专利名称：聚乙二醇修饰的氧化石墨烯及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可用作胰蛋白酶活化剂的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯。
背景技术：
胰蛋白酶(Trypsin)是丝氨酸蛋白酶的一种，是高等动物及人体内一种重要的消化酶。胰蛋白酶在胰脏以酶原形式合成，作为胰液的成分分泌后，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制性分解而成为具有生物活性的胰蛋白酶。它是一种肽链内切酶，能够选择性水解蛋白质(多肽链)中由赖氨酸或精氨酸的羧基所形成的肽链。在体内，胰蛋白酶不仅有消化酶的作用，而且能够作用于其它酶的前体(如糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等)，对它们起活化作用。在临床上，胰蛋白酶常用于治疗脓胸、血胸、溃疡、伤口炎症、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等，能够促使血凝块、脓液、痰液等分解，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，并有抗炎症作用。 此外，它可用于呼吸道疾病的治疗，也可用于毒蛇咬伤的治疗。在生命科学中，胰蛋白酶是一种非常重要的工具酶。在动物细胞组织培养中，常用于组织的消化和动物细胞的培养传代。由于细胞膜上的糖蛋白(也叫做糖被)，具有黏附性，可使多个细胞黏附在一起而形成组织，胰蛋白酶可以用来水解糖被，使“用于实验的动物组织“分散成单个细胞.便于制成细胞悬浊液进行细胞培养和观察。在蛋白质组学研究中，用生物质谱鉴定蛋白质方法中， 或经过ID或是2D胶分离的胶带，都需要蛋白水解酶的酶解，最常用的酶是胰蛋白酶，它是一种序列特异性的蛋白酶，只切割精氨酸赖氨酸残基的C端。由于胰蛋白酶酶解的强特异性，是蛋白质的氨基酸序列测定中不可缺少的工具酶。胰蛋白酶在体内体外都有着重要的功能，因此能够显著提高其生物活性的活化剂在生物医学研究乃至临床上无疑将有着重要的作用；并且在质谱鉴定过程中，需要酶解温度是56°C，大大超过了胰蛋白酶的最适温度，而且过高的温度易使其变性，失去酶解作用， 因此能够增强其稳定的稳定剂也显得尤为重要。但是到目前为止，能够提高酶活性的活性剂很少。最近，上海中国科学院应用物理学的黄庆老师所研究的金纳米颗粒可以提高胰蛋白酶活性10%左右，相对于其它的大大降低酶活性的材料来说是非常好的，但是仍然未能满足胰蛋白酶活性的显著提高，未能满足其在生物学上运用的需求，然而关于胰蛋白酶的稳定剂却几乎没有发现(固定化酶除外)。因此，为了显著提高胰蛋白酶的活性和稳定性，满足其在生物医学上的广泛运用， 十分有必要发明一种胰蛋白酶活化剂。现有技术中，聚乙二醇修饰的氧化石墨烯一般用作药物载体，例如2008年Dai Hongjie课题组首次报道了利用PEG (聚乙二醇)修饰的氧化石墨烯作为难溶性含芳香结构的抗癌药物载体。他们首先将石墨氧化，获得了尺寸小于50nm的纳米氧化石墨烯 (Nanoscale Grapheneoxide, NG0)，再将生物相容的IOk的支链PEG接枝到NGO上。这种石墨烯材料在生理条件下包括在血清中具有良好的生物相容性和稳定性。然后通过η-η堆垛等物理作用将抗癌药物SN38 (喜树碱衍生物)吸附在PEG化的NGO表面，形成石墨烯-药
3物复合物。石墨烯具有单原子层厚度，其两个基面都可以吸附药物，所以具其他纳米材料无可比拟的超高载药率。同时，NG0-SN38复合物有良好的水溶性，表明其作为药物载体可以用于难溶性药物的增溶。且，其中的药物具有高度活性，同时，该药物载体没有明显的细胞毒性，具有良好的生物安全性。(参见LIU Ζ, ROBINSON J, SUN X Μ, et al. J Am Chem Soc, 2008， 130: 10876-10877)。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种聚乙二醇修饰的氧化石墨烯，作为胰蛋白酶活化剂特异性地提高胰蛋白酶的活性和热稳定性。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种聚乙二醇修饰的氧化石墨烯，包括氧化石墨烯、聚乙二醇，所述聚乙二醇的一端为氨基，另一端为亚氨基，且所述亚氨基的氮原子与氧化石墨烯中的羰基中的碳原子相连构成酰胺键；其中，所述氧化石墨烯的高度为Inm 2nm，尺寸为IOnm 30nm ；所述聚乙二醇为分子量(重均分子量)1800 2200的直链聚乙二醇；优选为分子量为2000的直链聚乙二醇；并且，所述聚乙二醇的重量百分比为25 ；35%，优选为28 30%。上述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯的制备方法可参照Liu Zhuang课题组的，(参见 YANG K, ZHANG S, et al. ACS ΝΑΝΟ, 2010)，区别仅在于将 NH2-IOk-力r_PEG_NH2 替换为 NH2-2k-7-PEG-NH2。上述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯可以特异地提高胰蛋白酶的活性和热稳定性；因此，本发明要求保护上述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯作为胰蛋白酶的特异性活性剂的应用；同时要求保护上述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯作为胰蛋白酶的稳定剂的应用。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
