专利名称：一种肝素黄杆菌软骨素酶b和软骨素酶ac的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种软骨素酶B和软骨素酶AC的制备方法，尤其涉及一种由氯化钙全程保护之下、并含肝素和硫酸皮肤素缓冲液洗脱的特殊层析分离技术制备软骨素酶B和软骨素酶AC的方法。
背景技术：
软骨素(⑶)是糖胺聚糖的一类，由已糖醛酸-乙酰化半乳糖胺重复组成长链骨架。依糖链硫酸化程度可分成7小类未硫酸化软骨素(无硫酸基)、多硫酸软骨素(完全硫酸化)、硫酸软骨素A-E，后5种在硫酸化位点和硫酸化程度上各有不同。其中软骨素A、 B、C是最常见的3种，而软骨素B又被称作硫酸皮肤素(此)。这些软骨素类可能参与调节多种生理环节如细胞分化、细胞结合、激素作用等。软骨素酶是一类能特异性降解软骨素多糖链的酶，可以由此探索软骨素在胞内的生理作用并研究开发用于临床治疗的药物。软骨素酶最早的研究大概起自1957年，Korn等从肝素黄杆菌(FlavcAac terium heparinum)中分离出可降解硫酸软骨素的活性部分。1975年，日本学者Manabu等从自然生境中筛选出253种产软骨素酶的细菌，分别归属于七个属Aeromonas (气单胞菌属)，Vibrio (弧菌属)，Flavobacterium (黄杆菌属)， Beneckea, Proteus, Micrococcus (微球菌属),Arthrobacter (节杆菌属)。发现其中一禾中气单胞菌产软骨素酶AC的能力远高于肝素黄杆菌，纯化后比活为99. 7U/mg。Takegawa等(1991)报道了一种分离自金色细菌的可降解CS A、C的酶，分子量约 82000，铜离子是其抑制剂。Linn等(1985)报道两种可降解CS A、C的酶，分离自Bacteroides thetaiotaomicron，分子量分别为 104000 和 108000。加拿大IBEX公司是近些年研究、开发、销售肝素黄杆菌软骨素酶的主要机构。1995年IBEX的一篇文章中披露一种纯化工艺通过鱼精蛋白沉淀、QAE柱层析、 HA-HPLC, Gel-HPLC等步骤纯化出软骨素AC酶，可降解软骨素A、C，分子量77000，比活 68-lllU/mg，纯化倍数1900-3700倍；通过阳离子交换层析、硫酸纤维素柱层析、HA柱层析、强阳离子交换柱层析、凝胶过滤层析等步骤纯化出软骨素B酶，可降解软骨素B，分子量 55000，比活278U/mg，纯化倍数471倍。在2000年的一篇专利中，IBEX将前一种纯化工艺做修改，采用细胞破碎、阳离子交换层析、亲和层析、HA柱层析、高效离子交换柱层析和凝胶过滤层析等一套步骤纯化出两种软骨素酶，软骨素AC酶比活提高到211. 4U/mg,软骨素B酶比活278. 7U/mg。本发明给出一种同时制备纯化出软骨素酶B和软骨素酶AC的方法，在氯化钙保护之下、并含肝素和硫酸皮肤素缓冲液洗脱的多步层析分离技术，最终制备软骨素AC酶比活提高到220. 8U/mg，软骨素B酶比活为724. 2U/mg，均高于已有报道。方法高效、可重复，所得酶纯度极高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种软骨素酶B和软骨素酶AC的制备方法，该方法可同时纯化出2种酶，制备的软骨素AC酶比活提高到220. 8U/mg,软骨素B酶比活为 724. 2U/mg,。与已报道方法相比，软骨素B酶比活增加近两倍，软骨素AC酶比活也高于最高报道。本发明包括下述顺序的步骤(1)肝素黄杆菌的发酵将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23°C， 150rpm，培养1天。然后按5 %接种量接入发酵培养基，23°C，150rpm，培养2-3天。菌液 10000rpm，4°C离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在100ml、50mM Tris-HCl①缓冲液中，冰浴超声1小时(150W，5s，5s)。4°C，10000rpm，离心30min，上清即为粗酶液。(2)粗酶液的硫酸铵沉淀法粗纯化向粗酶液中加硫酸铵至45%饱和度，4°C沉淀1小时，lOOOOrpm，离心30min，向上清继续加硫酸铵至65%饱和度，4°C沉淀1小时，lOOOOrpm，离心30min，取沉淀溶于含硫酸铵45%饱和度的Tris-HCl@缓冲液；得粗纯化液。(3)粗纯化液的OCITL柱分离将步骤⑵所得粗纯化液上一根用含硫酸铵45%饱和度的Tris-HCl 缓冲液平衡过的OCTYL柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中含硫酸铵线形梯度45% -0 饱和度，分别收集洗脱液中具有软骨素酶B活性和软骨素酶AC活性的洗脱液，该两个洗脱液呈两个活性峰I、II ；(4)软骨素酶B的纯化步骤( 活性峰I的洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl@缓冲液平衡过的SP 柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度 0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有软骨素酶B活性的组分，透析后上一根用TriS-HCl@缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl 缓冲液中含氯化钠线形梯度 0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HCl@缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到软骨素酶B。(5)软骨素酶AC的纯化活性峰II洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl@缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱， 收集洗脱液中具有软骨素酶AC活性的组分，透析后上一根用Tris-HCl 缓冲液平衡过的SP 柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl 缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩， 得到软骨素酶AC。