专利名称：一种鸭瘟病毒检测用引物组及其构成的lamp反应体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鸭瘟病毒检测用引物组及其构成的LAMP反应体系。
背景技术：
鸭瘟(Duck Plague，DP)，又名鸭病毒性肠炎，是由鸭肠炎病毒(Duck Enteritis virus, DEV)引起的鸭、鹅、天鹅等雁形目禽类的一种急性败血性及高度致死性的病毒性传染病。鸭瘟病毒属疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科，球形有囊膜，直径约为160 180 nm，衣壳为二十面体对称，是一种泛嗜性感染的病毒(Kaleta，1990)。该病毒主要由核心(core)、 衣壳(capsid)、外膜(tegument)、囊膜(envelope)四部分组成，病毒核酸为线状、双股DNA。 衣壳的形态结构具有疱疹病毒的重要特征，它由162个相互连接呈放射状排列且有中空轴孔的壳粒组成。核衣壳穿过宿主细胞核膜进入胞浆或其空泡中，外面包上一层由蛋白质组成的外膜，最后绕以囊膜形成成熟的子病毒(陈建君，2003)。病毒的囊膜表面无红细胞凝集素，不具血凝特性和血细胞吸附作用。鸭瘟病毒对热敏感，56 °C作用10 min会丧失感染力， 80 °C作用5 min即可死亡。此外，该病毒对乙醚和氯仿敏感。用胰蛋白酶和脂肪酶等处理能使病毒部分失活或者完全失活，在PH值为3的酸性和pH值为11的碱性环境中也很快失活。鸭瘟分布广泛，具有传播迅速、发病率高和死亡率大的特点。1923年Baudet首次报道荷兰的家鸭暴发鸭瘟后，各养鸭国家和地区陆续报导有该病的发生和流行。我国于 1957年首次报道暴发鸭瘟，随后该病在华南、华中和华东等养鸭较多的地区开始流行，是严重威胁养鸭业发展的重要传染病之一。鸭瘟潜伏期约2 5d，临诊特征为病初体温升高，两脚发软无力，绿色下痢，流泪； 食道黏膜有小出血点，并有灰黄色假膜覆盖或溃疡，泄殖腔黏膜充血、出血、水肿和坏死；肝脏有大小不等的坏死灶及出血点；部分病鸭可见头颈部粗肿，俗称“大头瘟”。病鸭后期体温下降，衰竭死亡，死亡率可达90%以上，少数耐过的病鸭表现为生长不良和消瘦，眼角膜混浊或形成角膜溃疡而失明(王春雨，2008 )。病毒可在9 14 d鸭胚中生长繁殖，并可引起胚胎死亡。致死的胚体出血，水肿，肝出血、坏死，部分绒毛尿囊膜上有灰白色坏死灶。病毒适应鸭胚后也可感染鸡胚，可在鸭胚成纤维细胞和鸡胚成纤维细胞中增殖传代，产生蚀斑并形成核内包涵体(董嘉文等， 2009)。快速准确地诊断病原是控制鸭瘟流行的前提。鸭瘟病毒只有一种血清型，虽然各毒株之间的毒力存在差异，但在免疫学特性上都高度近似(董嘉文等，2009 )。适用于鸭瘟病毒常规的血清学诊断方法主要有病毒分离与中和试验、酶联免疫吸附测定、间接血凝试验等方法，但这些检测技术都不同程度地存在实验周期长、实验操作复杂、敏感性低、检出率不高等缺陷，加之鸭瘟感染病程发展迅速，急需建立更加快速、特异和敏感的检测方法
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种鸭瘟病毒检测用引物组。本发明的另一目的是提供由上述引物组构成的环介导等温扩增(LAMP)反应体系。本发明通过以下技术方案实现上述目的 一种鸭瘟病毒检测用引物组，具体组成如下 正向外侧引物F3 =SEQ ID N0:1 ；
