专利名称：一种检测猪博卡病毒的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种病毒的诊断试剂盒，特别是一种检测猪博卡病毒的试剂盒及方法。
背景技术：
博卡病毒属于细小病毒科，而细小病毒科属于最小、最简单的一类单链线状DNA 病毒，包括感染鸟类和哺乳动物的细小病毒亚科和感染节肢动物的浓核病毒亚科2个亚家族。细小病毒亚科又包括5个属细小病毒属、红病毒属、依赖性病毒属、貂阿留申病毒属和博卡病毒属。细小病毒B19属于红病毒属，是HBoV发现之前已知惟一感染人类的细小病毒。2005年瑞典的Allander等报道，他们从患呼吸道感染的婴幼儿的标本中分离到一种新病毒，经对该病毒的基因序列分析发现，这种新病毒是一种单链的，无胞膜的DNA病毒，应归属于细小病毒科。它与所有的其他已知的细小病毒属的病毒一样，含有2个编码非结构蛋白和至少2个衣壳蛋白(VPl和VP2)及中间开放读码框架。在其他的细小病毒中，这个开放读码框架编码具有未知功能的非结构蛋白。新发现病毒的中间开放读码框架的产物和 NPl 一致，与其他的细小病毒的NPl有47%的氨基酸的一致性。因此，将他们发现的新病毒命名为人类博卡病毒(human bocavirus，HBoV)。在2009年，Blom strom A等利用随机多重置换扩增方法(Random multiple displacementamplification,MDA)在患仔猪断奶后多系统衰竭综合征的猪淋巴结中扩增出了一段长1879bp的核苷酸序列，该段序列与已知病毒序列比较，发现其完整的NPl基因及部分VP1/VP2基因与人类博卡病毒相近，故将该病毒暂时定义为猪博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)。PBoV在病猪体内被检出，暗示其对猪有一定的致病性。翟少伦等于2010年建立一种检测PBoV的PCR方法。
发明内容
本发明提供了一种检测猪博卡病毒的试剂盒及方法，所述的这种检测猪博卡病毒的试剂盒及方法可以快速准确地检测猪博卡病毒，操作简单，耗时短，灵敏度高，特异性强， 解决了现有技术中检测猪博卡病毒的方法复杂，时间长的技术问题。本发明提供了一种检测猪博卡病毒的试剂盒，其特征在于它含有(1)荧光PCR反应液，所述的荧光PCR反应液中含有特异性引物，其上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；(2)针对猪博卡病毒的TaqMan特异性探针，探针的序列如SEQ ID NO 3所示，在探针的5’设计有荧光物质，在探针的3’设计有淬灭物质；(3)博卡病毒质粒的DNA阳性对照。进一步的，所述的特异性引物的浓度为0. 2μΜ。进一步的，所述的荧光PCR反应液含有浓度均为200 μ M的dATP、dTTP、dGTP和 dCTP，还含有浓度为3. 5mM的Mg2+。进一步的，还含有热启动Taq酶，所述的热启动Taq酶的终浓度为0. 03U/yLo
进一步的，在探针的5’设计有FAM荧光物质，在探针的3’设计有带有BHQ的淬灭物质。本发明还提供了一种用于检测猪博卡病毒的特异性引物，其上游引物的序列如 SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示。本发明还提供了一种用于检测猪博卡病毒的TaqMan特异性探针，其碱基序列如 SEQ ID NO 3 所示。本发明还提供了一种采用上述的试剂盒检测猪博卡方法，包括以下步骤(1)待检样本的DNA提取；(2)荧光PCR检测按照扩增对象数量，取荧光PCR反应液、探针Taq酶混于一离心管中，震荡，分装，盖上管盖备用；将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中，最后取阳性对照加入一个反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中进行检测；(3)结果判定反应液测定Ct值均大于35或无数值的标本为阴性；FAM通道测定 Ct ^ 30的标本为阳性标本；测定30 < Ct < 35的标本建议复测，复测结果Ct < 35为阳性，复测结果Ct >35的为阴性。进一步的，荧光PCR扩增条件为94°C预变性:3min ；按以下参数循环40次94°C变性 20sec、60°C采集荧光 40sec。猪博卡病毒序列登录号为FJ872M4，其碱基序列如SEQ ID NO :4所示。