专利名称：一种对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法及系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法及系统。
背景技术：
最初的基因测序技术是通过手工操作进行的，包括Sanger发明的双脱氧链终止法，以及Maxam和Gilbert发明的化学降解法。由于手工操作效率较低，且容易发生人为操作失误，因此利用基因测序仪进行测序现已成为了测序技术的主流。在现阶段，若要对基因片段进行测序或者数据分析，需首先从生物个体，例如组织细胞、细菌等提取基因材料(RNA)，并利用转录和合成得到DNA片段，一般通过这种方法得到的DNA片段都是少量的。然后对DNA片段进行扩增，例如可以利用聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR)、转录法等进行扩增，得到大量的基因片段，然后再基于扩增后的基因片段进行测序或数据分析。因此在正式测序前需要做大量前期的样品制备工作，这些工作一直以来都是采用手工操作进行的，而且将制备好的样品设置到测序仪中也是通过手动，无法实现自动化。这就存在两方面的问题一方面手工进行样品制备需要花费大量时间，另一方面手工操作难以保证每一次样品制备的质量，将直接影响测序能够顺利进行，也会影响测序结果的准确性。另外，到了测序阶段，就基因测序仪本身的控制而言，目前基因测序仪的测序过程由一系列机械、电子通信、生物、化学、光学等操作所组成，这些操作分别由基因测序仪中对应的组件所执行，替代了单纯的手工操作。但是也面临以下问题一方面，由于基因测序对精度的要求非常高，属于纳米级，任何一个组件的操作出现偏差都会导致测序结果不理想； 另一方面，整个测序过程涉及的具体步骤非常繁琐，需要基因测序仪中的各组件之间进行协同运作。也就是说，测序过程不仅要求基因测序仪中各组件准确、快速地执行各项操作， 还要求各组件之间进行良好的配合。在具体应用中，基因测序仪进行测序时涉及的因素非常复杂，包括对试剂剂量及类型、反应温度、时间、洁净度、纳米级位移、聚焦调节、发光强度、光路调节、曝光时间计算、图像拍摄等多方面的控制，而且每个方面的要求非常高，因此要保证测序过程顺利进行，难度很大。仅以试剂剂量及类型的控制进行说明，由于基因测序过程中对试剂剂量的控制一般在微升级，且需要在不同的反应阶段进行多次不同剂量的吸取导入，加上每次所选取的试剂类型都可能存在差异，因此对试剂的剂量、类型的把握提出了较高的要求。若由人工操作进行试剂吸取，或人工控制仪器进行试剂吸取，都存在以下问题一方面很难精确控制剂量，而剂量的细微差别会导致不同的生化反应结果，也就会直接影响测序结果；另一方面， 人为参与需要对反应不同阶段的各种试剂类型进行准确判断，即便一个小环节上的失误就会导致生化反应失败，使得整个测序过程全盘失败。此外，由于测序过程从样品制备、上样、 测序、数据分析直到得出测序结果，每个阶段都需要一定的周期，如果上述试剂剂量及类型的控制存在失误，人工操作无法进行监控，不能在后续过程中及时纠错，即便得知最终的测序结果失败也很难查找到测序过程失败的根本原因，还浪费了大量的时间和价格昂贵的试剂。除开试剂剂量及类型的因素，其他各种因素，包括前述的反应温度、时间、洁净度、 纳米级位移、聚焦调节、发光强度、光路调节、曝光时间计算、图像拍摄等，均存在上述的类似情形，如果没有自动化的控制系统进行操作，整个测序过程将很难顺利展开，而要想稳定、快速地获得准确的测序结果就更难了。因此需要一种对生物样品处理及基因测序仪的测序过程进行自动化控制的方法， 解决上述难题，保证测序过程能够顺利、高效率地进行，并提高测序结果的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法及系统，旨在提高测序过程的稳定性和效率，同时提高测序结果的准确性。为了实现发明目的，所述对生物样品处理及测序进行自动化控制的系统包括样品控制单元、反应控制单元、定位控制单元、采图控制单元；所述样品控制单元用于控制生物样品的制备，生成反应体系并将其设置到基因测序仪中；所述反应控制单元用于控制基因测序仪将试剂导入反应体系，并在测序过程中调节反应体系的温度；所述定位控制单元用于控制反应体系在基因测序仪中的移动，并确定采图位置；所述采图控制单元用于激发反应体系中核苷酸携带的标记物发光，并在所述采图位置获取图像信号。