反向外侧引物B3 =SEQ ID NO:2 ； 正向内侧引物FIP :SEQ ID NO:3 ； 反向内侧引物BIP :SEQ ID N0:4。本发明所述鸭瘟病毒，是指鸭肠炎病毒(Duck Enteritis virus，DEV)。以上引物组是通过Blast、MegAlign和DNAMar程序筛选出的DEV UL6蛋白基因的保守序列(GenBank: AY995224. 1, 2198-2435)作为模板，用 Primer Explorer V4 软件设计所得。该引物组包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)，内引物FIP由Flc (TCCAGAGGATGGTTTGTCCCGT,SEQ ID N0:5)禾口 F2 (ATGTATCATGGACGGCGGT,SEQ ID NO:6)组成，为利于后续扩增产物的酶切鉴定，BIP由Blc(CAGCGAGTGGGAACGAAAAGC，SEQ ID NO: 7)、 B2 (TCGCACATTAGACGCGGTATC, SEQ ID NO 8)禾口 GAATTC (.EcoR I 酶切位点序列)作为连接子组成。鸭瘟病毒的引物设计比较复杂，且对引物扩增区的要求较高。所以引物设计没有普通引物设计简单，要设计出优良的引物，需要在各种生物信息软件评估的基础上进行费时的筛选。由于所设计的引物具有高度的选择特异性，在进行病原检测时，要求引物所针对的靶序列位点应该相当保守，这样所建立的方法才具有适用性。研究中也可以设计一些兼并引物以增强其应用的广泛性，但兼并度高的引物会对扩增反应造成负面影响。靶序列长度应控制在200 bp左右，才有利于扩增反应的进行，过长会给反应起始物的形成与后期循环反应带来困难，有时甚至在1 h内没有明显扩增。对于一些具有GC含量高、变异性强、保守区离散等特点的目的序列，没有办法设计出非常适用的引物，使LAMP技术的应用受到限制。由于LAMP产物的独特性给线性双链DNA的分离增加了难度，更加有效的分离方法有待于进一步的研究。产物电泳图为梯状拖带图样，一旦出现非特异性扩增就不易被察觉， 所以用限制性内切酶进行鉴定就显得十分必要。该技术非常适用于鉴定某种基因的存在， 但扩增产物对于基因克隆与测序意义不大。因此，在分子生物学领域，LAMP技术在疾病诊断、性别鉴定与食品安全有着比常规PCR技术更出色的表现，但在很多方面，如基因序列确定、文库建立，是无法取代传统PCR技术的。一种检测鸭瘟病毒的LAMP反应体系，其特征在于该反应体系包括反应缓冲液 (200 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 100 mM (NH4)2SO4, 1% Triton X-100)， dNTPs (包括等比例的 dATPs、dTTPs、dGTPs 和 dCTPs)，上述引物组(F3、B3、FIP 和 BIP)，Mg2+ (一般用MgSO4),甜菜碱(Betaine)，Bst DNA聚合酶，待检样品基因组DNA和去离子水。Mg2+稳定碱基配对，维持聚合酶的反应活性都有重要作用，它对LAMP的影响方式与PCR的相同，浓度太高或太低都使反应无法进行或时间延长同时反应过程中焦磷酸镁沉淀的析出使反应体系中Mg2+的浓度不断下降，因此摸索Mg2+最佳浓度很有意义。经过多次试验筛选，LAMP反应体系中Mg2+浓度优选4 7 mM，最佳为5 mM。甜菜碱浓度最佳为0. 4 M0 dNTPs 浓度为 1. 2 mM(即 dATPs、dTTPs、dGTPs 和 dCTPs 的浓度均为1. 2 mM)。作为一种优选方案，本发明的LAMP反应体系为每25PL中含有以下组分 IO反应缓冲液2.5 pL
dNTPs (10 mM)3 μ
FIP (10 μΜ)2“L
BP (10 μΜ)2 μ
F3 (10 μΜ)0.5 pL
Β3 (10 μΜ)0.5 pL。
MgSO4 (25 mM)3 μ
甜菜碱(0.4 Μ)2.5 μ!
