专利名称：一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法
技术领域：
本发明属于免疫球蛋白制备领域，具体涉及一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，该方法将τ细胞、B细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。
背景技术：
单克隆抗体制药是目前生物制药中发展最为迅速的生物技术领域。目前单抗药物研发生产大致分为3类1)动物(包括人源化小鼠)直接免疫法；2)基因文库筛选，包括噬菌体文库及酵母菌表达文库，等等；3)，其它生物学方法。但是这些方法很难生产出纯人源化的，高附着力的单抗药物。抗体是由哺乳动物B细胞生成的一类蛋白，能够特异性的识别抗原，被称为“生物导弹”。具有单一抗原识别特性的抗体被称为单克隆抗体(简称单抗)。单抗技术发明于上个世纪70年代，单抗制药起始于上个世纪80年代。单抗技术的基础是免疫鼠类动物获取单克隆细胞株，获得的抗体为鼠源抗体。但是，鼠源蛋白不适合作为人类药物，因此就催生了人源化小鼠技术。但是，免疫人源化小鼠产生的是人-鼠合型抗体，作为人类药物仍然有其局限性。怎样生产纯人源的单抗药物是生物制药的新的挑战。人体主要免疫细胞分为T及B细胞，B细胞负责生产单抗蛋白，T细胞负责提供 B细胞生长发育所需要的信号及细胞生长因子。体外培养并直接刺激免疫细胞生产单抗产物的概念最早在 1990年就有报道(In vitro immunization of human B lymphocytes with cultured melanoma cells (SK-MEL 28) Zhang XM, Borrebaeck CA, Human Antibodies Hybridomas. 1990; 1(1): 42_6)。其试验设计的主体可以简单总结为体外混合培养T及B 细胞并导入抗原。该类试验的一个无法回避的难题是大多数的免疫细胞(B细胞)会在大约 2周时间内死亡，以至于试验无法进行下去。一个折中的解决方法是用EBV病毒来改造并转化免疫细胞，以避免细胞死亡。然而，EBV病毒的导入，属于生物污染高危过程，其产生的危害远远大于其正面效果；仅能进行科学实验探索，并不可能应用于生物制药。总体来说，该类试验成功率非常低，几乎不具备可操作性。因此，医药行业需要一种产率高、无生物污染、 操作简单的技术制备纯人源单克隆抗体细胞株，再生产出纯人源单克隆抗体。
发明内容
本发明提供一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，该方法将T细胞、B 细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。本发明是通过以下技术方案实现的
一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，将T细胞、B细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。
该方法包括以下阶段
A、第一阶段细胞体外混合培养及刺激
a.筛选注射过乙肝疫苗的健康自愿献血者，采集对乙肝疫苗呈免疫阳性反应的健康自愿献血者的血液样品进行分离提纯处理，得到人体⑶-4 T细胞；
b.将所述的人体CD-4T细胞用乙肝疫苗抗原短肽进行激活反应，得到激活的人体 CD-4 T细胞；
