5，和3，两端各选取一段长度适宜的DNA片段，一般从400bp至31Λ均可。在这两个片段的中间连入一个卡那霉素抗性基因，再将连好的这三个片段一同插入一个无法在蓝藻中复制的载体上，将载体转入蓝藻，在卡那霉素的筛选作用下迫使蓝藻基因组上产生同源双交换，使目的基因被抗生素基因所替代，从而达到目的基因的敲除。基因敲除后，原先的cesA基因缺失，而完全被卡那霉素抗性基因所替代。此外，采用将卡那霉素抗性基因插入cesA，而非将此基因完全敲除的方法，同样也可以使这个基因失去功能。本实验采用同源双交换，选取了 cesA基因上下游各11Λ的片段作为同源交换区，上游片段序列见SEQ ID NO :2，下游片段序列见SEQ ID N0:3)，cesA基因的功能丧失导致蓝藻细胞壁中起到结构交联作用的纤维素成分减少，通过超薄切片透射电子显微镜，能够观察到蓝藻Synechococcus sp. PCC 7002自身cesA缺失突变体的细胞壁肽聚糖层被严重破坏。若将此突变体培养在低盐浓度的BGll淡水培养基中，通过扫描电子显微镜能够观察到其细胞拉长，同时细胞表面凹凸不平，说明此突变体的细胞壁已经十分脆弱(见图1，(a)野生型Synechococcus sp. PCC 7002，细胞有较为规整的结构和平滑的表面；(b) Synechococcus sp. PCC 7002cesA 缺失突变体，细胞有拉长，变小等形态变化，表面也极其凹凸不平)。2.接下来，将木醋杆菌 Gluconacetobacter xylinum ATCC 5；3582 基因组中的包括连续 7 个纤维素合成相关基因 cmcase(SEQ ID NO :4)，ccp (SEQ ID NO :5)，acsA (SEQ ID NO 6)，acsB(SEQ ID NO 7)，acsC(SEQ ID NO 8)，acsD(SEQ ID NO 9)，bglxA(SEQ IDNO 10)在内的100392bp基因组片段(该片段以SEQ ID NO 12起始，以SEQ ID NO 13终止， 本发明中，把该片段记作CG27)通过构建BAC文库的方法连接到BAC载体上，BAC载体此前已经过了特殊改造(BAC载体的构建起始于一个无法在蓝藻Synechococcus sp. PCC7002 中自主复制的普通BAC质粒，随后在其上连接了 1段与Synechococcus sp. PCC 7002自身基因组同源的1.2kb大小的DNA区域，是图4中的Homologous Region (SEQ ID NO :11)以及一个红霉素抗性基因与其自身启动子。通过同源单交换作用，包括7个纤维素合成相关基因在内的100392bp木醋杆菌的基因组片段，以及Em抗性基因都会被整合至蓝藻基因组上，使得外源引入的基因得以表达。将此特定BAC质粒转化至自身cesA基因缺失的蓝藻 Synechococcus sp. PCC 7002突变体，从而得到蓝藻工程菌。将此工程菌培养在A+培养基中，使藻体生长到OD值为1.0 2.0(培养基中加入终浓度100yg/ml的卡那霉素和终浓度25yg/ml的红霉素作为选择性压力，生长温度范围可以从25°C 35°C，光照强度可以从 30 μ E/m2s 300 μ E/m2s,培养过程中始终吹气培养，气体成分为空气占98% 99%，CO2占
2%)。此时，部分藻体已经具有了纤维素的少量分泌。培养时间大约需要1周左右。3.最后，把在A+培养基中生长了 1周的蓝藻工程菌离心收集(离心时采用无菌的离心杯，转数为5，000 6，OOOrpm)，再转移到淡水培养基BGll中继续培养(BG11加入终浓度4 μ g/L左右的VB12,同时加入终浓度100 μ g/ml的卡那霉素和终浓度25 μ g/ml的红霉素作为选择性压力，生长温度范围可以从25°C 35°C，光照强度可以从30 μ E/m2s 300 μ E/m2s,培养过程中始终吹气培养，气体成分为空气占98 % 99 %，CO2占1 % 2 % )。 淡水培养基中的低盐环境导致细胞壁因为渗透压的改变而变脆弱，进一步刺激了纤维素的分泌。又经过大约2周时间，几乎所有藻体的表面都有纤维素的包裹以及穿透。由于纤维素大量分泌对蓝藻本身的生长产生了影响，所以两周后蓝藻细胞会由绿色变为白色。这是纤维素大量分泌的体现(图2，(a)野生型Synechococcus sp. PCC 7002，细胞表面平滑，没有纤维素的分泌；(b) Synechococcus sp. PCC 7002蓝藻工程菌，大量纤维素穿透并包裹了细胞体)。4.纤维素结晶型的检测以及含量的测定采用X射线衍射的方法来检测蓝藻工程菌分泌的纤维素类型。经过测定，蓝藻工程菌产生的纤维素与木醋杆菌的纤维素均为结晶良好的I型。两种纤维素的X射线衍射图如图3。随后使用生化中经典的“硫酸蒽酮法”检测纤维素的含量。具体步骤为，首先称取5mg左右已经提取完成的Synechococcus sp. PCC 7002野生型和本发明构造的纤维素工程菌细胞壁材料(干重而非湿重)，用72%的硫酸1. 5ml在室温将细胞壁中的纤维素降解 2小时，使纤维素充分变为葡萄糖。离心将杂质沉淀后分别取上清液500 μ L。然后分别配制10，20，30，40，50，60，100 μ g/ μ L的葡萄糖溶液用于做标准曲线，每种浓度的溶液各取样500yL。所有样品中各加入Iml新鲜配制的硫酸蒽酮溶液(即纯硫酸中加入0.2%的蒽酮)，沸水浴15分钟，冰上冷却10分钟，室温放置10分钟，然后用紫外分光光度计测定在 620nm波长处的紫外吸收值，通过标准曲线可以推算出目标样品中的葡萄糖含量，也就是纤维素的含量，由此计算出纤维素占细胞壁的质量百分比。经过计算，野生型Synechococcus sp. PCC 7002纤维素约占细胞壁2%，而本发明的蓝藻工程菌纤维素含量约占细胞壁的7%左右(均为干重而非湿重)。5.培养基配方BGll培养基配方如下