其中，步骤⑴所述的种子培养基的组成为牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母粉0. 5%, NaCl 为 0. 5%, pH7. 0。步骤(1)所述的发酵培养基组成(g/L)为硫酸皮肤素8，K2HP042. 5，NaH2P042. 5， NH4Cl 2. 0，MgCl2 0. 5，组氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素(NaMoO3, CuCl2, FeCl2, CoCl2, MnCl2, CaCl2, IX IO^4M) ο步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)所述Tris-HCl@②缓冲液含 IOmM CaCl2, ρΗ6· 5-8. 0， 优选ρΗ范围为7. 0-7.5。步骤(4)所述Tri s_HCl 缓冲液含氯化钠5_75mM、含肝素0. 01-0. 5%，氯化钠含量的优选范围为25-45mM，肝素含量的优选范围为0. 1-0. 2%，肝素的种类优选为高纯度肝
ο步骤( 所述Tris-HCl④缓冲液含氯化钠5_75mM、含硫酸皮肤素0. 01-0. 5%，氯化钠含量的优选范围为25-45mM，硫酸皮肤素含量的优选范围为0.01-0. 1%，硫酸皮肤素的种类优选为高纯度硫酸皮肤素。本发明还包括以下内容(6)软骨素酶B活性测定在5ml石英比色皿中加入在30°C预热过的2. 5ml硫酸皮肤素浓度为 lmg/ml 的 Tris-HCl@ (50mM，含 CaCl2 IOmM, pH7. 0)缓冲液，移取 5-20 μ 1 酶液，摇勻后在232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性(IU/ml)。(7)软骨素酶AC活性测定在5ml石英比色皿中加入在30°C预热过的2. 5ml硫酸软骨素浓度为 lmg/ml 的 Tris-HCl@ (50mM，含 CaCl2 IOmM, pH7. 0)缓冲液，移取 5-20 μ 1 酶液，摇勻后在232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性(IU/ml)。(8)蛋白质测定向5ml考马斯亮蓝溶液中加蛋白0. 1ml，摇勻，测定A595，根据标准曲线换算蛋白浓度本发明所述制备方法中，所有纯化步骤都含有CaCl2,这在纯化过程中有助于保持酶的稳定。软骨素酶B经过纯化最终得到比活高达724. 2IU/ml的酶，整个过程活性收率为 32%，提纯了 568倍，从IL发酵液的菌体中得到189IU的软骨素酶B纯酶。软骨素酶AC经过纯化最终得到比活高达220.8IU/ml的酶，整个过程活性收率为46%，提纯了 204倍，从 IL发酵液的菌体中得到231IU的软骨素酶AC纯酶。与已报道方法相比，两种酶尤其是软骨素酶B比活都有提高，两种酶纯化工艺活性收率也远高于已有报道的最高值。本发明所述制备方法，还具有工艺简单、结果易重复的特点，可放大后用于工业大规模制备高纯度软骨素酶B、AC。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1 a、将肝素黄杆菌接到50ml种子培养基中，23°C，150rpm，培养1天；b、按5%接种量接入IL发酵培养基，23°C，150rpm，培养2-3天，4°C，10000rpm，离心15-30分钟，收集沉淀；C、沉淀悬浮在100ml、50mM的1~1^8-!1(1@缓冲溶液中，冰浴超声1小时，4°C，
6IOOOOrpm,离心30min，将上清以硫酸铵做45% -65 %饱和度区段沉淀，沉淀溶于含硫酸铵 45%饱和度的Tris-HCl@缓冲液；d、上一根用含硫酸铵45%饱和度的Tris-HCl @缓冲液平衡过的OCITL柱，以同样的缓冲液平衡3个柱体积，以Tris-HCl@缓冲液中含硫酸铵线形梯度45% -0饱和度洗脱， 收集洗脱液中具有软骨素酶B活性和软骨素酶AC活性，呈两个活性峰(I、II)分布的若干管；e、活性峰I洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl 缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱， 收集洗脱液中具有软骨素酶B活性的组分，透析后上一根用Tris-HCl @缓冲液平衡过的SP 柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl@缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，冷冻保藏。f、活性峰II洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl@缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M 洗脱，收集洗脱液中具有软骨素酶AC活性的组分，透析后上一根用Tris-HCl 缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl 缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M 洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HCl②缓冲液平衡过的 SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度 0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，冷冻保藏。其中，所述步骤a中所述种子培养基的组成为牛肉膏0. 5%、蛋白胨1%、酵母粉 0. 5%, NaCl 为 0. 5%,pH7. 0。步骤b中所述发酵培养基组成为硫酸皮肤素8，K2HPO4 2. 5，NaH2PO4 2. 5，NH4Cl 2. 0，MgCl2 0. 5，组氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素 NaMo03、CuCl2, FeCl2, CoCl2, MnCl2, CaCl2 各 1 X 1(Γ4Μ，单位为 g/L。所述Tri-s-HCl @缓冲液含 IOmM CaCl2、ρΗ6· 5-8. 0。所述Tri-s-HCl ②缓冲液含 IOmM CaCl2、ρΗ6· 5-8. 0。所述Tri-s-HCl 缓冲液含氯化钠5_75mM、含肝素0. 01-0. 5%，肝素的种类为高纯
