专利名称：Ph梯度磷酸钙共沉淀转染试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种综合改进型的磷酸钙沉淀转染试剂盒，试剂盒所包含的成分主要有无菌水(组织培养级别)，PH梯度的HBS缓冲溶液组合，2M的氯化钙。磷酸钙沉淀介导的细胞转染是一种传统的细胞转染方法。近些年来出现了很多类型的细胞转染试剂，并且它们在不同物种的细胞系中表现出了高效的转染效率。尽管如此，传统的磷酸钙沉淀法并没有被淘汰，依然是很多生物实验室的转染首选。主要是由于磷酸钙沉淀法有着用途广泛，成本低廉等优点。磷酸钙沉淀转染法成功的关键是磷酸钙-DNA沉淀复合物的形成。而该复合物的形成又很大程度的依赖于HBS缓冲溶液的PH值。PH值的微小变化都会影响到转染效率。目前国内的很多生物公司都推出了自己的磷酸钙沉淀转染试剂盒，然而试剂盒中的HBS缓冲液PH值是固定的。由于各个实验室间存在着条件的差异，不可避免的导致其在某些实验室可用，而换了其他实验室便不好用。本发明很好的解决了这个问题。通过提供PH梯度的HBS缓冲液组合，可以使用户在实验的时候找到最佳的转染条件，一旦条件找到，便可长期使用该条件进行细胞的高效转染。同时该试剂盒中还提供了 O. 4%的台盼蓝溶液，用于监测转染过程中的细胞死亡情况，便于找到转染效率与存活率都可观的最优的转染条件。·背景技术磷酸钙沉淀细胞转染法主要是通过形成磷酸钙DNA沉淀复合物来达到将DNA输送到体外培养细胞中的目的。普遍认为该方法可以促进DNA在细胞表面的附着，进而通过细胞的内吞作用将外源DNA摄入。该方法被常规的用来进行哺乳类细胞或昆虫类细胞的瞬时转染以及稳定转染。DNA首先与氯化钙混合，然后将该溶液逐滴的加入一种磷酸缓冲溶液中，从而形成DNA-磷酸钙沉淀。在滴加DNA溶液的过程中，不断地在混合液中吹打对最适沉淀的形成是很重的，因为成团聚集的DNA是不利于粘附甚至进入细胞的。除此之外，缓冲液的PH对于沉淀的形成也是至关重要的。找到形成最适沉淀的缓冲液的PH值对于各个独立的实验者来说是细胞转染实验成败的关键。PH梯度磷酸钙共沉淀转染试剂盒，提供了 PH梯度的HBS缓冲液组合。在首次实验中，实验者可以通过做平行实验，选出最佳PH的HBS缓冲液，作为以后实验的参考。由于PH梯度HBS缓冲液组合的存在，当发现某一条件转染效率不理想的时候，便可以重新通过平行实验来摸索条件。细胞转染过程中，转染复合物溶液的加入是会对细胞产生毒性的。该试剂盒中提供的台盼蓝溶液便于使用者在实验过程中实时评价加入转染复合物对细胞的毒性，从而增多或者降低转染复合的加入，最终总结出适合该实验室的某种细胞系的最佳转染条件。发明内容本发明的要点在于选择如下配方无菌水(组织培养级别)100ml，2 XHBS缓冲液(7种PH) 100ml，2M氯化钙15ml, O. 4%台盼蓝50ml，对照质粒IOOugo7个PH梯度的2 X HBS缓冲液是该发明的核心。2 X HBS缓冲液各成分浓度如下4-轻乙基哌嗪乙磺酸(50mM/L),氯化钾(10mM/L)，葡萄糖(12mM/L)，
氯化钠(280mM/L)，磷酸钠(I.5mM/L)。PH值分别是7. 01，7. 03，7. 05，7. 07，7. 10,7. 15，7. 2。配制完成后过滤除菌冷冻储存。2M氯化钙配制完成后过滤除菌冷冻储存。O. 4%台盼蓝可以用来显示细胞的死活。死细胞的细胞膜通透性增加使该染料可以进入到细胞内将细胞染成蓝色。
对照质粒分别提供了可以在哺乳类细胞表达的绿色荧光蛋白重组质粒和可以在昆虫细胞表达的绿色荧光蛋白重组质粒。满足对于不同细胞系的检测需求。本发明的优点如下(I)提供了不同PH值的HBS缓冲溶液，便于探索最佳转染条件；(2)可以在转染的同时监测细胞的生长状况；(3)提供了在不同物种细胞系中表达的对照质粒，满足了不同实验室的检测需求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明以60mm的培养皿培养贴壁细胞为例第一天准备用来转染的细胞。按合适的浓度将细胞接种于60_细胞培养板。在37摄氏度CO2培养箱(哺乳类细胞)或25摄氏度培养箱(某些昆虫细胞)中培养过夜。使细胞在转染时的汇集度达到60% -90%为宜。第二天转染细胞。制备转染复合物I.取出一个EP管，标上A。加入18ul 2M的氯化钙和IOug对照质粒，加水定容到150ul。2.取出一个EP管，标上B。加入150ul 2 X HBS缓冲液。(不同PH的HBS做平行试验)3.将A溶液逐滴加入B溶液中，其间用涡旋震荡仪震荡促进DNA-磷酸钙沉淀的形成。4.将混合液在室温放置半小时。5.将混合液逐滴加入培养的细胞中。6. 37摄氏度CO2培养箱(哺乳类细胞)或25摄氏度培养箱(某些昆虫细胞)中培养过夜。第三天换培养基以及细胞毒性的检测。I.通过胰蛋白酶处理或将细胞吹打悬浮，取部分细胞进行稀释，然后加入O. 4%的台盼蓝使其终浓度为O. 04%。血细胞板下计数评价细胞的存活情况。2.将剩下的细胞离心，移除含有转染复合物的旧培养基。3.加入新鲜培养基，将细胞悬浮，重新接种培养。24-48小时后通过荧光观察计算转染效率，确定出最佳转染条件。
权利要求
1 .本发明涉及一种PH梯度磷酸钙共沉淀转染试剂盒，其特征在于具有如下的组成无菌水(组织培养级别)IOOml ,2 X HBS缓冲液(7种PH) 100ml，2M氯化钙15ml，O. 4 %台盼蓝50ml,对照质粒lOOug。
全文摘要
本发明涉及一种PH梯度磷酸钙共沉淀转染试剂盒，提供了PH梯度的HBS缓冲液组合。在首次实验中，实验者可以通过做平行实验，选出最佳PH的HBS缓冲液，作为以后实验的参考。由于PH梯度HBS缓冲液组合的存在，当发现某一条件转染效率不理想的时候，便可以重新通过平行实验来摸索条件。细胞转染过程中，转染复合物溶液的加入是会对细胞产生毒性的。该试剂盒中提供的台盼蓝溶液便于使用者在实验过程中实时评价加入转染复合物对细胞的毒性，从而增多或者降低转染复合的加入，最终总结出适合该实验室的某种细胞系的最佳转染条件。本发明的优点如下(1)提供了不同PH值的HBS缓冲溶液，便于探索最佳转染条件；(2)可以在转染的同时监测细胞的生长状况；(3)提供了在不同物种细胞系中表达的对照质粒，满足了不同实验室的检测需求。
文档编号C12N15/85GK102952824SQ20111025193
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者曲奕, 张洪涛 申请人:曲奕, 张洪涛