其中，所述样品控制单元包括体系制备模块、上样控制模块；所述体系制备模块根据生物样品制备待测的基因片段库，并处理成测序所需的反应体系；所述上样控制模块将反应体系设置到基因测序仪中的确定位置。其中，所述反应控制单元包括试剂控制模块、温控模块；所述试剂控制模块用于控制基因测序仪对试剂进行选择，并吸取对应的试剂，导入反应体系；所述温控模块用于将反应体系的温度控制在反应所需的温度。其中，所述定位控制单元包括位移模块、聚焦模块；所述位移模块用于检测反应体系在基因测序仪中的当前位置，并控制其移动到其所在平面上的目标位置；所述聚焦模块用于控制基因测序仪的焦距调节，确定反应体系的采图位置。其中，所述聚焦模块通过调节显微镜与反应小室之间的距离，将清晰度最佳的位置确定为采图位置。其中，所述采图控制单元包括激发模块、拍照模块、图像存取模块；所述激发模块用于控制特定波长的激发光照射反应体系，使反应体系中核苷酸携带的标记物发光；所述拍照模块确定曝光时间，并采用所述曝光时间对反应体系拍照，获取图像信号；所述图像存取模块与拍照模块进行通信，用于保存获取的图像信号。为了更好地实现发明目的，所述对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法， 其特征在于，所述方法包括以下步骤:A.控制生物样品的制备，生成反应体系并将其设置到基因测序仪中；B.控制基因测序仪将试剂导入反应体系，并调节反应体系的温度；C.控制反应体系在基因测序仪中的移动，并确定采图位置；D.激发反应体系中核苷酸携带的标记物发光，并在所述采图位置获取图像信号。其中，所述步骤A包括:A1.根据生物样品制备待测的基因片段库，并处理成测序所需的反应体系；A2.将所述反应体系设置到基因测序仪中的确定位置。其中，所述步骤B包括B1.控制基因测序仪对试剂进行选择，并吸取对应的试剂， 导入反应体系；B2.将反应体系的温度控制在反应所需的温度。其中，所述步骤C包括C1.检测反应体系在基因测序仪中的当前位置，并控制其移动到其所在平面上的目标位置；C2.控制基因测序仪的焦距调节，确定反应体系的采图位置。其中，所述步骤C2包括通过调节显微镜与反应小室之间的距离，将清晰度最佳的位置确定为采图位置。其中，所述步骤D包括D1.控制特定波长的激发光照射反应体系，使反应体系中核苷酸携带的标记物发光；D2.确定曝光时间，并采用所述曝光时间对反应体系拍照，获取图像信号；D3.保存获取的图像信号。由上可知，本发明通过对生物样品的制备及上样进行自动化控制，以及对基因测序的测序过程进行自动化控制，不仅提高了测序过程的稳定性和效率，而且提高了测序结果的准确性。
图1是本发明对生物样品处理及测序进行自动化控制的系统结构示意图；图2是图1中的控制系统1在一个实施例中的结构示意图；图3是图2中的样品控制单元400在一个实施例中的结构示意图；图4是图2中的反应控制单元100在一个实施例中的结构示意图；图5是图2中的定位控制单元200在一个实施例中的结构示意图；图6是图2中的采图控制单元300在一个实施例中的结构示意图；图7是本发明一个实施例中对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法流程图；图8是图7中步骤SO在一个实施例中的方法流程图；图9是图7中步骤Sl在一个实施例中的方法流程图；图10是图7中步骤S2在一个实施例中的方法流程图；图11是图7中步骤S3在一个实施例中的方法流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。图1示出了本发明对生物样品处理及测序进行自动化控制的系统结构，该系统包括控制系统1，和与其相连的至少一台基因测序仪，如图所示的基因测序仪2、基因测序仪
3......基因测序仪N。应当说明的是，本发明所有图示中各设备或模块之间的连接关系是
