专利名称：一种nk和/或nkt细胞的培养方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种NK和/或NKT细胞的培养方法。
背景技术：
NK细胞，是骨髓来源的淋巴细胞，可以识别并杀死病毒感染的细胞或转化的恶性细胞。NK细胞是体内快速反应细胞，能迅速被募集至损伤部位，在体外I小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的功能是其他免疫细胞无法替代的，其杀伤肿瘤细胞的效应无MHC限制，因此称为自然杀伤活性；而且，NK细胞通过分泌IFN-gamma以及与DC相互作用促进Thl型T细胞活化。体外培养的NK细胞包括⑶56弱表达和⑶56强表达伴随⑶16表达或不表达细胞群。CD56强表达细胞群通过非MHC限制途径杀伤肿瘤细胞；而CD56弱表达且⑶16+细胞群则通过⑶16-Fc途径直接产生ADCC，且肿瘤相关抗原的刺激能进一步促进ADCC。鉴于NK细胞在抗肿瘤免疫中的重要功能，有必要开发一种有效的体外培养并大量扩增具有肿瘤杀伤活性的NK细胞的方法。 现有的NK细胞体外培养方法尽管已比较成熟，能够培养出对肿瘤细胞杀伤性很高的NK细胞，但增殖数量还不够满意。IL-2、IL-15和IL-7可以通过与NK细胞表面的多聚蛋白体受体的结合而刺激细胞活化、增殖。此外，一些研究还发现这三种细胞因子与NK细胞的分化相关。然而，在培养基中仅添加IL-2、IL-15只能使NK细胞扩增10倍左右，并且通常需要饲养层细胞共同培养，操作复杂，细胞得率低。RetroNecinn是TAKARA Bio Inc的专利产品，属于重组人纤维连接蛋白片段，它含有人纤维连接蛋白CS-I位点和central cell-binding domain,分子量约为63K,其生理活性为参与细胞的附着、伸展、分化和增殖。RetroNectin的CS-Isite及centralcell-binding domain可与T细胞表面的VLA结合,从而刺激细胞大量繁殖。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培养NK和/或NKT细胞的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将离体的NK和/或NKT细胞接种到如下培养体系A中培养，即得到增殖的NK和/或NKT细胞；所述培养体系A为如下I)或2):I)所示培养体系A由抗⑶3抗体、Retronectin、培养基和诱导因子组成；2)所示培养体系A由抗⑶3抗体、培养基和诱导因子组成。所述抗⑶3抗体与所述培养基的配比为5 μ g 5ml;所述Retronectin与所述培养基的配比为25 μ g : 5ml;所述诱导因子为IL-2和IL-15 ；所述IL-2在所述培养体系A中的浓度为800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培养体系A中的浓度具体为1000IU/ml ；
所述IL-15在所述培养体系A中的浓度为18ng/ml-22ng/ml,所述IL-15在所述培养体系A中的浓度具体为20ng/ml。I)所示培养体系A中的所述抗⑶3抗体和Retronectin由缓冲液A提供每2ml所述缓冲液A按照如下方法制备将25 μ g Retronectin、5 μ g抗⑶3抗体和浓度为O. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ；2)所示培养体系B中的所述抗⑶3抗体由缓冲液B提供每2ml所述缓冲液B按照如下方法制备将25 μ g Retronectin和浓度为O. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ；所述培养时间为70小时-74小时，所述培养时间具体为72小时，所述培养温度为350C -38°C，所述培养温度具体为37°C，所述培养所需CO2的浓度为4. 5% -5. 5% (体积百分含量)，所述培养所需CO2的浓度具体为5% (体积百分含量)。 在所述培养步骤后，还包括如下步骤将所述培养得到的细胞移入不含有抗⑶3抗体和Retronectin的培养体系B中继续培养，得到增殖的NK和/或NKT细胞；所述培养体系B和所述培养体系A的区别为不含有抗⑶3抗体和Retronectin，其它组分和各组分浓度均相同。