专利名称：PCV2、PRV与SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒的检测方法，具体涉及PCV2、PRV与SIV H9亚型多重STOR Green I实时荧光PCR引物及其检测方法。
背景技术：
猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCM)都能够不同程度的导致妊娠引起种猪不育，即公猪睾丸肿胀，精液质量下降，失去种用能力；母猪表现为不发情，返情，不孕； 妊娠母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔猪发病且导致大量死亡等，给养猪业造成了巨大的经济损失。对这类传染病的有效控制是保证养猪业健康发展的关键因素之一。在动物流感中，猪流感是除禽流感以外经济意义最大，而且公共卫生意义特别重要。 2009年墨西哥爆发的猪流感疫情导致数百人死亡，并且，猪流感引起的人类流感迅速在世界上传播开来。所以，猪流感的预防和控制密切关系到人类的公共卫生安全。目前，针对以上三种病毒病的诊断方法有很多，但这些方法具有操作复杂、费时费力、敏感度差及阴性率高等缺点；虽然临床已经使用的PCR诊断技术，有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点，但不能准确定量；而TaqMan荧光定量PCR方法能定量，但成本较高， 且需要合成特异性探针。亟需研究开发成本低、简便、快速、特异、定量的检测方法。临床上， 这几种病毒常常以混合感染的形式出现，靠分离病毒和抗体检测来确诊容易造成假阴性， 而且操作繁琐，对仪器的操作要求较高，所需时间长，亟需一种操作简单、快速的检测、准确率高的鉴别诊断方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是PCV2、PRV与SIV H9亚型这几种病毒常常以混合感染的形式出现，靠分离病毒和抗体检测来确诊容易造成假阴性，而且操作繁琐，提供一种 PCV2、PRV与SIV H9亚型多重STOR Green I实时荧光PCR引物及其检测方法。本发明的技术方案是PCV2、PRV与SIV H9亚型多重STOR Green I实时荧光PCR 引物SIV H9亚型引物的序列如下上游引物P1 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘；下游引物P2 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘；PRV引物的序列如下上游引物P3:5' -GGCATCGGCGACTACCT-3‘；下游引物P4 5 ‘ CGTCGTGCAGCGTGTAGAG-3 ‘；PCV2引物的序列如下上游引物P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；下游引物P6:5' -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3‘。
所述引物检测PCV2、PRV与SIV H9亚型的多重STOR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，所述STOR Green I实时荧光PCR反应，在25 μ 1体系中加入以下成份
权利要求
1.PCV2、PRV与SIVH9亚型多重STOR Green I实时荧光PCR引物，其特征在于 SIV H9亚型引物的序列如下上游引物 P1 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘； 下游引物 P2 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘； PRV引物的序列如下上游引物 P3 5 ‘ -GGCATCGGCGACTACCT-3 ‘； 下游引物 P4 5 ‘ -CGTCGTGCAGCGTGTAGAG-3 ‘； PCV2引物的序列如下上游引物 P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘； 下游引物 P6 5 ‘ -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3 ‘。
2.利用权利要求1所述引物检测PCV2、PRV与SIVH9亚型的多重STOR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份 SYBR Premix Ex Taq II14.5 μ Ρ1/Ρ3/Ρ50.5+0.5+0.5pLP24M/P60.5+0.5+0.5μΕDNA1+1+1 μ ddH204.5μ .25 μ 所述反应条件为95°C预变性lmin ；进入循环，95°C变性10s，58°C退火15s，72°C延伸 15s，40个循环，循环结束后升温至95°C 15s，再降至65°C .15s，开始从65°C递增至94°C，采集荧光信号得出扩增产物的溶解曲线，于95°C 15s结束反应。
全文摘要
本发明公开了一种PCV2、PRV与SIV H9亚型多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法，SIV H9亚型引物的序列如下上游引物P15′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′；下游引物P25′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′；PRV引物的序列如下上游引物P35′-GGCATCGGCGACTACCT-3′；下游引物P45′-CGTCGTGCAGCGTGTAGAG-3′；PCV2引物的序列如下上游引物P55′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；下游引物P65′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。本发明分别设计扩增SIV H9亚型、PCV2和PRV的特异性引物，通过三重SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法能够同时检测SIV H9亚型、PCV2和PRV。SIV H9亚型、PCV2和PRV同时检出的极限拷贝数分别为184拷贝/μL，207拷贝/μL，193拷贝/μL。本发明的特异性试验结果良好，只出现三个特异性的峰值，重复性试验具有很好的稳定性并且本试验的最大优势在于能够同时检测SIV H9亚型、PCV2和PRV3种DNA病毒，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别。
文档编号C12Q1/70GK102373299SQ20111022175
公开日2012年3月14日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者宋亚鹏, 崔保安, 李明凤, 陈红英, 韩志涛, 魏战勇 申请人:河南农业大学