专利名称：一种新组织血管生成方法
技术领域：
本发明属于化合物药理作用和分子生物技术领域，具体涉及一种新组织血管生成方法。
背景技术：
血管生成(angiogenesis)是指在原有血管床的基础上再生成新血管，是一个复杂的受多因素调控的过程，它有别于血管发生过程。血管生成是一个由多种细胞因子和多种细胞成分参与的、动态的、协调的复杂过程，其起始的中心环节是血管内皮细胞或基质干细胞的迁移、分裂、分化，以及随后的管腔化，受到血管生成诱导因子和抑制因子的精密调节。生理学上的血管生成多见于伤口愈合，或月经周期中子宫内膜的血管生成，但在肿瘤、 动脉硬化、银屑病、糖尿病性视网膜病及子宫内膜异位症等一些过程中则是一种病理性现象。血管生成在肿瘤的发生和转移过程中是必不可少的，绝大多数恶性肿瘤的生长和转移都是血管依赖的，即肿瘤组织在其生长过程中会诱导新血管的生成。这个在肿瘤生长过程中被诱发的血管生成现象，称之为肿瘤新生血管生成。阻断血管生成是一种新治疗肿瘤的手段和途径。破坏或者抑制肿瘤的新生血管生成，有效地阻止肿瘤的生长和转移的药物称之为肿瘤新生血管生成抑制剂(tumorangiogenesis inhibitor, TAI)。血管生成模型的建立是筛选抗血管生成药物的前提，已经报道的模型有鼠耳模型、鸡胚尿囊膜模型等，但这些模型都有其缺点，普遍具有定量繁琐，成活率不高的缺点。因此建立一种简单、方便而又能够被广泛应用的新组织血管生成的模型是十分必要的。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种新组织血管生成方法，克服了定量繁琐和成活率不高的缺点，建立了一种简单、方便而又能够被广泛应用的新组织血管生成的模型，该方法还能应用于肿瘤血管生成抑制剂的筛选研究。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是一种新组织血管生成方法，无菌条件下取小鼠或大鼠胸主动脉、心、肝、脾、肺、血管、肾和结肠组织，随即放入预冷的PBS液中清洗，胸主动脉的处理方法为用眼科手术剪及镊子去除动脉管外的纤维和脂肪组织，用PBS液清洗后，在放大镜下，于预冷的DMEM培养基中切取成长度为0. 3mm的动脉环或者剪成长度为0. 3mm的动脉块，而心、肝、脾、肺、肾和结肠组织的处理方法为用眼科手术剪及镊子去除组织周边的粘连组织后剪成Imm3大小的组织块，取纤维蛋白原溶液平铺于培养板中，培养板的每孔容量为200 μ L，培养板的每孔中加凝血酶1 μ L，摇勻后形成凝胶，将切取的组织块植于培养板的凝胶上，再往培养板的每孔中加纤维蛋白原溶剂200 μ L和凝血酶1 μ L，摇勻后形成凝胶，这样就形成了三明治式的夹层结构，于该夹层结构上加含质量浓度3-10%胎牛血清的DMEM培养基lmL，放入体积浓度为 5%的(X)2和温度为37°C的培养箱中培养，以此就能生成主动脉、心、肝、脾、肺、肾和结肠组织各自对应的新组织血管。
所述的生成主动脉、心、肝、脾、肺、肾和结肠组织各自对应的新组织血管的速度快慢依次为肺的新组织血管>脾的新组织血管>肝的新组织血管>心的新组织血管>肾的新组织血管 > 结肠的新组织血管 > 血管的新组织血管，其中结肠的新组织血管生成的过程分为内皮细胞迁出形成血管和血管生成两种。所述的DMEM培养基中包括VEGF或者bFGF生长因子。所述的肺的新组织血管生成后加入塔斯品碱，能对于肺的新组织血管具有抑制作用，而所述的结肠的新组织血管生成后加入塔斯品碱衍生物1822对结肠组织血管生成具有抑制作用。通过一种新组织血管生成方法，通过在无菌条件下取小鼠或大鼠胸主动脉、心、 肝、脾、肺、肾和结肠组织结合培养板生成主动脉、心、肝、脾、肺、肾和结肠组织各自对应的新组织血管，克服了定量繁琐和成活率不高的缺点，建立了一种简单、方便而又能够被广泛应用的新组织血管生成的模型，该方法还能应用于肿瘤血管生成抑制剂的筛选研究。
图1各种组织的血管生长速度对比坐标图；图2塔斯品碱对肺组织血管生成的影响坐标图；图3塔斯品碱衍生物1822对结肠组织血管生成的影响坐标图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作更详细的说明。新组织血管生成方法，无菌条件下取小鼠或大鼠胸主动脉、心、肝、脾、肺、肾和结肠组织，随即放入预冷的PBS液中清洗，胸主动脉的处理方法为用眼科手术剪及镊子去除动脉管外的纤维和脂肪组织，用PBS液清洗后，在放大镜下，于预冷的DMEM培养基中切取成长度为0. 3mm的动脉环或者剪成长度为0. 