专利名称：噬菌体tsp4 dna解旋酶和编码这种解旋酶的多核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及噬菌体TSP4 DNA解旋酶和编码解旋酶的多核苷酸，属于生物技术领域。
背景技术：
解旋酶，即分离核酸双链的一类酶，它参与所有生物的大部分的细胞途径。其催化的核心反应一般是非常保守的。解旋酶在分解核酸双链(DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA)的同时伴随着核苷三磷酸(NTP，通常是ATP)的水解。解旋酶参与细胞中大多数核酸代谢过程，包括染色体和质粒的复制，转录，翻译，DNA的重组修复以及RNA的加工等。生物体内有许多有解旋酶功能的酶类，原核方面，目前至少12个假定的解旋酶在大肠杆菌的基因组中被鉴定出来了 ；真核方面，酿酒酵母中编码解旋酶相关蛋白的基因超过基因组的2%，由此可推测解旋酶对于细胞的生存发展起着重要的作用。通过进行蛋白氨基酸序列的比较，可以将解旋酶分五大类，其中最庞大的是I和 II解旋酶超家族(SFI和SFII)，这两类解旋酶中大多数具有3’-5’极性，其中包含七个 (I，Ia，II，III，IV，V，和VI)所谓的解旋酶特征基序(motif)；在这两个超家族中，较保守的AIPase的特征序列Walker A和B序列是I和II基序，在SFI和SF II蛋白中，其他基序并不是高度保守。SF3解旋酶通常来源于DNA或RNA病毒，仅含有I，II和III三个保守基序，其他解旋酶数目较少，如五Coli中的DnaB-Iike的六聚解旋酶自成一类；第五类解旋酶，蛋白较小，其中包含细菌中的终止转录Mio因子。目前对于解旋酶解开DNA双螺旋的机制还不是很清楚，但是所有的解旋酶还是具有某种共同的特征，具体表现在解开双螺旋和在单链上进行移动。有报道解旋酶的机制可以分为被动(passive)和主动(aetive)两种形式。被动形式认为解旋酶与ssDNA是被动的相互作用并且移动方向不确定；而目前通常认为多聚解旋酶采用主动机制进行解旋，它与dsDNA和ssDNA都能结合。现在大家普遍认可的解旋酶作用模型是“active roling”和 "inchworm，，模型。高温菌噬菌体TSP4为感染高温菌菌株Thermus TC16的噬菌体，李秋鹏的硕士论文(昆明理工大学，2009)中对该噬菌体基因组进行了初步的解析，并公布了 TSP4的DNA解旋酶的部分序列，但仅有这部分序列，解旋酶结构不完整，无活性。所有生物都有相当数量的基因编码解旋酶，主要是由于它们在复制、重组、修复、 转录、翻译、剪接、mRNA编辑、染色体重建、转运和降解时所起的重要功能所致，因此解旋酶也成为了科学界研究的一个热点。目前发展的一种依赖解旋酶等温PCR技术，其原理是模拟生物体的DNA复制，在 PCR体系中加入解旋酶，省去了高温变性的步骤，使PCR反应在一个温度下进行。因此这种 PCR技术可以回归在一个水域锅中进行，使PCR反应不依赖于PCR仪来进行。但是由于目前克隆表达出来的解旋酶大部分是来自常温微生物，其稳定性和耐热性不是很好，影响着PCR 的反应效率，因此从高温微生物中寻找耐热的解旋酶是解决上述问题的一个重要途径。栖热菌作为高温菌的模式生物，其噬菌体的研究也日益增多，从栖热菌噬菌体中获得耐热的解旋酶在依赖解旋酶等温PCR技术领域具有重要价值。
发明内容
本发明旨在提供TSP4噬菌体DNA解旋酶，即包含有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物；该DNA解旋酶分离自高温噬菌体TSP4，包括其保守性变异多肽、多肽的活性片段。本专利提供了完整的高温菌噬菌体TSP4解旋酶的基因及其蛋白质序列。本发明中所述多肽、类似物或衍生物的氨基酸序列具有与SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列至少70%的相同性。本发明中所述DNA解旋酶具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供编码TSP4噬菌体DNA解旋酶的多核苷酸，其包含选自下组中的一种
(a).编码具有SEQID NO. 1所示氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物的多核苷
酸；
(b).与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；或
(c).与(a)或(b)有至少70%相同性的多核苷酸。本发明中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。本发明中所述多核苷酸序列包含有SEQ ID N0. 2中200-451位的序列或SEQ ID N0. 2中1-1409位的序列。本发明的另一个目的是提供含有编码DNA解旋酶的多核苷酸的重组载体，其是由前文所述的多核苷酸与质粒、病毒或运载体表达载体构建而成的重组载体。将本发明的解旋酶蛋白序列进行保守区域预测，发现有多个保守结构域。其中 150 360 aa属于P-Ioop NTPase超家族成员。并且在165 aa、187 aa和沘5 aa附近有保守的ATP结合位点；在165 aa附近Walker A基序，在观5 aa为Walker B基序。P-Ioop NTPase超家族成员的一个特点就是含有三磷酸腺苷的结合位点，分别叫做Walker A基序(GxxxxGK[S/T]，其中χ代表任何残基)和Walker B基序(hhhh[D/E], 其中h代表疏水残基)。其中Walker A基序和Walker B基序分别结合ATP、GTP和Mg2+， 这是解旋酶的重要保守区域分布情况。本发明的有益效果