度肝素。所述Tri-s-HCl 缓冲液含氯化钠5_75mM、含硫酸皮肤素0. 01-0. 5%，硫酸皮肤素的种类为高纯度肝素。
权利要求
1.一种肝素黄杆菌软骨素酶的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)肝素黄杆菌的发酵将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23°C，150rpm，培养1天。然后按5%接种量接入发酵培养基，23°C，150rpm，培养2-3天。菌液lOOOOrpm，4°C 离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在100ml、50mM Tris-HCl①缓冲液中，冰浴超声1小时， 4°C，lOOOOrpm，离心30min，上清即为粗酶液；(2)粗酶液的硫酸铵沉淀法粗纯化向粗酶液中加硫酸铵至45%饱和度，4°C沉淀1小时，lOOOOrpm，离心30min，向上清继续加硫酸铵至65%饱和度，4°C沉淀1小时，lOOOOrpm，离心30min，取沉淀溶于含硫酸铵 45%饱和度的Tris-HCl①缓冲液；得粗纯化液；(3)粗纯化液的OCITL柱分离将步骤( 所得粗纯化液上一根用含硫酸铵45%饱和度的Tris-HCl①缓冲液平衡过的OCTYL柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中含硫酸铵线形梯度45% -0饱和度，分别收集洗脱液中具有软骨素酶B活性和软骨素酶AC活性的洗脱液，该两个洗脱液呈两个活性峰I、II ；(4)软骨素酶B的纯化步骤( 活性峰I的洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl①缓冲液平衡过的SP柱， 以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M 洗脱，收集洗脱液中具有软骨素酶B活性的组分，透析后上一根用Tris-HCl @缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl 缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M 洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HCl②缓冲液平衡过的 SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度 0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到软骨素酶B;(5)软骨素酶AC的纯化活性峰II洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HClt^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有软骨素酶AC活性的组分，透析后上一根用Tris-HCl 缓冲液平衡过的SP柱， 以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl④缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩， 得到软骨素酶AC。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤a中所述种子培养基的组成为牛肉膏 0. 5%、蛋白胨 1%、酵母粉 0. 5%, NaCl 为 0. 5%,pH7. 0。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b中所述发酵培养基组成为硫酸皮肤素 8，K2HPO4 2. 5，NaH2PO4 2. 5，NH4Cl 2. 0，MgCl2 0. 5，组氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素 NaMo03、CuCl2, FeCl2, CoCl2, MnCl2, CaCl2 各 1 X 1(Γ4Μ，单位为 g/L。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述Tris-HCl@缓冲液含IOmMCaCl2,pH6. 5-8. O。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述Tris-HCl@缓冲液含IOmMCaCl2, ρΗ6· 5-8. O。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述Tris-HClc^l冲液含氯化钠 5-75mM、含肝素0. 01-0. 5%，肝素的种类为高纯度肝素。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述Tris-HCl 缓冲液含氯化钠 5-75mM、含硫酸皮肤素0. 01-0. 5 %，硫酸皮肤素的种类为高纯度肝素。
全文摘要
本发明提供了一种肝素黄杆菌软骨素酶B和软骨素酶AC的制备方法，以肝素黄杆菌为原料，将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养、再接到发酵培养基发酵、离心收集沉淀、沉淀超声破碎、离心得到肝素黄杆菌软骨素酶B和软骨素酶AC的粗酶液，先将粗酶液通过一次硫酸铵沉淀去除部分杂质，然后通过OCTYL-Sepharose FF层析分离为酶B和酶AC两部分，再将酶B和酶AC分别各过三次SP-Sepharose FF纯化，得到高纯度的软骨素酶B和软骨素酶AC。
文档编号C12R1/20GK102277345SQ201110241259
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者史绍鹏, 李锂, 马小来 申请人:深圳市海普瑞药业股份有限公司