Bst DNA 聚合贿1 μΙ-
待检样品基因组DNA1 μ ·
去离子水加至25 μ ο本发明的检测鸭瘟病毒的LAMP反应体系的使用方法，优选反应温度为62°C，反应时间为50 mim。本发明的反应体系可以进行简化的反应步骤，即将反应体系所需各组分混合完毕，放置于恒温水浴锅进行反应。反应完毕后可凭借液体浑浊度肉眼判定扩增结果，浑浊管伟阳性，清亮管为阴性，也可加入STOR Green I进行核酸染色，亮绿色为阳性，保留染料初始棕红色为阴性。简化步骤中反应体系最好用前现配，避免反应缓冲液失效造成假阳性。为避免反应产物挥发带来交叉污染和残留污染，反应体系配置完毕后每管添加惰性液体矿物油30 μ L，以起到液封反应液的作用。上述LAMP反应体系用于检测鸭瘟病毒可以通过在反应产物中加入荧光显色剂 SYBR green I，根据反应颜色直接观察，如果反应产物溶液变为草绿色，则检测结果为阳性，表明有鸭瘟病毒，如果反应产物溶液为橙黄色，则为阴性。或者将反应产物进行电泳，如果电泳结果在195 bp, 255 bp和310 bp处出现条带，则检测结果为阳性。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
(1)只需要在恒定温度下就能进行扩增反应，可以直接使用水浴锅进行反应。不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸等变温过程。(2)高特异性应用四条引物识别目的片段的六个区域，并且这六个区域的顺序、 长短、退火温度都有相应要求。理论上LAMP法扩增的特异性很高，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，可应用于遗传背景相似的细菌或病毒的分型定性检测。(3)扩增反应快速、高效整个扩增在不到1 h即可完成，且产率可达到0. 15 mg/ mL。为提高LAMP反应的速度。
(4)灵敏度高扩增模板可达10拷贝，比常规PCR法高1至3个数量级。本研究中，LAMP方法比PCR方法要敏感100倍。(5)步骤简单扩增DNA可在反应体系配置完毕后放置恒温水浴锅进行反应，扩增RNA只要在DNA基因扩增试剂的基础上加上逆转录酶，进行短暂的反转录时间后就能够完全如DNA基因扩增一样，一步法实现RNA扩增(Hiroko et al. ,2006 ；Soliman et al.， 2006 ；Kazuya et al.，2007)，RT-LAMP反应同样不需PCR仪和其他特殊试剂。(6)鉴定简便在核酸大量合成时，添加核酸染色剂STOR green I，可根据反应液颜色变化直观明了地判定实验结果。高效扩增反应时产生的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸镁沉淀)，通过肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能够判断扩增与否。虽然仅靠这些判断并不准确，也不能排除非特异性扩增，但结果的可视观察可以脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制，加上扩增是等温进行，不用依赖PCR仪复杂的循环温度变化来完成，在水浴锅中就能进行，这些都使该技术在小型研究所、兽医站乃至普通养殖户有着更广阔的应用前景。
图1 DEV UL6基因保守区LAMP扩增电泳图，M =DNA分子量标准DL2000 ；1为DEV 弱毒苗株的扩增结果；2为阴性对照。图2.自然光下LAMP产物的沉淀可视结果，a为阳性扩增产物管，显浑浊；b为阴性对照。图3.自然光下LAMP产物添加核酸染料变色结果，其中a为阳性扩增产物管，显示草绿色；b为阴性对照，显示橙黄色。图4.在不同反应温度下LAMP扩增产物的电泳图，M :DNA分子量标准DL2000 ；泳道1 5依次分别为在61 0C >62 0C >63 °C >64 °C >65 °C条件下DEV基因DNA的LAMP扩增产物；N为阴性对照。图5.选择不同Mg2+浓度时LAMP扩增产物的电泳结果图，M :DNA分子量标准 DL2000 ；泳道 1 8 从左到右依次是 MgSO4 浓度为 7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、l mM、 0 mM时的LAMP扩增；N为阴性对照。