所述缓冲液A、所述缓冲液B和所述诱导因子均为独立包装。所述培养基为10% (体积百分含量)离体血浆的T503培养基，即为10% (体积百分含量)自体血浆的T503培养基；所述抗⑶3抗体为单抗或者多抗；所述抗⑶3抗体具体为Anti-⑶3 (单抗)。所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一物种；所述物种具体为人或动物；所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一个体。本发明的另一个目的是提供一种用于培养NK和/或NKT细胞的培养体系。本发明提供的用于培养NK和/或NKT细胞的培养体系，所述培养体系A为如下I)或2)I)所示培养体系A由抗⑶3抗体、Retronectin、培养基和诱导因子组成；2)所示培养体系A由抗⑶3抗体、培养基和诱导因子组成。所述抗⑶3抗体与所述培养基的配比为5 μ g : 5ml;所述Retronectin与所述培养基的配比为25 μ g : 5ml;所述诱导因子为IL-2和IL-15 ;所述IL-2在所述培养体系A中的浓度为800_1200IU/ml，所述IL-2在所述培养体系A中的浓度具体为1000IU/ml ；所述IL-15在所述培养体系A中的浓度为18ng/ml_22ng/ml，所述IL-15在所述培养体系A中的浓度具体为20ng/ml。I)所示培养体系A中的所述抗⑶3抗体和Retronectin由缓冲液A提供每2ml所述缓冲液A按照如下方法制备将25 μ g Retronectin、5 μ g抗⑶3抗体和浓度为0. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ；
2)所示培养体系B中的所述抗⑶3抗体由缓冲液B提供每2ml所述缓冲液B按照如下方法制备将25 μ g Retronectin和浓度为O. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ；所述培养基为含10% (体积百分含量)离体血浆的T503培养基；所述抗⑶3抗体为单抗或者多抗；所述抗CD3抗体具体为Anti_CD3。所述缓冲液A、所述缓冲液B和所述诱导因子均为独立包装。所述抗⑶3抗体具体为Anti-⑶3。Anti-⑶3为抗⑶3抗体，为单克隆抗体，购自宝日医生物技术(北京)有限公司进口产品，原产地古巴分子免疫学中心，商品名爱欧山，进口药品注册证号S20030084。 所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一物种；所述物种具体为人或动物；所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一个体。本发明的实验证明，本发明的方法中，将RetroNectin引入NK细胞的培养体系，利用NK和NKT细胞同样表达VLA的特点，通过Retronectin的刺激达到细胞大量增殖的效果，⑶3mAb可通过与T细胞表面的TCR结合刺激细胞增殖，由于NKT细胞表面也表达TCR分子，因此在培养体系中，还加入了⑶3mAb刺激细胞增殖。Retronectin和⑶3mAb还可以共同作用激活酪氨酸激酶PP125FAK，通过Ras途径刺激细胞的增殖和分化。因此，将提取自外周血的PBMC经过磁珠分离富集后，获得高纯度的CD56+细胞，在体外培养体系中加入Retronectin和⑶3mAb两种蛋白共同刺激，同时辅以IL-2和IL-15两种因子诱导，建立一个可获得大量具有高杀伤活力的NK和NKT细胞的培养方法。
图I为磁珠富集前外周血⑶3和⑶56细胞表型分析图2为磁珠富集后将用于培养的细胞⑶3和⑶56表型结果图3为细胞培养14天的增值倍数图4为细胞培养14天各组细胞⑶3，⑶16，⑶56表型图5为细胞培养14天各组细胞中NK、NKT、T细胞的比例图6为细胞培养14天各组细胞杀伤实验结果图7为细胞培养14天总细胞的杀伤效率
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、NK细胞的分离和培养I、蛋白包被Retronectin购自宝日医生物技术(北京)有限公司，目录号T200H ；Anti-⑶3为抗⑶3抗体，为单克隆抗体，购自宝日医生物技术(北京)有限公司进口产品，原产地古巴分子免疫学中心，商品名爱欧山，进口药品注册证号S20030084 ；
