专利名称：一种slc22a1基因多态性检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种SLC22A1基因多态性检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
有机阳离子转运体I (0CT1，编码基因SLC22A1)是一种具有基因多态性的转运蛋白，主要分布于人的肝脏，介导一些药物、毒物和内源性化合物等一系列有机阳离子的转运。SLC22A1在许多外源性药物的吸收、分布和排泄中发挥着重要的作用。有研究表明，SLC22A1基因多态性是造成其转运功能个体差异的主要原因。目前，对SLC22A1基因多态性进行检测和分析的方法很少，主要有直接测序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。本发明目标检测的SLC22A1基因突变位点，如表所示
序号 SLC22A1位点突变的内容简写
~SEQ ID NO. 75的第117位核苷酸，发生C —T突变C117T
2SEQ ID NO. 75的第198位核苷酸，发生T — C突变T198C
~SEQ ID NO. 76的第86位核苷酸，发生C — T突变C86T
~SEQ ID NO. 76的第97位核苷酸，发生C — G突变C97G
5SEQ ID NO. 77的第164位核苷酸，发生C — T突变C164T
~6SEQ ID NO. 78的第123位核苷酸，发生G — T突变G123T
~1SEQ ID NO. 79的第127位核苷酸，发生G — A突变G127A
SEQ ID NO. 79的第148位核苷酸，发生A — G突变A148G
9SEQ ID NO. 80的第129位核苷酸，发生G — C突变G129CSEQ ID NO. 75TCCTCATCTTATGCCTGCTGTCGGCTGCCTTTGCGCCCATCTGTGTGGGCATCGTCTTCCTGGGTTTCACACCTGACCACCACTGCCAGAGTCCTGGGGTGGCTGAGCTGAGCCAGCGCTGTGGCTGGAGCCCTGCGGAGGAGCTG
AACTATACAGTGCCAGGCCTGGGGCCCGCGGGCGAGGCCTTCCTTGGCCAGTGCAGGCGCTATGAAGTGGACTGGAA
CCAGAGCGCCCTCAGCTGTGTAGACCCCCTGGCTAGCCTGGCCACCAACAGGAGCCACCTGCCGCTGGGTCCCTGCC
AGGATGGCTGGGTGTATGACACGCCCGGCTCTTCCATCGTCACTGSEQ ID NO. 76GAGCAACAGCATCACCCCGCTCAGGGCTGAACGTCAGACCGAGGAAAATGCCAGATAGTGATGAGTGGTGTTCGCAGGTGTGTGCCGGAGTCCCCTCGGTGGCTGTTATCACAAAAAAGAAACACTGAAGCAATAAAGATAATGGA CCACATCGCTCAAAAGAATGGGAAGTTGCCTCCTGCTGATTTAAAGGTGAAATCTAGGAAGGGGTATCTCACATCACTGAATCTGGGGCTGGGTTCTGGTGCAGATTCGTCTGGGGCTGCCAGGGGAAAGAGCAGAACTGTGCCCCTSEQ ID NO. 77 GAAGCACGGTGGTGGCAAGGCTCACCTCCCCAGGGGCTCCCAGGTGGCTCTGCTCATGACAGCGTGAGTGTGGCTGATGCTCTCCCTCCCTCCTAGATGCTTTCCCTCGAAGAGGATGTCACCGAAAAGCTGAGCCCTTCATTTGCAGACCTGTTCCGCACGCCGCGCCTGAGGAAGCGCACCTTCATCCTGATGTACCTGTGGTGAGGGGCGTTCCTGTGCGTCTCTCCAGGCAGAATCAGCACGCTYGCCCAAGCACTGGGCTATAGATTAGAGACAGTGGAATACTCAGGTGGAAAAAGAGAAAGGGAAASEQ ID NO. 78CCTGGGAACTGTGCTGGTCAACGCGGTGTCGGGCGTGCTCATGGCCTTCTCGCCCAACTACATGTCCATGCTGCTCTTCCGCCTGCTGCAGGGCCTGGTCAGCAAGGGCAACTGGATGGCTGGCTACACCCTAAGTAATTATCATGGGGATGAGGCCAGGTCTCAGGGTAGAATGGGATGGGCCTAACGTGGGTAGGGGGTTGTTTGTGGGGTCAAGGAGCTTGCGGGGCACCAGTTCCTTGTATTTATGTGACTAGGGCAGGACATGGGCTSEQ ID NO. 79GTGCTCTATCAGGGGCTCATCCTGCACATGGGCGCCACCAGCGGGAACCTCTACCTGGATTTCCTTTACTCCGCTCTGGTCGAAATCCCGGGGGCCTTCATAGCCCTCATCACCATTGACCGCGTGGGCCGCATCTACCCCATGGCCATGTCAAATTTGTTGGCGGGGGCAGCCTGCCTCGTCATGATTTTTATCTCACCTGGTAAGTTGGTAAGTTGTCTGCTTTCATCATTTCCCAGGCAATCGAAGTGTGGGGAAAGTGTTGTGACTCTTTGATAAGCCTCTGGAATGAGAACAAAGATGAGGTGCSEQ ID NO. 80GAGCACTGGACAGCCACAGCAAGCTGCAGGTATTGGCATTGTACTTGTTTTAGCATCAGGTGAACATTTGGAAAAGTGAATCACAGAATTATCGTATTTTTTGTCCTTTGTATTTTATCAGGAACCTCGGAGTGATGGTGTGTTCCTCCCTGTGTGACATAGGTGGGATAATCACCCCCTTCATAGTCTTCAGGCTGAGGGAGGTCTGGCAAGCCTTGCCCCTCATTTTGTTTGGTAAGATTTTGTGGAGCATATATCATTCCTTCTTTTGCAGCTCGGCAGTGGGCTCAGCATGGGTGGAACTGAGTGTGAGTACTCAGTCGTATTTGTTGAGTGAAGGGAATGATATCTCTCAGTGAGTTTACAGAAGGCAAGGATGATGCATGCTCTTGGGATGTCTTCTGGCTTA