本发明获得的DNA解旋酶，通过实验证明可以作为PCR扩增DNA反应体系的添加物，提高DNA的解链效率，以达到提高扩增效率的结果，能实现提高PCR扩增DNA片段的效率，也可用于等温PCR技术中，在恒温条件下实现DNA扩增的一种技术，这个反应体系中的的关键成分也是DNA解旋酶。
图1是同位素标记法测解旋酶酶活原理图。(右图中“+ ”表示添加解旋酶，“_”表示不添加解旋酶，本图表示在添加解旋酶的情况下，标记的探针从质粒DNA上脱离)
图2是解旋酶基因tsp4-h42保守结构域分析示意图，图中显示解旋酶的重要Motif，包括 ATP 结合位点、Walker A 和 Walker B。图3是解旋酶基因tsp4_h42的克隆片段及相关酶切图谱。M为Marker， 泳道1为tsp4-h42基因PCR产物，其大小为1224bp，泳道2为pET_23b质粒，泳道3为tsp4-h42-pET-23b质粒，泳道4为pET_23b质粒双酶切电泳结果，泳道5为 tsp4-h42-pET-23b双酶切电泳结果。图4是解旋酶基因tsp4_h42表达蛋白的SDS-PAGE分析检测电泳图，其分子量约为46490道尔顿。图5是重组解旋酶ATP酶活的测定示意图。1为对照缓冲液+ dsDNA+ ATP + Mg2+ ，2为重组解旋酶+ATP，3为重组解旋酶+ dsDNA + ATP，4为重组解旋酶+ dsDNA + ATP + Mg2+，解旋酶同时具有ATP酶的活性，通过定磷法测定磷酸根的释放，从而证明解旋酶活性的存在，同时证明解旋酶的活力需要Mg2+的激活。图6是重组解旋酶tsp4_h42的DNA解旋活性检测图。(图中的“ + ”和“_”分别表示“添加”和“不添加”右侧对应的反应物)，在重组tsp4-h42解旋酶+ dsDNA + ATP + Mg2+ 同时存在的条件下，tsp4-h42解旋酶表现出双链DNA解旋活力。图7是重组解旋酶tsp4_h42的DNA解旋活性的原子力显微镜观察图。在重组解旋酶+ dsDNA + ATP + Mg2+同时存在的条件下，tsp4-h42解旋酶表现出将双链DNA解旋， 形成复制泡和复制叉这两种典型的DNA解旋形态。
具体实施例方式实例1 :DNA解旋酶的克隆和表达
一、TSP4噬菌体DNA解旋酶基因的扩增，(以噬菌体TSP4DNA为模板)
(1)TSP4噬菌体DNA解旋酶基因扩增所用引物序列如下 正向引物5，- CATATGACGGACATAAAGCTGGAG -3，
反向引物5，- CTCGAGGGTAAGAGAGAAATCAAAGTT -3，
(2)扩增体系如下
表1 扩增反应体系组分
权利要求
1.噬菌体TSP4DNA解旋酶，其特征在于它包含有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。
2.根据权利要求1所述的DNA解旋酶，其特征在于所述多肽、类似物或衍生物的氨基酸序列具有与SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列至少70%的相同性。
3.根据权利要求1所述的DNA解旋酶，其特征在于具有SEQID NO. 1所示的氨基酸序列。
4.一种编码权利要求1所述DNA解旋酶的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含选自下组中的一种(a).编码具有SEQID NO. 1所示氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物的多核苷酸；(b).与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；或(c).与(a)或(b)有至少70%相同性的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸编码具有SEQID NO. 1 所示氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸序列包含有SEQID N0. 2中200-451位的序列或SEQ ID N0. 2中1-1409位的序列。
7.一种含有外源多核苷酸的重组载体，其特征在于它是由权利要求4-6中的任一权利要求所述多核苷酸与质粒、病毒或运载体表达载体构建而成的重组载体。
全文摘要
本发明公开了噬菌体TSP4 DNA解旋酶和编码这种解旋酶的多核苷酸，该DNA解旋酶分离自高温噬菌体TSP4，此DNA解旋酶是PCR技术中的关键DNA解旋酶，可提高PCR技术扩增DNA片段的效率，以达到提高扩增效率的目的。
文档编号C12R1/92GK102304500SQ20111024799
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者季秀玲, 张琦, 李秋鹏, 林连兵, 薛寒, 魏云林 申请人:昆明理工大学