引物和探针的设计过程如下DNA j^^ljfflil NCBI (National Center of Biotechnology Information, NCBI，_ 国国立生物技术信息中心)的网上BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)软件进行 DNA 序列相似性分析(http //www. ncbi. nlm. gov/BLAST)。GenBank 上查取 Bocavirus 基因序列，BLAST序列比对，选取保守性区，设计引物与TaqMan探针，引物和探针的设计采用软件I^rimer Express2. 0 (ABI公司)，引物及探针的序列。引物及探针的设计原则弓丨物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物， 利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则(1)引物长度15_30bp，常用为20bp左右。(2)弓丨物扩增跨度以50_200bp为宜。(3)引物碱基G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。(4)避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。(5)引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。(6)引物的特异性引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。弓丨物量 每条引物的浓度0. 1 1 μ mol或10 lOOpmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。Taqman探针设计原则(1)先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。(2)所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段，这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。(3)扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100_150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。(4)保持GC含量在20%和80%之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。(5)为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G (不能有4个连续的G)将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。根据猪博卡基因序列设计一对特异性引物如下上游引物5，-TCAGAGATCGAGCTATACAACCG-3，(SEQID NO 1)；下游引物5，-CTGTTTCGGAGATGTCCTTGC-3，(SEQID NO 2)；其作用是能够特异性扩增猪博卡病毒DNA片段。根据猪博卡病毒基因序列设计探针，其序列如下FAM-AGCTCTTCGAATCGCCGCTCTCCT-BHQ(SEQ ID NO 3)；其作用是猪博卡病毒特异性结合，在PCR扩增中释放FAM荧光信号，当荧光PCR仪通过相应的通道采集荧光时，就可以特异性观察到扩增曲线。本试剂盒荧光PCR反应条件的优化过程为(1)引物浓度的优化设置引物终浓度范围为50 300nM，用不同浓度梯度的引物进行荧光PCR试验，结果表明此浓度范围的引物都可以扩增S型曲线，并且当每条引物终浓度为0. 2 μ M时效果最佳。O) Mg2+浓度的优化设置Mg2+终浓度范围为1. 5 5. OmM，结果表明此浓度范围内的Mg2+均能扩增出 S型曲线，并且当Mg2+终浓度为3. 5mM时，扩增效果最好。(3) dNTPs浓度的优化四种dNIPs等当量混合，设置每种dNIPs终浓度范围为0. 1 ImM，结果表明此浓度范围内的dNIPs均能扩增出曲线，并且每种dNIPs终浓度以0. 2mM。(4)探针浓度的优化设置探针终浓度范围为0. 