为了清楚阐释其信息交互及控制过程的需要，因此应当视为逻辑上的控制关系，而不应限于物理连接或无线连接。另外需要说明的是，各功能模块之间的通信方式可以采取多种，本发明的保护范围不应限定为某种特定类型的通信方式。其中(1)控制系统1用于与至少一台基因测序仪进行通信，其各个功能模块分别控制基因测序仪中对应的各个组件，或者，控制基因测序仪的测序过程。主要包括控制基因测序仪将试剂导入反应体系，并调节反应体系的温度；控制反应体系在基因测序仪中的移动， 并确定采图位置；激发反应体系中核苷酸携带的标记物发光，并在上述采图位置获取图像信号。应当说明的是，上述控制方式适用于各种类型的基因测序仪，因此本发明中控制方法及系统的保护范围不应受到基因测序仪本身结构的限制。关于控制系统1的具体内容，将在其后的实施例中详细阐述。(2)基因测序仪N由多个组件构成，分别与控制系统1中的各个功能模块对应，接受并执行这些功能模块的各项指令，从而协同完成测序。这些组件包括用于吸取试剂并导入反应体系的组件，用于对反应体系的温度进行调节的组件，容纳有反应体系并可在基因测序仪内移动的组件，用于确定采图位置的组件，用于导入激发光的组件，用于采集图像信号的组件等。应当说明的是，不同类型的基因测序仪具有不同的内部组件，或者内部组件的外在表现形式有所不同，但所实现的功能是一致的，本发明的保护范围不应受到这些因素的限制。还应当说明的是，各组件之间不一定完全独立，实现不同功能的各组件可能会涉及一个或多个相同的部件。关于基因测序仪N中的部分组件构成，可参考申请人的已公开专利申请号为CN200810132008. 8，发明名称为“测序反应小室、基因测序反应台及基因测序系统”，本发明也将在其后的实施例中进行具体阐述。关于反应体系需要说明的是，该反应体系包含多个相互独立的反应滴，每个反应滴包含多个拷贝数目的待测DNA片段，在本发明中一般是上千万甚至上亿的数量级。在测序过程中，反应体系中待测的DNA片段将与带有标记物的核苷酸结合，该标记物可以受到特定波长的光源激发，使带有该标记物的微珠发光，这样就可以采集图像信号，并根据图像信号进行处理和分析，得到基因序列信息。图2示出了图1中的控制系统1在第一实施例中的结构，包括样品控制单元400、 反应控制单元100、定位控制单元200、采图控制单元300。其中(1)样品控制单元400用于控制生物样品的制备，生成反应体系并将其设置到基因测序仪中。需要说明的是，样品控制单元400与控制系统1中其他单元之间应当视为逻辑上的控制关系，而不应限于物理连接或无线连接。样品控制单元400所控制的硬件部分可以存在于基因测序仪内部，也可以在基因测序仪外部独立存在，不应视为对本发明保护范围的限制。例如，基因测序仪内部具有与样品控制单元400对应的多个组件，样品控制单元 400实际上是通过控制部分组件的操作，将所采集到的生物样品制备成所需的反应体系，并通过控制另一部分组件的操作，将该反应体系安装或设置到基因测序仪中适当的位置。试以一种类型的基因测序仪为例说明上述控制过程，在该具体情形中，基因测序仪内包括与样品控制单元400对应的如下组件(1)文库制备组件，用于将生物样品制备成待测的基因片段库；(2)反应体系制备组件，用于将待测的基因片段制备成测序所需的反应体系；(3) 机械手，将反应体系安装到基因测序仪中适当的位置，一般是安装在样品台中。在该情形下，样品控制单元400的控制过程是通过控制文库制备组件将生物样品制备成待测的基因片段库，再进一步控制反应体系制备组件将基因片段制备成测序所需的反应体系，然后控制机械手进行安装。关于样品控制单元400的具体功能模块及控制方式，将在其后的实施例中详细阐述。
(2)反应控制单元100用于控制基因测序仪将试剂导入反应体系，并在测序过程中调节反应体系的温度。在本发明中，基因测序仪内部具有与反应控制单元100对应的多个组件，反应控制单元100实际上是通过控制部分组件的操作，将试剂导入反应体系，并通过控制另一部分组件的操作，实现对反应体系温度的调节。试以一种类型的基因测序仪为例说明上述控制过程，在该具体情形中，基因测序仪内包括与反应控制单元100对应的如下组件(1)试剂台，用于放置或容纳多种可供吸取的试剂；(2)机械手，用于在不同的反应阶段选择合适的试剂；(3)泵及软管，用于吸取所选择的试剂，其中软管固定在机械手上；(4)样品台，其包含反应小室，用于容纳反应体系；(5)温控器，与反应小室相连，其包括用于检测反应小室温度的温度传感器，以及给反应小室加热的升温装置。在该情形下，反应控制单元100的控制过程是通过控制机械手、泵及软管，将试剂导入反应体系，并通过温度传感器检测温度，以及控制升温装置给反应小室加热，从而调节反应体系的温度。