浓度为O. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液按照如下方法配制将8gNaCl、0. 2g KC1、
I.44g Na2HPO4 和 0. 24g KH2PO4 溶于 1000ml 去离子水中。每2ml包被液A按照如下方法制备将25 μ g Retronectin、5 μ g Anti-Q)3和浓度为O. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液，用PBS缓冲液补至2ml ；每2ml包被液B按照如下方法制备将25 yg Retronectin和浓度为O. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液，用PBS缓冲液补至2ml。在培养前一天分别用包被液A和包被液B包被培养瓶，4°C包被过夜(12h)，得到培养瓶I和培养瓶2。2、PBMCs 的分离I)注射器预吸入Iml肝素，抽取人外周血30ml，得到离体的人外周血。 2)将离体的人外周血，用水平转子离心，2000rpm，20分钟，得到下层的血细胞和上层的血浆，吸取上层血浆，56°C灭活30min，保存于4°C待用，得到自体血浆。用等体积浓度为O. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液重悬下层的血细胞，得到血细胞悬液。3)在50ml离心管中预先加入人淋巴细胞分离液(Ficoll)(购自天津血液研究所，TBD200ml)，按照血细胞悬液Ficoll为2 : I (体积比)的比例将25ml血细胞悬液缓慢加在ficoll上层，保持两种液体之间存在清晰的液面。水平离心，2000rpm，20分钟，吸取中间白色层面的细胞，加入IOml浓度为O. 01M、PH值为7. 2的PBS中，1200rpm离心10分钟，弃去上清。浓度为O. 01M、PH值为7. 2的PBS重复洗涤细胞2次，计数，得到3. 3X IO7个PBMCs。将PBMCs细胞标记⑶3和⑶56抗体(产品均来自美国贝克曼库尔特公司。⑶3即为CD3-ECD目录号頂2705U，单克隆抗体，克隆号UCHTl ;CD56即为CD56-PECY5目录号頂2654U，单克隆抗体，克隆号_01(順1(-1))，41避光孵育301^11。每管加入4ml PBS,1000RPM离心5min，弃上清，细胞用400 μ I PBS重悬，上机流式细胞检测，结果如图I所示，CD56+细胞占 11. 1%ο3.磁珠分选CD56+细胞I)将上述获得的PBMC按每IO7个细胞加入80μ I磁珠buffer和20 μ I标记⑶56磁珠(标记⑶56磁珠及磁珠buffer购自德国美天旖公司。标记⑶56磁珠目录号130-050-401 ;磁珠 buffer 由 MACS BSA Stock Solution (目录号130-0910376)与 MACSRinsing Solution (目录号130-091-222) I 20 混合配得)，4°C孵育 15 分钟。2)加入2ml磁珠buffer, IOOOrpm离心10分钟，弃去上清，调整细胞浓度为2 XlOVml ο3)将磁珠吸附柱(磁珠吸附柱购自德国美天旖公司，目录号130-041-401)置于磁场中，加入Iml磁珠buffer润透吸附柱,缓慢将细胞滴入柱中，加入3ml磁珠buffer洗去未标记⑶56磁珠的细胞。4)吸附柱脱离磁场，加入Iml磁珠buffer，快速推动助推器收集CD56+细胞。5)经过⑶56磁珠阳选后，获得细胞4.6X106个，占总PBMC的13.9%，⑶56+细胞计数为I. 25X 107。将管中收集的细胞标记⑶3和⑶56抗体，4°C避光孵育30min。每管加入4ml PBS,1000RPM离心5min，弃上清，细胞用400 μ I PBS重悬，上机流式细胞检测，结果显示，⑶56+的细胞占到了 99%，其中NK细胞占21%，NKT细胞占78% (图2)。4、接种细胞I)蛋白包被的培养瓶I和培养瓶2分别用PBS小心冲洗3次。