c.对与A-a步骤中同一乙肝疫苗免疫阳性反应的健康自愿献血者的血液样品进行分离提纯处理，得到人体B细胞；
d.对离体的人体淋巴结样品进行分离提纯处理，得到人体淋巴结内皮细胞；
e.将所述的激活的人体CD-4T细胞、人体B细胞、人体淋巴结内皮细胞稀释为混合细胞悬液，进行混合培养，并在培养过程中加入抗原进行刺激，得到成熟、增殖的细胞；
所述的混合培养的时间为3周； 所述的刺激的方法为
将所述的混合细胞悬液按8 mL/每孔的量加入到6孔细胞培养盘内，再加入最终浓度为50-1000 ng/mL的乙肝表面抗原HBsAg ；
所述的刺激的时机为在所述的混合培养的第1天进行第一次刺激；在所述的混合培养的第8天进行第二次刺激；
所述的混合细胞悬液中，所述的激活人体的CD-4 T细胞、人体B细胞、人体淋巴结内皮细胞的终浓度之比为5:20:0.1;
B、第二阶段细胞融合
将所述的成熟、增殖的细胞与人用杂交骨髓瘤细胞进行融合处理，得到融合杂交瘤细胞；所述的融合处理采用聚乙二醇诱导； e 融合后培养
在所述的融合细胞悬浮液于37°C进行细胞培养的第二天，将培养液换为HT-RPMI1640 培养液，继续进行细胞培养； f 特异性筛选
在所述的融合细胞悬浮液于37°C进行细胞培养2-3周，选取培养盘的细胞孔中的上清液进行酶联免疫吸附法筛选，检测该上清液中IgG及IgM浓度；选择IgG浓度高的细胞孔，进行特异性筛选；所述的特异性筛选得到阳性结果的融合细胞即为杂交瘤细胞；将所述的杂交瘤细胞进行大量扩增；
C、第三阶段单克隆化
将上述扩增的杂交瘤细胞进行单克隆化，得到单克隆细胞株；所述的单克隆化的方法为限制性梯度稀释；
D、第四阶段阳性克隆验证
在所述的单克隆细胞株于37°C进行细胞培养2-3周后，此时选取培养盘的细胞孔中的上清液进行酶联免疫吸附法筛选，检测培养液中IgG及IgM浓度；选择IgG浓度高的细胞孔，进行特异性筛选，得到阳性结果的即为抗原特异性的单克隆细胞株；3/8页
E、第五阶段单克隆抗体生产
将所述的抗原特异性的单克隆细胞株再进行扩增后，进行大规模单克隆抗体的生产， 再进行单克隆抗体的分离提纯处理，得到所述的纯人源单克隆抗体。
本发明相比现有技术具有如下有益效果
本发明采用的技术为混合细胞培养法，简单易行，操作方便，一步到位，筛选过程简单， 节省大量人力物力；
本发明单抗生产效率大大提高，融合细胞产生抗体的比例成倍增加； 本发明由于细胞在长达3周的培养期内有充分的条件进化成熟，因此本发明有更大的把握获得单抗药物的理想类型IgG ；本发明的大多数的克隆成功的实现了从IgM到IgG的类型转化，生产IgG型单抗几率大大提高；
本发明中由于B细胞在刺激及分化，成熟时有良好的环境，有可能在仅仅一个试验周期内获得若干高附着力单抗产物；
本发明在一个体外培养周期即可生产抗多种抗原的单抗药物，研发效率可以成倍增
加；
本发明可以直接研制100%的纯人源化的单抗产物，不必通过复杂的手段进行转化处理。
图1 实施例1的B-f步骤中，酶联免疫吸附法(ELISA)测定的所述的培养盘的细胞孔中的上清液中的IgG含量。
具体实施例方式实施例1
本实施例为混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体细胞株的方法，所述的纯人源单克隆抗体为乙肝抗体。该方法包括以下阶段细胞体外混合培养及刺激、细胞融合、单克隆化、特异性验证及单克隆抗体生产；
A、第一阶段细胞体外混合培养及刺激
a.筛选注射过乙肝疫苗的健康自愿献血者，采集对乙肝疫苗呈免疫阳性反应的健康自愿献血者的血液样品进行分离提纯处理，得到人体⑶-4 T细胞；