1.本发明所述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯合成简单，并且能够特异性提高胰蛋白酶的活性、热稳定；胰蛋白酶活性和稳定性的增强能够满足其在生物医学上的需求。
图1是实施例一中所得GOjk-J-NH2-PEG的AFM图； 图2是实施例一中所得G0-2k-/-NH2-PEG的TGA图3是实施例二中GOjkj-PEG-NH2对胰蛋白酶活力的影响； 图4是实施例二中GOjkj-PEG-NH2对胰凝乳蛋白酶活力的影响； 图5是实施例三中酪素作为底物时GOIkj-PEG-NH2对胰蛋白酶的热稳定性影响； 图6是实施例三中血红蛋白作为底物时G0-2k-/-PEG-NH2对胰蛋白酶的热稳定性影响。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
实施例一制备胰蛋白酶特异性活化剂G0-2k4-NH2-PEG
用Ig膨胀石墨做最初始的原料，加入约30倍重量的氯化钠固体研磨至无明显可见颗粒状物，加水抽滤，洗去氯化钠，将研细的石墨烘干备用。在烧瓶中加入约30mL浓硫酸(98. 3%)，放入已烘干的研细石墨，室温下搅拌8小时，然后将混合物置于冰浴中，加入约3g 高锰酸钾，缓慢升温至115°C，缓慢加入约150mL水，之后加入约10mL30%过氧化氢并搅拌， 离心除去上层水溶液，反复水洗至溶液不再出现沉淀为止。将5mL浓度为3mg/mL的氧化石墨烯悬浊液超声30min得到澄清的氧化石墨烯水溶胶，然后按终浓度0. 12 g/mL加入NaOH 固体并在50°C水浴中搅拌4小时，之后加入浓盐酸调整溶液pH值接近1。然后用蒸馏水反复进行冲洗和离心纯化，得到水溶性良好的碱化石墨烯水溶液。按终浓度:3mg/mL加入末端氨基化的直链聚乙二醇(NH2Ik-/-PEG-NH2)至碱化石墨烯水溶液(浓度为0. 5mg/ml)中， 超声使之混合均勻，然后持续超声半小时，并在第5分钟加入约Img EDC，在第30分钟时加入约2.5mgEDC。将混合物搅拌过夜即可。然后通过IOkDa的超滤柱水洗除去未结合上的 NH2-2k-7-PEG-NH2,即可得到末端氨基化直链聚乙二醇修饰的石墨烯(聚乙二醇修饰的氧化石墨烯 G0-2k-/-NH2-PEG)。对上述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯进行原子力显微镜(AFM)分析，得图1，从图可知聚乙二醇修饰的氧化石墨烯尺寸是10nm-30nm，高度为lnm-2nm。对上述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯进行热重分析，得图2，从图可知PEG的重量百分数为30%左右(占整个G0-2k-/-PEG-NH2的比例)。实施例二 研究实施例一所得聚乙二醇修饰的氧化石墨烯对胰蛋白酶活性的影响。将实施例一所得聚乙二醇修饰的氧化石墨烯G0-2k4-PEG-NH2和胰蛋白酶相互作用，室温下混合16min，然后测定酶的活性参见文献。(参见Lv Min, Su Y Y, et al. Preparative Biochemistry & Biotechnology， 2009, 39: 429 — 438)。胃
20 μ 1 的 0. lmg/ml 的胰蛋白酶分别与 20 μ 1 的无菌水，0. 2mg/mL,0. 3mg/mL,0. 4mg/mL, 0. 5mg/mL、0. 6mg/mL 的 G0-2k-7-NH2-PEG 在 25°C 混合 16min,再力口 10 μ 1 5XPBS 补充到 50 μ 1，再加50 μ 1的5mg/ml的底物酪素进行酶解反应40°C，IOmin,用100 μ 1的TCAC0. 4Μ) 终止反应，离心，取100 μ 1上清液禾口 100 μ 1福林酚(1:1)至IJ 500 μ 1的Na2CO3 (0. 4M)40°C, 20min显色反应，测OD68tl。结果如图3所示胰蛋白酶活性的增强呈现出浓度依赖性，当G0-2k-/-PEG_NH2终浓度分别为 40、60、80、100、120μ g/mL 时，分别增加了约 40%、90%、140%、160%、180% ；因此， 上述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯GOjkW-PEG-NH2能够增强胰蛋白酶的活性。同时，用胰凝乳蛋白酶验证NH2Ik-厂PEG-NH2修饰的石墨烯对胰酶活性的增强是特异性的。