发明内容
本发明的目的之一是提供SLC22A1基因多态性检测液相芯片，该液相芯片可用于单项或者并行检测SLC22A1基因九种常见基因型C117T、T198C、C86T、C97G、C164T、G123T、G127A、A148G和G129C的野生型和突变型。一种SLC22A1基因多态性检测液相芯片，包括有
(A).针对SLC22A1基因不同多态性位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因多态性位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对C117T位点的SEQ ID NO. 19及SEQ ID NO. 20 ;针对T198C 位点的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22 ;针对 C86T 位点的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ IDNO. 24 ;针对 C97G位点的 SEQ ID NO. 25 及 SEQ ID NO. 26 ;针对 C164T 位点的 SEQ ID NO. 27及 SEQ ID NO. 28 ;针对 G123T 位点的 SEQ ID NO. 29 及 SEQ ID NO. 30 ;针对 G127A 位点的SEQ ID NO. 31 及 SEQ IDN0. 32 ;针对 A148G 位点的 SEQ ID NO. 33 及 SEQ ID NO. 34 ;和 / 或针对 G129C 位点的 SEQ IDN0. 35 及 SEQ ID NO. 36 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID NO. I SEQID NO. 18 ；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 37 SEQ ID NO. 54，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应多态性位点的目标序列的引物。优选地，所述扩增引物为针对C117T、T198C位点的SEQ ID NO. 55及SEQ IDNO. 56 ;针对 C86T、C97G 位点的 SEQ ID NO. 57 及 SEQ ID NO. 58 ;针对 C164T 位点的 SEQ IDNO. 59 及 SEQID NO. 60 ;针对 G123T 位点的 SEQ ID NO. 61 及 SEQ ID NO. 62 ;针对 G127A、A148G 位点的 SEQID NO. 63 及 SEQ ID NO. 64 ;和 / 或针对 G129C 位点的 SEQ ID NO. 65 及SEQ ID NO. 66。优选地，所述ASPE引物为针对C117T位点的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 19组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 20组成的序列；针对T198C位点的由SEQ ID NO. 3和SEQID NO. 21组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 22组成的序列；针对C86T位点的由SEQID NO. 5和SEQ ID NO. 23组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 24组成的序列；针对C97G位点的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 25组成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 26组成的序列；针对C164T位点的由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 27组成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQID NO. 28组成的序列；针对G123T位点的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 29组成的序列及由SEQID NO. 12和SEQ ID NO. 30组成的序列；针对G127A位点的由 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 31 组成的序列及由 SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 32组成的序列；针对A148G位点的由SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 33组成的序列及由SEQ IDNO. 16和SEQ ID NO. 34组成的序列；和/或针对G129C位点的由SEQ ID NO. 17和SEQ IDNO. 35组成的序列及由SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 36组成的序列。本发明的另一目的是提供用于SLC22A1基因多态性检测的特异性引物。用于SLC22A1基因多态性检测的特异性引物，该特异性引物为针对C117T位点的 SEQ IDN0. 19 及 SEQ ID NO. 20 ;针对 T198C 位点的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22 ;针对 C86T 位点的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24 ;针对 C97G 位点的 SEQ ID NO. 25 及 SEQ IDNO. 26 ;针对C164T位点的SEQ ID NO. 27及SEQ ID NO. 28 ;针对G123T位点的SEQ ID NO. 29及 SEQ ID NO. 30 ;针对 G127A 位点的 SEQ ID NO. 31 及 SEQ ID NO. 32 ;针对 A148G 位点的SEQ ID NO. 33 及 SEQ IDN0. 34 ;和 / 或针对 G129C 位点的 SEQ ID NO. 35 及 SEQ ID NO. 36。本发明的主要优点在于I.