3mm的动脉块，而心、肝、脾、肺、血管、肾和结肠组织的处理方法为用眼科手术剪及镊子去除组织周边的粘连组织后剪成Imm3大小的组织块， 取纤维蛋白原溶液平铺于48孔培养板中，48孔培养板的每孔容量为200 μ L，48孔培养孔的每孔中加凝血酶1 μ L，摇勻后形成凝胶，将切取的组织块植于48孔培养孔的凝胶上，再往 48孔培养孔的每孔中加纤维蛋白原溶剂200 μ L和凝血酶1 μ L，摇勻后形成凝胶，这样就形成了三明治式的夹层结构，于该夹层结构上加含3-10%胎牛血清的DMEM培养基lmL，放入浓度为5%的CO2和温度为37°C的培养箱中培养，以此就能生成主动脉、心、肝、脾、肺、肾和结肠组织各自对应的新组织血管。所述的DMEM培养基中包括VEGF或者bFGF生长因子。3天后显微镜下观察各种组织血管生成情况，隔天观察一次，根据血管生成情况对比各种组织的血管生长速度并形成如图1所示的对比图，图示表明所述的生成主动脉、心、肝、脾、肺、 肾和结肠组织各自对应的新组织血管的速度快慢依次为肺的新组织血管>脾的新组织血管>肝的新组织血管>心的新组织血管>肾的新组织血管>结肠的新组织血管>血管的新组织血管，其中结肠的新组织血管生成的过程分为内皮细胞迁出形成血管和血管生成两种。另外在肺的新组织血管培养的第3天加入塔斯品碱，以含质量浓度3-10%胎牛血清的 DMEM培养液为空白对照组，塔斯品碱组的低、中和高浓度分别为2. 32，4. 63和9. 25ymol/ L，隔3天换液，每组设5个复孔，在第9天进行组织血管计数，以时间为横坐标，肺的新组织血管条数为纵坐标分别作图，比较结果见图2，另外在结肠的新组织血管培养的第3天加入塔斯品碱衍生物1822，以含质量浓度3-10%胎牛血清的DMEM培养液为空白对照组，塔斯品碱衍生物1822的低、中和高浓度分别为4，12和36 μ mol/L,隔3天换液，每组设5个复孔， 在第9天进行组织血管计数，以时间为横坐标，结肠的新组织血管条数为纵坐标分别作图， 比较结果见图3，这样综合图2和图3的比较结果，可知所述的肺的新组织血管生成后加入塔斯品碱，能对于肺的新组织血管具有抑制作用，而所述的结肠的新组织血管生成后加入塔斯品碱衍生物1822对结肠组织血管生成具有抑制作用。
权利要求
1.一种新组织血管生成方法，其特征在于无菌条件下取小鼠或大鼠胸主动脉、心、 肝、脾、肺、肾和结肠组织，随即放入预冷的PBS液中清洗，胸主动脉的处理方法为用眼科手术剪及镊子去除动脉管外的纤维和脂肪组织，用PBS液清洗后，在放大镜下，于预冷的DMEM 培养基中切取成长度为0. 3mm的动脉环或者剪成长度为0. 3mm的动脉块，而心、肝、脾、肺、 肾和结肠组织的处理方法为用眼科手术剪及镊子去除组织周边的粘连组织后剪成Imm3大小的组织块，取纤维蛋白原溶液平铺于培养板中，培养板的每孔容量为200μ L，培养板的每孔中加凝血酶1 μ L，摇勻后形成凝胶，将切取的组织块植于培养板的凝胶上，再往培养板的每孔中加纤维蛋白原溶剂200 μ L和凝血酶1 μ L，摇勻后形成凝胶，这样就形成了三明治式的夹层结构，于该夹层结构上加含质量浓度3-10%胎牛血清的DMEM培养基lmL，放入体积浓度为5%的(X)2和温度为37°C的培养箱中培养，以此就能生成主动脉、心、肝、脾、肺、肾和结肠组织各自对应的新组织血管。
2.根据权利要求1所述的新组织血管生成方法，其特征在于所述的生成主动脉、心、 肝、脾、肺、肾和结肠组织各自对应的新组织血管的速度快慢依次为肺的新组织血管>脾的新组织血管>肝的新组织血管>心的新组织血管>肾的新组织血管>结肠的新组织血管>血管的新组织血管，其中结肠的新组织血管生成的过程分为内皮细胞迁出形成血管和血管生成两种。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的新组织血管生成方法，其特征在于所述的 DMEM培养基中可包括VEGF或者bFGF生长因子。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的新组织血管生成方法，其特征在于所述的肺的新组织血管生成后加入塔斯品碱，能对于肺的新组织血管具有抑制作用，而所述的结肠的新组织血管生成后加入塔斯品碱衍生物1822对结肠组织血管生成具有抑制作用。
全文摘要
一种新组织血管生成方法，通过在无菌条件下取小鼠或大鼠胸主动脉、心、肝、脾、肺、肾和结肠组织结合培养板生成主动脉、心、肝、脾、肺、肾和结肠组织各自对应的新组织血管，克服了定量繁琐和成活率不高的缺点，建立了一种简单、方便而又能够被广泛应用的新组织血管生成的模型，该方法还能应用于肿瘤血管生成抑制剂的筛选研究。
文档编号C12N5/071GK102321568SQ20111023159
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月12日 优先权日2011年8月12日
发明者代秉玲, 张彦民, 张 杰, 王嗣岑, 王楠, 贺浪冲, 郑蕾 申请人:西安交通大学