2)将步骤3获得的⑶56+细胞分为三组，A组细胞加入未包被的培养瓶3中，加入5ml含10% (体积百分含量)自体血浆的T503培养基(购自宝日医生物技术(北京)有限公司，目录号GT-T503)，调整细胞浓度为5X105/ml，再加入IL-2(购自北京四环生物制药有限公司，终浓度为1000IU/ml)和IL-15 (购自美国Santa Cruz公司，目录号sc-4607,终浓度为20ng/ml)；B组细胞加入蛋白包被的培养瓶2 (接受Retronectin单一蛋白刺激)中，加入5ml含10% (体积百分含量)自体血浆的T503培养基，调整细胞浓度为5 X 105/ml，再加入 IL-2(终浓度为 1000IU/ml)和 IL_15(终浓度为 20ng/ml)；C组细胞加入蛋白包被的培养瓶I (接受Retronectin和Anti-⑶3两种蛋白刺激)中，加入5ml含10% (体积百分含量)自体血浆的T503培养基，调整细胞浓度为5 X105/ml，再加入 IL-2(终浓度为 1000IU/ml)和 IL_15(终浓度为 20ng/ml)；以上3组细胞均放入37°C,5% CO2细胞培养箱中。5、细胞脱瓶I)将上述3组细胞于刺激72小时后反复冲洗培养瓶底将细胞充分吹散成分散状态，并分别计数；2)将3组刺激后的细胞均分别移入无蛋白包被培养瓶中继续培养，37°C，5% CO2细胞培养箱中培养，加入含10% (体积百分含量)自体血浆的T503培养基，调整细胞数为2. 5 XlOVml，再加入 IL-2(终浓度为 1000IU/ml)和 IL-15 (终浓度为 20ng/ml)；3)每两天细胞计数并调浓度为2. 5X105/ml、补液、补因子。经过14天的培养，台盼蓝计数法检测A、B和C三组细胞的扩增倍数，结果如图3所示，培养4、6、8、10、12、14天A组细胞扩增倍数分别为1,2. 14,2. 68,6. 43、10. 57、17. 86 ；培养4、6、8、10、12、14天B组细胞的扩增倍数分别为1,3. 8、17、55、74、97 ;培养4、6、8、10、12、14天C组细胞的扩增倍数分别为1,3. 1,11. 9,47. 62,190,371. 43 ;A、B、C组经过14天的培养的扩增细胞倍数分别为18倍、97倍和371倍。可以看出，B组细胞由于增加了Retronectin的刺激，增殖效果有了明显的提高。C组细胞在接受两种蛋白刺激后，增殖效果较仅接受Retronectin刺激B组又有了较大的提高。将经过14天的培养得到的A、B、C三组细胞分别标记⑶3、⑶16 (即为⑶16-FITC目录号6604894，单克隆抗体，克隆号3G8)和CD56抗体，4°C避光孵育30min。每管加入4ml PBS, 1000RPM离心5min，弃上清，细胞用400 μ I PBS重悬，上机流式细胞检测，结果如图4和图5所示，图4看出，三组细胞培养后绝大多数细胞为NK细胞和NKT细胞。图5看出，A组细胞的NK细胞、NKT和T细胞(非NK样的T细胞群)比例分别为15. 6%,84. 8%,0. 5%；Β组细胞的NK细胞、NKT和T细胞(非NK样的T细胞群)比例分别为27·5%、71·7%、0·6% ;C组细胞的NK细胞、NKT和T细胞(非NK样的T细胞群)比例分别为 5. 4%,89. 9%,4. 5% ；B组细胞与A组细胞相比，NK细胞比例提高，提示Retronectin蛋白具有刺激NK细胞的增殖的作用。促进增殖的机制可能是Retronectin通过结合NK细胞表面的VLA从而刺激其增殖。C组细胞与B组细胞相比，NKT的比例更高，因为Anti-⑶3是通过⑶3-TCR复合物起到协同刺激作用的，因此NKT的增殖更为明显。同时，C组细胞相比较于其他两组。⑶3表达阳性的细胞比例明显提高，其中还出现了 4. 5%的非NK样的T细胞群。这部分细胞可能是在利用磁珠进行分选时掺杂进来的T细胞，在接受了 CD3mAb的刺激后细胞数量被放大产生的。将培养14天得到的A、B、C组细胞分别记作NK_A、NK-B, NK-C细胞。实施例2、NK细胞体外杀伤实验I、准备工作I)提前培养人胰腺癌JF305细胞(可从上海复祥生物科技有限公司购买)和人结肠癌HCTl 16细胞；