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的SLC22A1基因多态性检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个多态性位点的并行检测。2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的多态性情况，检测效果一致。3.本发明的检测方法步骤简单，九种多态性位点检 测可通过一步多重PCR即可完成六条含有多态性位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例I SLC22A1基因多态性检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对SLC22A1 基因九种常见基因型 C117T、T198C、C86T、C97G、C164T、G123T、G127A、A148G和G129C的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表I SLC22A1基因的ASPE弓丨物序列(Tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种SLC22A1基因多态性检测液相芯片，其特征是，包括有 (A).针对SLC22A1基因不同多态性位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因多态性位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对C117T位点的SEQ ID NO. 19及SEQ ID NO. 20 ;针对T198C位点的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22 ;针对 C86T 位点的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24 ；针对 C97G 位点的 SEQ ID NO. 25 及 SEQ ID NO. 26 ;针对 C164T 位点的 SEQ ID NO. 27 及 SEQID NO. 28 ;针对 G123T 位点的 SEQ ID NO. 29 及 SEQ ID NO. 30 ;针对 G127A 位点的 SEQ IDNO. 31 及SEQ IDN0.32 ;针对A148G位点的SEQ ID NO. 33及SEQ ID NO. 34 ;和/或针对G129C位点的 SEQ IDNO. 35 及 SEQ ID NO. 36 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID NO. I SEQ ID NO. 18 ； (B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 37 SEQ ID NO. 54，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应多态性位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求I所述的SLC22A1基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对 C117T、T198C 位点的 SEQ ID NO. 55 及 SEQ ID NO. 56 ;针对 C86T、C97G 位点的 SEQIDNO. 57 及 SEQ ID NO. 58 ;针对 C164T 位点的 SEQ ID NO. 59 及 SEQ ID NO. 60 ;针对 G123T位点的 SEQ ID NO. 61 及 SEQ ID NO. 62 ;针对 G127A、A148G 位点的 SEQ ID NO. 63 及 SEQ IDNO. 64 ;和 / 或针对 G129C 位点的 SEQ ID NO. 65 及 SEQ ID NO. 66。
3.根据权利要求I所述的SLC22A1基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为:针对C117T位点的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 19组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ IDNO. 20组成的序列；针对T198C位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 21组成的序列及由SEQ IDNO. 4和SEQ ID NO. 22组成的序列；针对C86T位点的由SEQ ID NO. 5和SEQID NO. 23组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 24组成的序列；针对C97G位点的由SEQ ID NO. 7和SEQ IDNO. 25组成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 26组成的序列；针对C164T位点的由SEQ IDNO. 9和SEQ ID NO. 27组成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQID NO. 28组成的序列；针对G123T位点的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 29组成的序列及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 30组成的序列；针对G127A位点的由SEQ ID NO. 13和SEQID NO. 31组成的序列及由SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 32组成的序列；针对A148G位点的由 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 33 组成的序列及由 SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 34 组成的序列；和/或针对G129C位点的由SEQ ID NO. 17和SEQID NO. 35组成的序列及由SEQ IDNO. 18和SEQ ID NO. 36组成的序列。