05 1 μ Μ，用不同浓度梯度的探针进行荧光PCR试验， 结果表明此浓度范围的引物都可以扩增S型曲线，并且当每条探针终浓度以0. 2 μ M时效果最佳。(4)退火温度的筛选根据所采用的PCR引物和探针，运用公式T = 2(A+T)+4(G+C)计算退火温度，再按照实际情况，确定PCR反应的中限温度是59°C，温度范围是56 66°C，结果表明该范围温度下均能扩增出S型曲线，当退火温度为60°C，PCR扩增出的曲线效果最佳。因此，选择 60°C作为荧光PCR敏感性和特异性试验的退火温度。(5) Taq酶浓度的优化设置Taq酶终浓度范围为0. 001 0. IU/μ L，用不同浓度梯度的Taq酶进行荧光 PCR试验，结果表明此浓度范围的热启动Taq酶可以扩增S型曲线，并且当Taq酶浓度为以 0. 03υ/μ 时效果最佳。本发明和已有技术相比，其技术进步是显而易见的。本发明的试剂制备简单、方法简便快捷、特异性强、敏感性高、结果判断容易，对两种亚型的混合感染具有鉴别诊断作用。 可以用于猪博卡病毒的诊断、流行病学和分子生物学研究等多个领域。
图1是试剂盒中引物和探针的设计描述图(Product size :85bp针对的是VP1/2 区域)。图2是PBov阳性质粒的碱基序列图。图3是细小病毒组织阳性病料、蓝耳病病毒阳性组织病料、圆环病毒阳性病料、 PBov实时荧光PCR检测结果图。图4是SPF猪血清进行实时荧光PCR检测的结果图。图5是不同浓度梯度猪博卡阳性质粒标准品的荧光曲线图。图6是不同浓度梯度猪博卡阳性质粒标准品的扩增效率图。图7、图8、图9、图10分别是将三批次检测试剂PBov-1、PBov-2、PBov-3放入4°C 冰箱中及37°C恒温箱中进行加速破坏试验，连续监测七天反应试剂检测性能的变化，从而判断反应体系的稳定性的结果图。图8、图10 横坐标代表稳定性试验天数，纵坐标代表对应稳定性试验Ct结果。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述发明，而不是以任何方式限制发明，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利范围之内。实施例1试剂盒组成荧光PCR反应液1管(25 μ L/反应)，其中的dATP、dTTP、dGTP和dCTP终浓度为 200 μ Μ、Mg2+终浓度为3. 5mM,上下游引物终浓度为0. 2 μ M，探针终浓度0. 2 μ Μ，探针引物混合液1管O μ L/反应)，浓度都为0. 2 μ M，Taq酶1管O μ L/反应)，其中Taq酶浓度为 0. 5U/ μ L，阳性质粒对照1管(250 μ L/管)，阴性质粒对照1管(250 μ L/管)。本试剂盒采用30 μ L反应体系，反应液组成为荧光PCR反应液为25 μ L、酶2 μ L、 探针引物混合液ι μ L及模板2 μ L0实施例2猪博卡病毒荧光PCR检测试剂盒的使用方法1、样本处理请自行提取DNA，阳性对照无需提取，直接加样。2、荧光PCR的检测
(1)按照检测样品数n(n =待检样品数+2)取PCR反应液、热启动Taq酶和探针混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用。(2)现将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中。(3)荧光PCR反应条件-MV X3min ；94°C X20sec，60°C X40sec，40个循环。60°C 时荧光检测，检测通道FAM。3、质控标准(1)阴性对照的Ct值应等于none。(2)阳性对照的Ct值应<30，否则，此实验视为无效。(Ct值应以S型曲线拐点的循环数为准)(3)应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。4、结果判定(I)Ct值> 35或无数值的标本为阴性。(2) FAM通道Ct值< 30的标本为阳性标本。(3) 30 < Ct值< 35的样本建议复测。复测结果Ct < 35为阳性，复测结果Ct彡35 的为阴性。实施例3试剂盒特异性试验将保存的如下经荧光PCR检测为阳性的5份细小病毒组织阳性病料、5份蓝耳病病毒阳性组织病料、5份圆环病毒阳性病料处理后，进行PBov普通PCR检测，均为阴性。然后，分别取2 μ L作为模板进行实时荧光PCR检测。实时荧光PCR检测结果如图3。将15例SPF猪血清，分别取2 μ L作为模板进行实时荧光PCR检测。实时荧光PCR 检测结果如图4。