2)配置含5% (体积百分比)FBS的无酚红1640培养基；2、调整细胞浓度并加入96孔板中I)PBS洗涤细胞3次，每次IOOOrpm离心5分钟，弃去上清。用含5% (体积百分比)FBS的无酚红1640培养基调整肿瘤细胞JF305浓度为2X 105/ml ；2) PBS洗涤细胞3次，每次1200rpm离心5分钟，弃去上清。依照效靶比为10 1，20 1,40 I的比例用含5% FBS的无酚红1640培养基调整由实施例I得到的NK-A、NK-B、NK-C 细胞浓度均分别为 2X107ml，4X106/ml，8X106/ml ；3)板中加入不同浓度的NK-A、NK-B、NK_C细胞，每孔50ul。4)在已加入NK-A、NK-B, NK-C细胞的孔中分别加入人胰腺癌JF305，每孔50ul。5)加入空白背景对照(加入的是5% FBS无酚红1640)每孔50 μ I。6)补齐体积，不足100 μ I的孔补入50μ I含5% FBS1640培养基。肿瘤细胞和NK细胞共孵育4小时。每孔加入20 μ IMTS标记染色。等待4小时，等颜色有明显梯度差别时酶标仪检测，检测波长为490nm。细胞杀伤率=(ODs^l ODmis)/ODmam X 100%, OD 为吸光值。结果如图6所示，在效靶比为10/1，20/1和40/1时，针对JF-305细胞的杀伤率A组细胞(NK-A)为 14. 6%，29. 6%和 54. 5% ；B 组细胞(NK-B) % 48. 5%, 55. 8%,63. 6% ；C组细胞(NK-C)为22. 9%，47. 5%，62. 6%。14天的细胞表型显示，B组的NK细胞含量较高，因而产生的杀伤效果较明显；另一方面，C组的NK细胞比例低于B组，而NKT比例较高，但NKT的直接杀伤效果不及NK，因此B组能够产生更明显的效果。以上两个因素使体外4小时的杀伤结果为相同数量效应细胞情况下，B组细胞具有最好的杀伤结果。比较总杀伤效率(总杀伤效率=相同细胞时的杀伤效率X扩增倍数)，结果如图7所示，针对JF-305细胞的总杀伤效率A组细胞(NK-A)为14. 64%,29. 63%,54. 47% ；B 组为 48. 54%,55. 75%,63. 6% ；B 组细胞(NK-B)为 14. 64%,29. 63%,54. 47% ；B 组为48. 54%,55. 75%,63. 6% ；C组的总杀伤效率要远远好于其他两组，扩增倍数的优势在这里得到了体现。采用同样的方法检测对HCTl 16细胞杀伤力，结果与对JF-305细胞的趋势相同。
权利要求
1.一种培养NK和/或NKT细胞的方法，包括如下步骤 将离体的NK和/或NKT细胞接种到如下培养体系A中，培养，即得到增殖的NK和/或NKT细胞； 所述培养体系A为如下I)或2): 1)所示培养体系A由抗CD3抗体、Retronectin、培养基和诱导因子组成； 2)所示培养体系A由抗CD3抗体、培养基和诱导因子组成。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于 所述抗⑶3抗体与所述培养基的配比为5 ii g 5ml; 所述Retronectin与所述培养基的配比为25 y g : 5ml ； 所述诱导因子为IL-2和IL-15 ； 所述IL-2在所述培养体系A中的浓度为800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培养体系A中的浓度具体为1000IU/ml ； 所述IL-15在所述培养体系A中的浓度为18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培养体系A中的浓度具体为20ng/ml。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于 1)所示培养体系A中的所述抗CD3抗体和Retronectin由缓冲液A提供 每2ml所述缓冲液A按照如下方法制备将25iig Retronectin、5ii g抗⑶3抗体和浓度为0. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ； 2)所示培养体系B中的所述抗CD3抗体由缓冲液B提供 每2ml所述缓冲液B按照如下方法制备将25iig Retronectin和浓度为0.01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ； 所述培养时间为70小时-74小时，所述培养时间具体为72小时，所述培养温度为350C -38°C，所述培养温度具体为37°C，所述培养所需CO2的浓度为4. 