图6.选择不同甜菜碱浓度的LAMP扩增产物的电泳结果图，M =DNA分子量标准 DL2000 ；泳道1 6依次是甜菜碱浓度为0 M、0. 2 M、0. 4 M、0. 6 M、0. 8 M、1 M时的LAMP扩增；N为阴性对照。图7.选择不同dNIPs浓度时LAMP扩增产物的电泳结果图，M =DNA分子量标准 DL2000 ；泳道 1 6 依次是MgSO4 浓度为 1. 6 mM、1.4 mM、1.2 mM、1.0 mM、0. 8 mM、0. 6 mM 时的LAMP扩增；N为阴性对照。图8.不同反应时间LAMP扩增产物的电泳结果图，M :DNA分子量标准DL2000 ；泳道1 4分别为DEV基因在反应60 min、50 min、40 min、30 min后的LAMP扩增结果，N为阴性对照。图9. DEV LAMP反应特异性试验电泳结果图，M:DNA分子量标准DL2000 ；泳道1 6从左到右分别为DEV LAMP引物检测DEV、MDV、MDPV, DHV I、H9 AIV和MDRV的结果。图10. DEV LAMP反应产物的酶切鉴定电泳图，M:DNA分子量标准DL2000 ；泳道1
6为终产物；2为内切酶I消化后的结果。图11. DEV LAMP反应的灵敏度试验电泳图，M =DNA分子量标准DL2000 ；图a泳道 Γ8分别为模板稀释至ΙΟ—^ΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟ—^ΙΟ—8倍的LAMP检测结果，图b泳道1 8分别为模板稀释至10人10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7、10_8倍的常规PCR检测结果。
具体实施例方式以下实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验试剂和常规操作步骤。实施例1鸭瘟病毒获取及鉴定 1.材料
1.1病毒和病料
鸭瘟弱毒疫苗株由广东温氏食品集团禽病室提供。对照病原禽传染性喉气管炎阳性毒株(ILTV)、番鸭细小阳性毒株(MDPV)、H9亚型禽流感病毒抗原(H9 AIV)、鸭病毒性肝炎I型毒株(DHV I )和番鸭呼肠孤病毒株(MDRV) 为华南农业大学动物科学学院家禽研究室分离保存。15份病死鸭及发病鸭内脏组织由中山兽医防疫监督所、广东温氏食品集团莆田分公司提供。1. 2 鸭胚
13 14日龄非免疫鸭胚由广东温氏食品集团莆田分公司提供。1. 3主要试剂
Bst DNA聚合酶(8 U/μ L)及配套缓冲液为NEB公司产品；AMV反转录酶(5 U/yL)、 HRP RNA 酶抑制剂(40 U/μ L)及相应缓冲液、Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μ L), dNTPs (2.5 mM each)、^boR I (15 U/μ L)、DNA Marker DL 2000 均为 TaKaRa 产品。DNA Mark DL 2000 :2000、1000、750、500、250、100 bp。DNA提取试剂盒ChargeSwitch gDNA为hvitrogen公司产品；RNA提取试剂 TRIzol ReagentShvitrogen公司产品；DEPC和饱和酚购自上海生工生物工程公司；甜菜碱betaine购自Sigma公司；10000 X STOR Green I购自百维信生物科技有限公司；氨苄青霉素、链霉素、溴化乙锭(EB)购自宝泰克生物科技有限公司；琼脂糖购自基因有限公司。1. 4常用溶液
PBS 缓冲溶液(pH 7. 2) =KH2PO4 0. 2 g, Na2HPO4 · 12H20 2. 85 g, NaCl 8 g，KCl 0.2 g 力口超纯水定容至1000 mL。无RNA酶的DEPC水按1 1000的比例将DEPC加入超纯水，室温放置12 h以上，
高压灭菌。50XTAE =Tris 碱 M2 g, Na2EDTA 37. 2 g，冰醋酸 57. 1 mL，加超纯水定容至 1000 mL。使用液为IX TAE溶液。1. 5主要仪器及设备