所述的分离提纯采用免疫磁珠分选法，选用CD-4磁珠单抗，所述的CD-4磁珠单抗购自 Miltenyi 公司、BD Biosciences 公司、或 Stem cell technologies 公司；分选的详细步骤参见产品说明；
b.将所述的人体CD-4T细胞用乙肝疫苗抗原短肽进行激活反应，得到激活的人体 CD-4 T细胞；
所述的乙肝疫苗抗原短肽为preSl 20-47aa，氨基酸序列为WSPQAQGMLKTLPADPPPAST VRQSGRQ；所述的preSl 20_47aa由中科亚光或其他公司合成；所述的激活反应的步骤为
将所述的人体⑶-4 T细胞均勻分散在RPMI1640培养液中，达到2 XlO6细胞/毫升的终浓度，得到细胞悬浮液；在所述的细胞悬浮液中加入终浓度为 1 Lig JilL的乙肝疫苗抗原短肽、以及浓度为0. 75-50ng/L、优选为10 ng/mL的白细胞介素-2 (IL-2)，得到悬浮液A ；再将悬浮液A中的人体⑶-4 T细胞进行培养；所述的培养在 CO2细胞培养箱中进行，培养时间为72小时，温度为37 ;上述悬浮液A中的人体CD-4 T细胞按8 -IOmL/孔的量，加入到6孔细胞培养盘中，再放入培养箱；
c.对与A-a步骤中同一乙肝疫苗免疫阳性反应的健康自愿献血者的血液样品进行分离提纯处理，得到人体B细胞；
所述的分离提纯采用免疫磁珠分选法，选CD-20磁珠单抗，所述的CD-20磁珠单抗购自Miltenyi公司或BD Biosciences公司等，分选的详细步骤参见产品说明；
d.对离体的人体淋巴结样品进行分离提纯处理，得到人体淋巴结内皮细胞 (简称FDC)；
所述的离体的人体淋巴结样品来源于新鲜搜集的手术切除的人扁桃腺产物将所述的人扁桃腺产物用医用无菌生理盐水清洗，切碎，研磨，过滤除去结缔组织残渣，得到所述的离体的人体淋巴结样品；
将所述的人体淋巴结样品用RPMI1640培养液均勻混合成单细胞悬浮液，再进行分离提纯处理，得到所述的人体淋巴结内皮细胞；
所述的分离提纯采用免疫磁珠分选法，选FDCl磁珠单抗，所述的FDCl磁珠单抗购自 Miltenyi公司、BD Biosciences公司，或者其他供应商，分选的详细步骤参见产品说明；
e.将所述的激活的人体CD-4T细胞、人体B细胞、人体淋巴结内皮细胞稀释为混合细胞悬液，进行混合培养，并在培养过程中加入抗原进行刺激，得到成熟、增殖的细胞；
所述的混合培养的时间为3周；
在所述的混合培养中，将所述的激活的人体CD-4 T细胞、人体B细胞、人体淋巴结内皮细胞用RPMI1640培养液进行稀释处理，得到混合细胞悬液；所述的混合细胞悬液中，所述的激活的人体CD-4 T细胞、人体B细胞、人体巴结内皮细胞的终浓度之比为5 20 0. 1 ；激活的人体⑶-4 T细胞的终浓度为0.5 X IO6细胞/毫升，人体B细胞的终浓度为2X IO6 细胞/毫升，人体淋巴结内皮细胞的终浓度为1 X IO4细胞/毫升； 所述的刺激的方法为
将所述的混合细胞悬液按8 mL/每孔的量加入到6孔细胞培养盘内，再加入最终浓度为50-1000 ng/mL，优选为500 ng/mL的乙肝表面抗原HBsAg ；所述的刺激的时机为在所述的混合培养的第1天进行第一次刺激；在所述的混合培养的第8天进行第二次刺激；
所述的混合培养时间为3周，每周换一次培养液；换培养液的方式为将所述的6孔细胞培养盘中的细胞孔中的上清液转移出3-5ml，优选为4mL，再轻轻加入等量的新鲜的 RPMI1640细胞培养液，注意不要搅动细胞； B、第二阶段细胞融合