5% -5. 5% (体积百分含量)，所述培养所需CO2的浓度具体为5% (体积百分含量)。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 在所述培养步骤后，还包括如下步骤 将所述培养得到的细胞移入不含有抗CD3抗体和Retronectin的培养体系B中继续培养，得到增殖的NK和/或NKT细胞； 所述培养体系B和所述培养体系A的区别为不含有抗⑶3抗体和Retronectin，其它组分和各组分浓度均相同。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 所述缓冲液A、所述缓冲液B和所述诱导因子均为独立包装。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于 所述培养基为含10% (体积百分含量)离体血浆的T503培养基； 所述抗CD3抗体为单抗或者多抗； 所述抗⑶3抗体具体为Anti-⑶3 ； 所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一物种； 所述物种具体为人或动物。
7.一种用于培养NK和/或NKT细胞的培养体系，所述培养体系A为如下I)或2):1)所示培养体系A由抗CD3抗体、Retronectin、培养基和诱导因子组成； 2)所示培养体系A由抗CD3抗体、培养基和诱导因子组成。
8.根据权利要求7所述的培养体系，其特征在于 所述抗⑶3抗体与所述培养基的配比为5 ii g 5ml; 所述Retronectin与所述培养基的配比为25 y g : 5ml ； 所述诱导因子为IL-2和IL-15 ； 所述IL-2在所述培养体系A中的浓度为800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培养体系A中的浓度具体为1000IU/ml ； 所述IL-15在所述培养体系A中的浓度为18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培养体系A中的浓度具体为20ng/ml。
9.根据权利要求7或8所述的培养体系，其特征在于 1)所示培养体系A中的所述抗CD3抗体和Retronectin由缓冲液A提供 每2ml所述缓冲液A按照如下方法制备将25iig Retronectin、5ii g抗⑶3抗体和浓度为0. 01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ； 2)所示培养体系B中的所述抗CD3抗体由缓冲液B提供 每2ml所述缓冲液B按照如下方法制备将25iig Retronectin和浓度为0.01M、PH值为7. 2的PBS缓冲液混合，用所述PBS缓冲液补至2ml ； 所述培养基为含10% (体积百分含量)离体血浆的T503培养基； 所述抗CD3抗体为单抗或者多抗； 所述抗⑶3抗体具体为Anti-⑶3。
10.根据权利要求7-9中任一所述的培养体系，其特征在于 所述离体的血浆与所述离体的NK和/或NKT细胞来源于同一物种； 所述物种具体为人或动物。
全文摘要
本发明公开了一种培养NK和/或NKT细胞的方法。本发明提供了一种培养NK和/或NKT细胞的方法，包括如下步骤将离体的NK和/或NKT细胞接种到如下培养体系A中培养，即得到增殖的NK和/或NKT细胞；所述培养体系A由含有抗CD3抗体和/或Retronectin的缓冲液和诱导因子组成。本发明的实验证明，将提取自外周血的PBMC经过磁珠分离富集后，获得高纯度的CD56+细胞，在体外培养体系中加入Retronectin和CD3mAb两种蛋白共同刺激，同时辅以IL-2和IL-15两种因子诱导，建立一个可获得大量具有高杀伤活力的NK和NKT细胞的培养方法。
文档编号C12N5/0783GK102676453SQ20111023550
公开日2012年9月19日 申请日期2011年8月16日 优先权日2011年3月17日
发明者赵平, 赵晨, 马洁 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所