PCR Express Gradient PCR仪，法国HYBAID公司产品；水浴锅，上海一恒科技有限公司产品；凝胶成像及分析系统，法国VL产品；Allegra TM 64R centrifuge台式高速冷冻离心机，BECKMAN公司产品；AIR-TECH医用超净工作台，上海沙泸净化设备厂产品；METTLER TOLEDO AB204-E分析天平，梅特勒托利多仪器，上海有限公司。
2.方法与结果
2. 1病毒分离鉴定病毒分离与繁殖
病死鸭与发病鸭肝脾组织加无菌IXPBS漂洗去除多余血液与杂物，加液氮研磨成糜， 加入含青霉素2000 IU/mL、链霉素1000 IU/mL的PBS制成20% (W/V)悬液，反复冻融三次，37 °C作用30 min,5000 rpm离心10 min，取上清0. 2 mL以尿囊腔途径接种14日龄未免疫的鸭胚，0.2 mL/胚，每病料接种两个胚蛋，另设两胚接种0.2 mL PBS作为对照，随后放置在38 ！恒温箱继续孵育，每隔12 h照蛋1次，弃去对h内死亡胚蛋，无菌收获72 96 h内感染胚尿囊液，用于核酸抽提，然后用PCR法进行鉴定，余下-80 °C保存备用。结果病料上清液接种于30枚鸭胚，24 h内无鸭胚死亡，48 h后陆续死亡，主要集中于接种后3 5 d，最终死亡率达100 %，接种PBS胚体发育正常。将死胚置4 °C冰箱过夜，收取尿囊液。死亡胚的胚液清亮，绒毛尿囊膜增厚，有出血点，胚体全身出血。病毒鉴定的提取
总DNA的提取使用ChargeSwitch gDNA试剂盒(美国)。提取出的DNA片段置于100 μ 洗脱缓冲液并储存在-20 °C，备用。具体操作过程如下
(1)先将250μ 尿囊液加200 μ L缓冲液GA，振荡至彻底悬浮；
(2)加入20μ L蛋白酶K (20 mg/μ L)，混勻，进行下一步；
(3)加入220μ L缓冲液GB，充分颠倒混勻，70 °C放置10 min，简短离心以除去管盖内壁的水珠；
(4)加220μ L无水乙醇，充分振荡混勻15 sec，简短离心以除去管盖内壁的水
珠；
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000 rpm离心1 min倒掉废液，吸附柱CB3放回收集管中；
(6)向吸附柱CB3中加入500 μ L去蛋白液⑶，12000 rpm离心1 min，弃废液，吸附柱 CB3放回收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入700μ L漂洗液PW，12000 rpm离心1 min，弃废液，吸附柱CB3放回收集管中；
(8)向吸附柱CB3中加入700μ L漂洗液PW，12000 rpm离心1 min，弃废液；
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2 min。将吸附柱CB3置于50 V 恒温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μ L 经65 70 ！水浴预热的洗脱缓冲液ΤΕ，室温放置2 5 min, 12000 rpm离心30 sec ；
(11)离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min, 12000 rpm离心^iiin。抽提所得到的病毒DNA样品保存于-20 °C冰箱。运用PCR技术鉴定DEV
所用弓丨物对 DEV-F :5，-GTAGACGAAGGCGGGTATG-3，(SEQ ID NO:9)与 DEV-R 5‘-CGTATTGGTTTCTGAGTTGG-3‘ (SEQ ID NO: 10)针对鸭癌病毒UL31基因设计，理论扩增产物长度为563 bp。PCR反应体系(20 μι)包括1 μ DNA模板，0.25 mM DEV上下游引物，2μ 10XPCR buffer, 2. 5 mM dNTPs mixture (1 μ ), 15. 5 μ ddH20 和 1· 5 U Ex Taq DNA 聚合酶。PCR反应程序为94 °C预变性3 min ；94 °C变性40 sec,53 °C退火40 sec,72 V 延伸40 sec，共反应30个循环；随后进行72 °C延伸10 min。结果以30枚病死鸭胚与正常鸭胚尿囊液抽提的DNA为模板进行PCR鉴定，结果判定有6个病样接种胚(12枚鸭胚)呈现阳性，初步判定获得6株鸭瘟病毒。实施例2鸭瘟病毒LAMP检测方法的建立引物设计与合成