将所述的成熟、增殖的细胞与人用杂交骨髓瘤细胞进行融合处理，得到融合杂交瘤细胞；所述的融合处理采用聚乙二醇诱导；
所述的融合杂交瘤细胞具有正常B细胞分泌抗体的功能，也具有癌细胞无限制分裂繁殖的特性；
所述的融合处理的方法为
a.人用杂交骨髓瘤细胞准备
在融合处理开始前6-8天，从液氮或者干冰中取出所述的人用杂交骨髓瘤细胞进行融冻处理，再进行扩增，得到大量新鲜扩增的融合用的人用杂交骨髓瘤细胞；
所述的扩增处理的培养液为RPMI1640培养液；所述的扩增处理第1-2天，在T-25培养瓶中复苏细胞，3天后将复苏的细胞转移至T-75培养瓶内培养；培养至对数生长期，镜检细胞密度为40%-60% ；在细胞培养期结束后，直接以RPMI1640培养液洗细胞3次，进行细胞计数，密度为5-10 X IO6细胞/毫升；
在所述扩增的处理中，进行离心处理时，转速优选为不超过300g或1000RPM，时间为5 分钟，温度为室温；随时在显微镜下镜检；
所述的T-25，T-75培养瓶市面如Corning公司等有售，使用见产品说明；所述的人用杂交骨髓瘤细胞(K6H6/B5)购自美国菌种保藏中心(ATCC)；
b.聚乙二醇(PEG，polyethyleneglycol)溶液准备将浓度为50%聚乙二醇溶液预热至37°C，得到预热的聚乙二醇溶液；
c.待融合细胞的准备将所述的成熟、增殖的细胞和融合用的人用杂交骨髓瘤细胞按数量比1:1混合，进行离心处理，弃上清液，保留沉淀；再用RPMI1640培养液将所述的沉淀中的细胞团打散，得到待融合细胞悬液，于37°C进行细胞培养；所述的离心处理中，转速为 1000RPM,时间为5分钟，温度为室温；所述的离心处理采用50ml离心管；每次融合处理的用量为一个T-75培养瓶中的所述的融合用的人用杂交骨髓瘤细胞；
d.细胞融合
在步骤B-c中开始细胞培养的2分钟内，向所述的待融合细胞悬液中加入0. 7-lml所述的预热的聚乙二醇溶液，要逐滴加入，边加入边混勻；再在接下来的2分钟内加入2ml预热的聚乙二醇溶液；再在接下来的2分钟内缓缓加入8 mL预热的聚乙二醇溶液，得到初步融合的细胞；若在接下来的1小时后镜检看不到大量融合細胞，则证明细胞融合可能已经失败；
将所述的初步融合的细胞进行离心处理，弃上清液，保留沉淀；向所述的沉淀中加入 30ml HAT-RPMI培养液，得到融合细胞悬浮液；所述的离心处理中，转速为1000RPM，时间为 5分钟，温度为室温；此步骤中，离心力不可过大，以免把刚融合的脆弱的细胞压实；若无法轻易而均勻地把融合細胞悬浮，证明细胞融合可能已经失败；
所述的HAT-RPMI培养液的配方为在RPMI1640培养液的基础上，添加20% FCS,5% GlutamineU :100倍稀释的100X的浓缩青链霉素混合液、以及1 100倍稀释的100X的浓缩HAT液；以上所有的试剂均为细胞培养专用的产品购自hvitrogen公司。
将所述的融合细胞悬浮液于37°C进行细胞培养；30分钟后，将所述的融合细胞悬浮液分装至细胞培养盘，继续于37°C进行细胞培养；所述的细胞培养盘为96孔平底细胞培养盘，每孔中加入50-100 μ 1 (3-4滴)所述的融合细胞悬浮液； e 融合后培养