这种酶和胰蛋白酶同属于丝氨酸蛋白酶，又是同一个酶家族，结构十分相似。在完全相同的情况下，将胰蛋白酶换成上述胰凝乳蛋白酶，做完全相同的实验；具体方法为 20 μ 1的0. 06mg/ml的胰凝乳蛋白酶分别与20 μ 1的无菌水、0. 15mg/mL、0. 2mg/mL,0. 25mg/ mL 的 G0-2k-7-NH2-PEG 在 25°C混合 16min,再加 10 μ 1 5 XPBS 补充到 50ul，再力口 50 μ 1 的 5mg/ml的底物酪素进行酶解反应40°C，lOmin，用100 μ 1的TCA (0. 4Μ)终止反应，离心，取 100 μ 1 上清液禾口 100 μ 1 福林酚(1:1)到 500 μ 1 的 Na2CO3 (0. 4Μ) 40°C，20min 显色反应， 测od68『结果如图4所示，结果表明GOjkW-PEG-NH2对胰凝乳蛋白酶的活性并没有明显的影响。因此，上述结果表明G0-2kj-PEG-NH2未能提高胰凝乳蛋白酶的活性，能够特异性增强胰蛋白酶的活性，因此其对胰蛋白酶活性的提高是特异性的，可作为胰蛋白酶的特异激活剂。实施例三研究实施例一所得聚乙二醇修饰的氧化石墨烯对胰蛋白酶热稳定性的影响。将胰蛋白酶和GOjkj-NH2-PEG的混合溶液在70°C和80°C分别变性5min，然后按照上述酶活测定方法测定胰蛋白酶的活性，具体为
(1)当酪素作为底物时，将胰蛋白酶和60-21^-/^^6-冊2按照质量体积比(mg/mL)为 1:2的比例混合。此外，胰蛋白酶和无菌水，胰蛋白酶和NH2jk-/-PEG-NH质量体积比(mg/ mL)为1:10也相互混合，然后将混合液在70°C和80°C时放置5分钟，然后再按照上述测活方法测定胰蛋白酶的活性。结果如图5所示没有G0-2k4-PEG-NH2的情况下，胰蛋白酶几乎变性，没有活性。然而，在G0-2k4-PEG-NH2的保护作用下，胰蛋白酶能够较高得保持自己的活性。在70°C时，达到87%，80°C时，达到55%。(2)当血红蛋白作为底物时，按照同样的方法同样的比例，将混合液放入70°C和 80°C，然后再测定胰蛋白酶的活性。结果如图6所示没有G0-2k4-PEG-NH2的情况下，在 70°C和80°C时，胰蛋白酶的活性分别降低到5%和4%。而GOjkj-PEG-NH2存在情况下，在 70°C和80°C时，胰蛋白酶能够维持活性到70%和60%。上述结果表明在以酪素或血红蛋白分别作底物时，G0-2k-7-PEG-NH2都能够增强胰蛋白酶的稳定性，这说明G0-2k4-PEG-NH2对胰蛋白酶的热稳定增强与底物无关。综上所述，G0-2k-7-PEG-NH2这种活化剂能够特异地显著地提高胰蛋白酶的活性， 并且在恶劣的条件下，也能保护胰蛋白酶的活性，而且这种对胰蛋白酶的热稳定性的增强与底物是无关的。这种材料能够使胰蛋白酶在生物医学上发挥极大的用处。
权利要求
1.一种聚乙二醇修饰的氧化石墨烯，包括氧化石墨烯、聚乙二醇，所述聚乙二醇的一端为氨基，另一端为亚氨基，且所述亚氨基的氮原子与氧化石墨烯中的羰基中的碳原子相连构成酰胺键；其特征在于，所述氧化石墨烯的高度为Inm 2nm，尺寸为IOnm 30nm ；所述聚乙二醇为分子量1800 2200的直链聚乙二醇，并且，所述聚乙二醇的重量百分比为 25 35%。
2.根据权利要求1所述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量2000。
3.根据权利要求1所述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯，其特征在于，所述聚乙二醇的重量百分比为28 30%。
4.权利要求1所述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯作为胰蛋白酶的特异性活性剂的应用。
5.权利要求1所述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯作为胰蛋白酶的稳定剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种可用作胰蛋白酶活化剂的聚乙二醇修饰的氧化石墨烯，本发明公开了一种聚乙二醇修饰的氧化石墨烯，包括氧化石墨烯、聚乙二醇，所述聚乙二醇的一端为氨基，另一端为亚氨基，且所述亚氨基的氮原子与氧化石墨烯中的羰基中的碳原子相连构成酰胺键；所述氧化石墨烯的高度为1nm～2nm，尺寸为10nm～30nm；所述聚乙二醇为分子量1800～2200的直链聚乙二醇；所述聚乙二醇的重量百分比为25～35%。本发明所述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯合成简单，并且能够特异性提高胰蛋白酶的活性、热稳定；胰蛋白酶活性和稳定性的增强能够满足其在生物医学上的需求。
文档编号C12N9/76GK102432865SQ20111022722
公开日2012年5月2日 申请日期2011年8月9日 优先权日2011年8月9日
发明者刘庄, 姚凯, 张帅, 彭睿, 李述汤, 杨凯, 金丽玲 申请人:苏州大学