4.根据权利要求I所述的SLC22A1基因多态性检测液相芯片，其特征是， (A).所述ASPE引物为针对C117T位点的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 19组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 20组成的序列；针对T198C位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 21组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 22组成的序列；针对C86T位点的由SEQ IDNO. 5和SEQ ID NO. 23组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 24组成的序列；针对C97G位点的由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 25组成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 26组成的序列；针对C164T位点的由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 27组成的序列及由SEQ ID NO. 10和SEQID NO. 28组成的序列；针对G123T位点的由SEQ ID NO. 11和SEQID NO. 29组成的序列及由SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 30组成的序列；针对G127A位点的由 SEQ ID NO. 13 和 SEQ IDNO. 31 组成的序列及由 SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 32 组成的序列；针对A148G位点的由SEQID NO. 15和SEQ ID NO. 33组成的序列及由SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 34组成的序列；和针对G129C位点的由SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 35组成的序列及由SEQ ID NO. 18和SEQ IDNO. 36组成的序列； (B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 37 SEQ ID NO. 54，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).所述扩增引物为针对C117T、T198C位点的SEQID NO. 55及SEQ ID NO. 56 ;针对 C86T、C97G 位点的 SEQ ID NO. 57 及 SEQ ID NO. 58 ;针对 C164T 位点的 SEQ ID NO. 59 及SEQID NO. 60 ;针对 G123T 位点的 SEQ ID NO. 61 及 SEQ ID NO. 62 ;针对 G127A、A148G 位点的 SEQID NO. 63 及 SEQ ID NO. 64 ;和针对 G129C 位点的 SEQ ID NO. 65 及 SEQ ID NO. 66。
5.根据权利要求1-4任一项所述的SLC22A1基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
6.用于SLC22A1基因多态性检测的特异性引物，其特征是，该特异性引物为针对C117T 位点的 SEQ ID NO. 19 及 SEQ ID NO. 20 ;针对 T198C 位点的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ IDNO. 22 ;针对 C86T 位点的 SEQ ID NO. 23 及 SEQ ID NO. 24 ;针对 C97G 位点的 SEQ ID NO. 25及 SEQ ID NO. 26 ;针对 C164T 位点的 SEQ ID NO. 27 及 SEQ ID NO. 28 ;针对 G123T 位点的SEQ ID NO. 29 及 SEQ IDNO. 30 ;针对 G127A 位点的 SEQ ID NO. 31 及 SEQ ID NO. 32 ;针对A148G 位点的 SEQ ID NO. 33 及 SEQ ID NO. 34 ;和 / 或针对 G129C 位点的 SEQ ID NO. 35 及SEQ ID NO. 36。
全文摘要
本发明公开了一种SLC22A1基因检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为针对C117T位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20；针对T198C位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22；针对C86T位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24；针对C97G位点的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26；针对C164T位点的SEQ ID NO.27及SEQID NO.28；针对G123T位点的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30；针对G127A位点的SEQ IDNO.31及SEQ ID NO.32；针对A148G位点的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34；和/或针对G129C位点的SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
文档编号C12N15/11GK102952874SQ20111025173
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月29日 优先权日2011年8月29日
发明者许嘉森, 罗可银 申请人:广州益善生物技术有限公司