在所述的融合细胞悬浮液于37°C进行细胞培养的第二天，将培养液换为HT-RPMI1640 培养液，继续进行细胞培养；所述的HT-RPMI培养液的配方为在RPMI1640培养液的基础上，添加20% FCS、5% GlutamineU :100倍稀释的100X的浓缩青链霉素混合液、以及1 :100倍稀释的100X的浓缩HT液；所有的成分均为细胞培养专用的产品购自hvitrogen公司。在操作的过程中，注意动作轻柔，不得搅动细胞，并不要把细胞培养盘在培养箱外面放置过久；
在所述的融合细胞悬浮液于37°C进行细胞培养的第二天或第三天进行镜检，可见大量细胞二聚体，约每孔25-50个，这是因为细胞融合后的第一次分裂；如不见大量细胞二聚体，证明细胞融合可能已经失败；
在所述的融合细胞悬浮液于37°C进行细胞培养的第三天后，大量细胞会迅速死亡，最后每孔只剩下1-2个稳定细胞群落；在所述的融合细胞悬浮液于37°C进行细胞培养的约一周内，镜检可见到细胞堆；在所述的融合细胞悬浮液于37°C进行细胞培养约2周以后，细胞培养液开始变黄，表明细胞开始分泌大量的抗体产物；
f 特异性筛选
在所述的融合细胞悬浮液于37°C进行细胞培养2-3周，优选为2周后，培养液颜色稍微变黄，此时选取25-50uL/孔的培养盘的细胞孔中的上清液进行酶联免疫吸附法(ELISA)筛选，检测该上清液中IgG及IgM浓度；选择IgG浓度高的细胞孔，进行特异性筛选；所述的特异性筛选得到阳性结果的融合细胞即为杂交瘤细胞；将所述的杂交瘤细胞移至M孔或6 孔细胞培养盘中进行大量扩增；
如图1所示，Y轴以OD值表示该上清液中IgG含量；X轴为步骤A-b中添加不同的IL-2 在细胞培养中的效果。如图所示，A、在不同的细胞类型组合试验中，只有多细胞(人体CD-4 T细胞(T)、人体B细胞(B)、人体淋巴内皮细胞(F))混合培养才能有效地产生大量的纯人源单克隆抗体；而其他培养方法，无论采用何种细胞组合，产生的纯人源单克隆抗体的产量极低。B、在培养液中添加一定浓度的白细胞介素-2 (IL-2)，有助于增强细胞活力，增加纯人源单克隆抗体的产量。所述的特异性筛选方法可以为蛋白免疫印记法(Western)、免疫沉淀反应法 (immunoprecipitation)、及酶联免疫吸附法(ELISA)，如果可以做成抗原在细胞表面稳定表达的细胞株(Cell-line)，则可以用流式细胞仪(FACS、BD等公司有售)利用抗原细胞表面表达细胞株来进行上清液中抗体的特异性筛选(具体方法见FACS使用说明)；
C、第三阶段单克隆化
将上述扩增的杂交瘤细胞进行单克隆化，得到单克隆细胞株；所述的单克隆化的方法为限制性梯度稀释；
所述的限制性梯度稀释的方法为将上述扩增的杂交瘤细胞进行细胞计数，然后将按 10，000细胞/mL稀释；再以此为基础，按照1:10比例，用10%的RPMI1640细胞培养液进行梯度系列稀释，具体浓度为1000细胞/mL，100细胞/mL，10细胞/mL，1细胞/mL和0.1 细胞/mL及0. 05细胞/mL ,0.01细胞/mL，每种浓度细胞制备20 mL ；
将上述每一种浓度的细胞按照200 μ 1/孔转移到平底96孔细胞培养盘中于37°C进行培养；培养3-4周，得到单克隆细胞株；此时，在显微镜下，单个孔中单个细胞经过多轮分裂增殖形成单个圆丘状的细胞堆；
D、第四阶段阳性克隆验证在所述的单克隆细胞株于37°C进行细胞培养2-3周后，优选为2周，此时选取25-50 ？ L/孔的培养盘的细胞孔中的上清液进行酶联免疫吸附法(ELISA)筛选，检测培养液中 IgG及IgM浓度；选择IgG浓度高的细胞孔，进行特异性筛选，得到阳性结果的即为抗原特异性的单克隆细胞株；