通过Blast、MegAlign和DNAMar程序选择了鸭瘟病毒UL6蛋白基因的保守段，并应用 Primer Explorer V4软件分别设计4条引物，其中包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)，内引物FIP由Flc、F2组成，为利于后续扩增产物的酶切鉴定，BIP由Blc、 B2和GAATTC CFcoR I酶切位点序列)作为连接子组成。本试验还利用了诊断鸭瘟病毒的 PCR引物对DEV-F与DEV-R，用于PCR检测方法与新建立LAMP检测方法的比较，所有引物由北京奥科生物工程公司合成。合成后的引物用超纯水稀释成10 mmol/mL溶液，-20 ！保存。引物序列如下
表1. 1 DEV检测用LAMP引物
权利要求
1.一种鸭瘟病毒检测用引物组，其特征在于，所述引物组组分如下正向外侧引物F3 =SEQ ID N0:1 ；反向外侧引物B3 =SEQ ID NO:2 ；正向内侧引物FIP :SEQ ID NO:3 ；反向内侧引物BIP :SEQ ID N0:4。
2.一种检测鸭瘟病毒的LAMP反应体系，其特征在于该反应体系包括反应缓冲液， dNTPs，权利要求1所述引物组，Mg2+，甜菜碱，Bst DNA聚合酶，待检样品基因组DNA和去离子水。
3.根据权利要求2所述检测鸭瘟病毒的LAMP反应体系，其特征在于LAMP反应体系中 Mg2+浓度为5 mM。
4.根据权利要求2所述检测鸭瘟病毒的LAMP反应体系，其特征在于LAMP反应体系中甜菜碱浓度为0. 4 M0
5.根据权利要求2所述检测鸭瘟病毒的LAMP反应体系，其特征在于LAMP反应体系中 dNTPs终浓度为1. 2 mM。
6.根据权利要求2所述检测鸭瘟病毒的LAMP反应体系，其特征在于每25PL中含有以下组分10 X 反应缓冲液 2. 5 μ , dNTPs (10 mM) 3 μ , FIP (10 μΜ) 2 μ , BIP (10 μΜ) 2 μ , F3 (10 μΜ) 0. 5 μ , Β3 (10 μΜ) 0. 5 μ , MgSO4 (25 mM) 3 41^，甜菜碱(0.4 Μ) 2. 5 μ , Bst DNA聚合酶1 μ ，待检样品基因组DNA 1 μ ，去离子水加至25 μ 。
7.权利要求2飞所述任意一项检测鸭瘟病毒的LAMP反应体系的使用方法，其特征在于 LAMP的反应温度为62°C，反应时间为50 mim。
8.权利要求2飞所述任意一项检测鸭瘟病毒的反应体系的使用方法，其特征在于是将反应体系所需各组分混合完毕，放置于恒温水浴锅进行反应，反应完毕后可凭借液体浑浊度肉眼判定扩增结果，浑浊管为阳性，清亮管为阴性；或反应完毕后加入STOR Green I进行核酸染色，亮绿色为阳性，保留染料初始棕红色为阴性。
9.权利要求8所述检测鸭瘟病毒的LAMP反应体系的使用方法，其特征在于所述LAMP 反应体系使用之前现配，配制完毕后每25PL添加矿物油30μ 。
全文摘要
本发明公开了一种鸭瘟病毒检测用引物组及其构成的LAMP反应体系。该检测用引物组包括正向外侧引物F3SEQ ID NO:1、反向外侧引物B3SEQ ID NO:2、正向内侧引物FIPSEQ ID NO:3和反向内侧引物BIPSEQ ID NO:4。由前述引物组成的LAMP反应体系，还包括反应缓冲液，dNTPs，Mg2+，甜菜碱，BstDNA聚合酶，待检样品基因组DNA和去离子水等。该反应体系操作方法简单，特异性和灵敏度高，检测结果鉴定简便，在小型研究所、兽医站乃至普通养殖户有着更广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102304590SQ20111024567
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月25日 优先权日2011年8月25日
发明者冀君, 孙宝丽, 毕英佐, 谢青梅, 邹禄生, 马静云 申请人:华南农业大学