NaNO31.5g
权利要求
1.一种分泌结晶型纤维素的蓝藻工程菌，其特征在于，所述蓝藻工程菌为cesA基因 (SEQ IDNO :1)缺失的蓝藻(Synechococcus sp. )PCC 7002突变体；该突变体的基因组上整合并表达木醋杆菌(GluconacetcAacter xylinum)ATCC 53582的包括7个连续的纤维素合成相关基因 cmcase(SEQ ID NO :4)、ccp (SEQ ID NO :5)、acsA(SEQ ID NO :6)、acsB (SEQ ID NO :7)、acsC(SEQ ID NO :8)、acsD (SEQ ID NO :9)、bglxA (SEQ ID NO :10)在内的基因组片段 CG27 ；所述基因组片段CG27的长度为100392bp，起始序列为SEQ ID N0:12，终止序列为 SEQID NO :13ο
2.一种分泌结晶型纤维素的蓝藻工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1)将蓝藻(Synechococcussp. )PCC 7002 自身的纤维素合成基因 cesA (SEQ ID NO 1) 敲除或破坏，得到蓝藻突变体；2)构建BAC载体，所述载体上连入红霉素抗性基因(Em)以及1段与蓝藻 (Synechococcussp.) PCC 7002 的基因组同源的 1. 2kb 大小的 DNA 区域，是 Homologous Region(SEQID NO :11)3)将木醋杆菌(Gluconacetobacterxylinum)ATCC 5；3582基因组中包括连续7个纤维素合成相关基因 cmcase(SEQ ID NO :4)、ccp (SEQ ID NO :5)、acsA (SEQ ID NO :6)、acsB (SEQ ID NO :7)、acsC(SEQ ID NO :8)、acsD (SEQ ID NO :9)和 bglxA(SEQ ID NO :10)在内的基因组片段CG27构建在步骤幻所述BAC载体上；所述基因组片段CG27的长度为100392bp，起始序列为SEQ ID NO 12，终止序列为SEQ ID NO 13 ；4)将上一步得到的BAC载体转化至步骤1)产生的蓝藻突变体中，即得到了所需的蓝藻工程菌。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，用同源双交换的方法敲除所述蓝藻的cesA基因。
4.一种生产结晶型纤维素的方法，其特征在于，包括如下步骤a)用权利要求2所述的方法制备出蓝藻工程菌；b)将所得的蓝藻工程菌培养在A+培养基中约1周时间，使蓝藻工程菌生长到OD值达到 1. O 2. O ；c)将所述蓝藻工程菌离心富集，转移到适合于蓝藻生长的淡水培养基BGll中约2周；d)从所述蓝藻工程菌提取纤维素。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述A+培养基和BGl1培养基的培养过程中始终进行吹气培养，气体成分为空气占98% 99%，CO2占 2% ；培养过程始终保证温度25°C 35°C，光照强度30 μ E/m2s 300 μ E/m2s。
6.权利要求1所述蓝藻工程菌在生产纤维素方面的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述纤维素用于生产乙醇，进而用作生物能源。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述纤维素用于生产膜材料。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述纤维素用于用于生产人造皮肤或制造食品添加剂。
全文摘要
本发明公布了一种分泌结晶型纤维素的蓝藻工程菌及其制备方法和应用。所述蓝藻工程菌为cesA基因缺失的蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002突变体；该突变体的基因组上整合有包含木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582的7个纤维素合成相关基因cmcase、ccp、acsA、acsB、acsC、acsD、bg1xA在内的长度100392bp的基因组片段。所述蓝藻工程菌的纤维素含量达到自身细胞壁干重的约7％，是一种理想的生产结晶型纤维素的生物工程菌。该结晶型纤维素除了用于生产乙醇而用作生物能源之外，经过X射线衍射检测，发现此种纤维素结晶型良好，为I型，因此还可以用于生产人造皮肤，用于生产高质量的膜材料，以及用于制造食品添加剂等。
文档编号A23L1/30GK102250774SQ20111020749
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者赵进东, 赵驰 申请人:北京大学