所述的特异性筛选方法可以为蛋白免疫印记法(Western)、免疫沉淀反应法 (immunoprecipitation)、及酶联免疫吸附法(ELISA)，如果可以做成抗原在细胞表面稳定表达的细胞株(Cell-line)，则可以用流式细胞仪(FACS、BD等公司有售)利用抗原细胞表面表达细胞株来进行上清液中抗体的特异性筛选(具体方法见FACS使用说明)；
也可以选择上述特异性筛选结果为阳性的单克隆细胞株进行抗体附着强度测试(采用 Bia Core仪器，具体方法参见仪器使用手册)，从多个阳性克隆中选出抗体产量高、附着力强的单克隆细胞株，用于生产单克隆抗体药物。 E、第五阶段单克隆抗体生产
将所述的抗原特异性的单克隆细胞株再进行扩增后，进行大规模单克隆抗体的生产， 再进行单克隆抗体的分离提纯处理，得到所述的纯人源单克隆抗体。以上扩增所述的抗原特异性的单克隆细胞株的方法为常规的细胞培养方法，具体操作步骤是
先将所述的抗原特异性的单克隆细胞株在T-25细胞培养瓶中生长，在细胞密度达到约60%时，转移到T-75细胞培养瓶中；大约2-3天后，将每瓶的细胞分装到5瓶T-75中，生长到2-3天细胞布满瓶之前，将细胞分装成5-10 X IO6细胞/管冷进行冻到液氮罐中； 以上扩增中的培养液为RPMI1640细胞培养液； 以上冷冻的方法为常规方法，具体操作步骤是
将所有的细胞用50cc的离心管进行离心处理分离出来，再用RPMI1640细胞培养液洗 3次，上述离心处理中，转速为1500RPM，时间为5分钟，温度为室温；再进行细胞计数；然后按照10 X IO6细胞/mL的浓度用冷冻液混勻，按5 -10 X IO6细胞/管在无菌条件下分装的1.5 ml或2 ml的细胞专用冷冻管中；再将上述所有的装有细胞的冷冻管放置在-20°C冰箱中过夜，然后将上述所有的装有细胞的冷冻管移到液氮罐中保存。需要时取出上述装有细胞的冷冻管进行所述的大规模单克隆抗体的生产。所述的大规模单克隆抗体的生产的步骤是
a.融冻
取出上述装有细胞的冷冻管放置在冰上，用70%酒精喷洒消毒； 再用手掌融冻或者将上述装有细胞的冷冻管放置在37°C水浴槽轻轻晃动1分钟，可以看到液体基本融化；
再将上述装有细胞的冷冻管进行离心处理，得到抗原特异性的单克隆细胞；所述的离心处理中，转速为1500RPM，时间为5分钟，温度为4°C ；
将所述的抗原特异性的单克隆细胞用37°C预热的RPMI1640细胞培养液洗细胞3遍； 上述洗细胞采用离心处理，转速为1500RPM，时间为5分钟；
b.培养
将上述RPMI1640细胞培养液洗过3遍的抗原特异性的单克隆细胞转移到一个T-25细胞培养瓶中，在37°C恢复培养2-3天；再将上述恢复培养后的抗原特异性的单克隆细胞转移到T-75细胞培养瓶中培养2-3 天，再转移到T-175细胞培养瓶中培养2-3天；
再进行细胞计数，并将经以上培养后的抗原特异性的单克隆细胞平分至5-10个T-175 细胞培养瓶中大量繁殖生长；
等上述T-175细胞培养液变成黄色，再将培养得到的抗原特异性的单克隆细胞离心分离，并弃之，并保留抗原特异性的单克隆细胞培养上清液。C.分离抗体
将所述的抗原特异性的单克隆细胞培养上清液移至4 保存；再分离提纯所述的抗原特异性的单克隆细胞培养上清液，得到所述的纯人源单克隆抗体。所述的分离提纯方法为常规方法，优选为蛋白A或者蛋白C颗粒层析柱法。如果条件许可，也可以使用快速蛋白液相色谱法(Fast protein liquid chromatography，简写为 FPLC)。本实施例中的各种试剂和设备均为市场常规产品，可以在市场购买得到。
