专利名称：番茄溃疡病菌分子标准样品及其制备方法
技术领域：
本发明涉及番茄溃疡病菌分子标准样品，另外本发明还涉及其制备方法，属于植物检疫技术研究领域。
背景技术：
国内外关于动物病毒及食品微生物标准物质的报道甚多，而植物病原菌的标准物质研究则刚刚起步，很多问题都亟待解决。国内外植物病原菌检测时多购买美国菌种保藏中心(ATCC)的菌株作为阳性对照，其价格非常昂贵，国内几乎无法购买到，而植物病原菌分子检测的分子DNA标准物质鲜见相关研究报道，所以全面深入的研究解决植物病原菌检测DNA标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国植物检疫性病原菌检测分子 DNA标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供番茄溃疡病菌分子标准样品，均勻性和稳定性佳，另外本发明还提供其制备方法，工艺简单，易于操作。本发明番茄溃疡病菌分子标准样品，
番茄溃疡病菌分子标准样品的制备方法，具体步骤是
(1)番茄溃疡病菌菌株按常规细菌进行菌株活化、增菌培养，26°c培养24h；
(2)提取番茄溃疡病菌DNA，采用preman法提取DNA
①取新鲜培养的相应致病菌增菌液ImL于2mL离心管中；
②以13000r/min离心3min，吸弃上清；
③加入100μ L DNA提取液；
④震荡混勻后(没有细菌菌块)沸水浴lOmin，13000r/min离心;3min；
⑤取上清液到1.5mL离心管中保存于-20°C备用。(3)标准样品的制备
将测定浓度后的DNA按管进行分装，每种核酸分子标样分装150管，然后冻干，即为目的标准品。本发明制得的标准样品进行定性分析实验，具体是取制备的核酸标准样品， 加入50μ1ΤΕ，溶解后作为模板使用，经采用特异性进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品。例
正向弓I物5' -tcattggtcaattctgtctccc-3’ 反向弓I物5，-tactgagatgtttcacttcccc-3， PCR扩增PCR扩增釆用25 μ L体系，如下
权利要求
1.番茄溃疡病菌分子标准样品，其特征在于以分离的番茄溃疡病菌菌株为原料提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到番茄溃疡病菌的分子标准品，其具有下述的理化性质 (1)形状纯白色粉末状；(2)每管的含量5士0. 0016Pg ;(3)DNA纯度:0D260/280=1. 7 2 ；(4)易溶于水，或TE (Tris-EDTA)缓冲液中。
2.根据权利要求1所述的番茄溃疡病菌分子标准样品，其特征在于DNA纯度 0D260/280=1.8。
3.番茄溃疡病菌分子标准样品及其制备方法，其特征是包括如下步骤(1)番茄溃疡病菌菌株按常规细菌进行菌株活化、增菌培养，26°C培养24h；(2)提取番茄溃疡病菌DNA，采用preman法提取DNA；(3)DNA质量及完整性检测、DNA浓度及纯度检测；(4)标准样品的制备将测定浓度后的DNA按管进行分装，然后冻干，即为目的标准品。
4.根据权利要求3所述的番茄溃疡病菌分子标准样品及其制备方法，其特征是制备的标准样品定性鉴定取制备的标准样品，加入50μ1ΤΕ，溶解后作为模板使用，经采用特异性引物进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品；正向弓丨物(F) 5' -tcattggtcaattctgtctccc-3，反向弓I物(R) 5' -tactgagatgtttcacttcccc-3，PCR扩增PCR扩增采用25 μ L体系，如下2XPCRMasterMix12. 5μ LPrimers(5 μ Μ)2μ LTemplateIuLddH209. 5μ LTotal25μ LPCR反应参数94 °C预变性3 min，94 °C变性30 s，62. 5 °C退火45 s，72 °C延伸30 s，30个循环，最后72 °C延伸5 min ；按上述条件将该病菌进行特异性引物的PCR扩增，扩增后，可产生片断250bp左右的片断，表明该病菌即为番茄溃疡病菌。
5.根据权利要求3所述的番茄溃疡病菌分子标准样品及其制备方法，其特征是所述提取番茄溃疡病菌DNA，具体步骤是(1)番茄溃疡病菌菌株按常规细菌进行菌株活化、增菌培养，26°C培养Mh；(2)提取番茄溃疡病菌DNA，采用preman法提取DNA①取新鲜培养的相应致病菌增菌液ImL于2mL离心管中；②以13000r/min离心3min，吸弃上清；③加入100μ L DNA提取液；④震荡混勻后(没有细菌菌块)沸水浴lOmin，13000r/min离心;3min；⑤取上清液到1.5mL离心管中保存于-20°C备用。
全文摘要
本发明涉及番茄溃疡病菌分子标准样品，另外本发明还涉及其制备方法，属于植物检疫技术研究领域。番茄溃疡病菌分子标准样品，以分离的番茄溃疡病菌菌株为原料提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到番茄溃疡病菌的分子标准品，其具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状；(2)每管的含量5±0.0016μg；(3)DNA纯度OD260/280=1.7～2；(4)易溶于水，或TE(Tris-EDTA)缓冲液中。本发明标准样品可采用特异性的引物通过PCR方法检测出，灵敏度达到10-4倍。该标准品可用于进出口检测中，作为阳性参照物质，提高检测结果的准确性。
文档编号C12Q1/68GK102286622SQ20111021969
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者徐凤敏, 李鑫, 王有福, 蒋维旗 申请人:李鑫, 王有福