荧光PCR结果表明仅猪博卡的DNA扩增出曲线，而作为对照样本的猪细小病毒组织阳性病料、猪蓝耳病病毒阳性组织病料、猪圆环病毒阳性病料的DNA均无此扩增曲线出现。实施例4试剂盒敏感性试验提取参比模板质粒，定量后分级10倍稀释至IO1C0Pies/ μ L，分别取每一数量级稀释液2 μ L作为PCR模板。在PCR的过程中由实时荧光定量PCR仪自动绘制线性标准曲线， 线性相关性标准曲线，如图5、图6。实施例5试剂盒的重复性和稳定性试验以相同稀释度的标准质粒作为模板，并10倍梯度稀释，三个不同梯度模板，重复 10次反应，结果见下表。原倍是指稳定性试验初始浓度。从菌液抽提出的DNA浓度太高，如果初始浓度用的高后面的梯度都会受到气溶胶污染，所以选择原倍为MCt值对应的质粒浓度。
权利要求
1.一种检测猪博卡病毒的试剂盒，其特征在于它含有(1)荧光PCR反应液，所述的荧光PCR反应液中含有特异性引物，其上游引物的序列如 SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；(2)针对猪博卡病毒的TaqMan特异性探针，探针的序列如SEQID NO 3所示，在探针的5’设计有荧光物质，在探针的3’设计有淬灭物质；(3)博卡病毒质粒的DNA阳性对照。
2.根据权利要求1所述的一种检测猪博卡病毒的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物的浓度为0. 2μΜ。
3.根据权利要求1所述的一种检测猪博卡病毒的试剂盒，其特征在于所述的荧光PCR 反应液含有浓度均为200μΜ的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，还含有浓度为3. 5mM的Mg2+。
4.根据权利要求1所述的一种检测猪博卡病毒的试剂盒，其特征在于还含有热启动 Taq酶，所述的热启动Taq酶的终浓度为0. 03U/^L。
5.根据权利要求1所述的一种检测猪博卡病毒试剂盒，其特征在于在探针的5’设计有FAM荧光物质，在探针的3’设计有带有BHQ的淬灭物质。
6.一种用于检测猪博卡病毒的特异性引物，其特征在于其上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示。
7.一种用于检测猪博卡病毒的TaqMan特异性探针，其特征在于其碱基序列如SEQ ID NO 3所示。
8.一种采用权利要求1所述的试剂盒检测猪博卡方法，其特征在于包括以下步骤(1)待检样本的DNA提取；(2)荧光PCR检测按照扩增对象数量，取荧光PCR反应液、探针Taq酶混于一离心管中，震荡，分装，盖上管盖备用；将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中，最后取阳性对照加入一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中进行检测；(3)结果判定反应液测定Ct值均大于35或无数值的标本为阴性；FAM通道测定 Ct ^ 30的标本为阳性标本；测定30 < Ct < 35的标本建议复测，复测结果Ct < 35为阳性，复测结果Ct >35的为阴性。
9.如权利要求8所述的一种检测猪博卡病毒的方法，其特征在于荧光PCR扩增条件为 94°C预变性3min ；按以下参数循环40次94°C变性20sec、6(TC采集荧光40sec。
全文摘要
本发明属于病毒的诊断和检测领域，解决了现有技术中检测猪博卡病毒过程复杂，时间长的技术问题，提供了一种检测猪博卡病毒的试剂盒，其含有荧光PCR反应液，所述的荧光PCR反应液中含有特异性引物，其上游引物的序列如SEQIDNO1所示，下游引物的序列如SEQIDNO2所示；还含有针对猪博卡病毒的TaqMan特异性探针，探针的序列如SEQIDNO3所示，还含有博卡病毒质粒的DNA阳性对照。本发明还提供了采用上述的试剂盒检测猪博卡病毒的方法。本发明的试剂盒可以快速准确地检测猪博卡病毒，操作简单，耗时短，灵敏度高，特异性强，可对多种类型标本中猪博卡病毒进行定性或定量检测。
文档编号C12Q1/70GK102286640SQ20111022811
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者刘佩红, 刘健, 华修国, 周锦萍, 崔立, 张维谊, 王建, 葛菲菲, 邓波, 鞠厚斌 申请人:上海市动物疫病预防控制中心