权利要求
1.一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，其特征在于该方法将τ细胞、B 细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，其特征在于 所述的纯人源单克隆抗体为乙肝抗体。
3.根据权利要求1或2所述的生产纯人源单克隆抗体的方法，其特征在于该方法包括以下阶段A、第一阶段细胞体外混合培养及刺激a.筛选注射过乙肝疫苗的健康自愿献血者，采集对乙肝疫苗呈免疫阳性反应的健康自愿献血者的血液样品进行分离提纯处理，得到人体⑶-4 T细胞；b.将所述的人体CD-4T细胞用乙肝疫苗抗原短肽进行激活反应，得到激活的人体 CD-4 T细胞；c.对与A-a步骤中同一乙肝疫苗免疫阳性反应的健康自愿献血者的血液样品进行分离提纯处理，得到人体B细胞；d.对离体的人体淋巴结样品进行分离提纯处理，得到人体淋巴结内皮细胞；e.将所述的激活的人体CD-4T细胞、人体B细胞、人体淋巴结内皮细胞稀释为混合细胞悬液，进行混合培养，并在培养过程中加入抗原进行刺激，得到成熟、增殖的细胞；B、第二阶段细胞融合将所述的成熟、增殖的细胞与人用杂交骨髓瘤细胞进行融合处理，得到融合杂交瘤细胞；所述的融合处理采用聚乙二醇诱导；C、第三阶段单克隆化将上述扩增的杂交瘤细胞进行单克隆化，得到单克隆细胞株；所述的单克隆化的方法为限制性梯度稀释；D、第四阶段阳性克隆验证在所述的单克隆细胞株于37°C进行细胞培养2-3周后，此时选取培养盘的细胞孔中的上清液进行酶联免疫吸附法筛选，检测培养液中IgG及IgM浓度；选择IgG浓度高的细胞孔，进行特异性筛选，得到阳性结果的即为抗原特异性的单克隆细胞株；E、第五阶段单克隆抗体生产将所述的抗原特异性的单克隆细胞株再进行扩增后，进行大规模单克隆抗体的生产， 再进行单克隆抗体的分离提纯处理，得到所述的纯人源单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的生产纯人源单克隆抗体的方法，其特征在于步骤A-e所述的刺激的方法为将所述的混合细胞悬液加入到细胞培养盘内，再加入最终浓度为50-1000 ng/mL的乙肝表面抗原HBsAg。
5.根据权利要求3所述的生产纯人源单克隆抗体的方法，其特征在于步骤A-e所述的刺激的时机为在所述的混合培养的第1天进行第一次刺激；在所述的混合培养的第8天进行第二次刺激。
6.根据权利要求3所述的生产纯人源单克隆抗体的方法，其特征在于步骤A-e所述的混合细胞悬液中，所述的激活的人体CD-4 T细胞、人体B细胞、人体淋巴结内皮细胞的终浓度之比为5 20 0. 1。
全文摘要
本发明一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，该方法将T细胞、B细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。本发明采用的技术为混合细胞培养法，简单易行，操作方便，一步到位，筛选过程简单，节省大量人力物力；单抗生产效率大大提高，融合细胞产生抗体的比例成倍增加；本发明的大多数的克隆成功的实现了从IgM到IgG的类型转化，生产IgG型单抗几率大大提高。
文档编号C12N5/20GK102321720SQ20111021451
公开日2012年1月18日 申请日期2011年7月28日 优先权日2011年7月28日
发明者万晓春, 吴洪飞, 姚红 申请人:万晓春