应当说明的是，对于不同类型的基因测序仪，其所包括的组件的类型、结构或数量可能存在差异，但反应控制单元 100的控制过程在基本原理上是一致的，因此保护范围不应受到上述因素的限制。关于反应控制单元100的具体功能模块及控制方式，将在其后的实施例中详细阐述。(2)定位控制单元200用于控制反应体系在基因测序仪中的移动，并确定采图位置。在本发明中，基因测序仪内部具有与定位控制单元200对应的多个组件，定位控制单元200实际上是通过控制部分组件的操作，从而控制反应体系在基因测序仪中的移动，并通过控制另一部分组件的操作，从而确定采图位置。试以一种类型的基因测序仪为例说明上述控制过程，在该具体情形中，基因测序仪内包括如下与定位控制单元200对应的组件(1)样品台，即前述内容提及的样品台，其包含反应小室，用于容纳反应体系，如前所述，各组件之间不一定完全独立，实现不同功能的各组件可能会涉及一个或多个相同的部件；(2)显微镜，用于对聚焦进行调节。在该情形下，定位控制单元200的控制过程是通过控制样品台的移动，使反应体系移动到基因测序仪中合适的位置，并通过控制显微镜与反应小室之间的距离，从而确定合适的采图位置。关于定位控制单元200的具体功能模块及控制方式，将在其后的实施例中详细阐述。(3)采图控制单元300用于激发反应体系中核苷酸携带的标记物发光，并在上述采图位置获取图像信号。在本发明中，基因测序仪内部具有与采图控制单元300对应的多个组件，采图控制单元300实际上是通过控制部分组件的操作，从而激发反应体系中核苷酸携带的标记物发光，并通过控制另一部分组件的操作，从而在采图位置获取图像信号。试以一种类型的基因测序仪为例说明上述控制过程，在该具体情形中，基因测序仪内包括如下与采图控制单元300对应的组件(1)激发光源；(2)CCD，用于拍摄图像。在该情形下，采图控制单元300 的控制过程是通过控制激发光源发光，激发反应体系中核苷酸携带的标记物发光，并通过控制CCD拍摄图像，从而获取图像信号。关于采图控制单元300的具体功能模块及控制方式，将在其后的实施例中详细阐述。在具体应用中，图2所示的上述系统利用样品控制单元400、反应控制单元100、定位控制单元200、采图控制单元300对基因测序仪中对应的各组件分别进行自动化操作，且能对不同组件进行有效的协调。更为重要的是，每项操作均充分考虑了基因测序各阶段的技术特点，包括反应控制单元100对试剂剂量及类型、反应温度、时间、洁净度等的控制，定位控制单元200对纳米级位移、聚焦调节等的控制，采图控制单元300对发光强度、光路调节、曝光时间计算、图像拍摄等的控制，均按照严格指标进行精确的操作。因此本发明的系统能大幅度提高测序过程的稳定性和效率，以及测序结果的准确性。图3示出了图2中的样品控制单元400在一个实施例中的结构，包括体系制备模块401、上样控制模块402。其中(1)体系制备模块401根据生物样品制备待测的基因片段库，并生成测序所需的反应体系。在本发明中，反应体系的样品制备过程是通过一个油包水的单分子DNA片段扩增体系来实现的。在油包水的体系中包含大量相互独立的反应滴，每个反应滴包含一个微珠，其上结合有待测的DNA片段。通过对油包水的体系进行PCR扩增，每一个磁珠将结合扩增后的多个拷贝数目的DNA片段，而这些片段均来自于同一个待测DNA模板。当然，本发明也可以不经过PCR扩增，针对单分子也可以进行后续操作，只是经PCR扩增后可以增强测序信号，提高测序质量。以图2中描述的基因测序仪组件的情形为例，该制备过程是利用体系制备模块 401对基因测序仪中的文库制备组件、反应体系制备组件进行控制，具体包括(a)体系制备模块401发送指令给文库制备组件，控制该组件在不同的实验条件下对生物样品进行一系列处理，使得生物样品完成几个阶段的转变，得到待测的基因片段库。需说明的是，(b)体系制备模块401发送指令给反应体系制备组件，控制该组件进行油相、水相的混合，在一定条件下生成油包水的反应体系。上述(a)中，若最初获取的生物样品的类型、所处阶段不同，体系制备模块401就会对应多种不同的处理方式。在一个实施例中，若最初获取的生物样品是组织细胞、细菌等，那么体系制备模块401将首先控制文库制备组件从这些组织细胞、细菌中提取RNA，并转录合成得到初始DNA片段。然后将初始DNA片段结合到微珠上，再将结合在微珠上的多个初始DNA片段酶切成长度相等的多个DNA标签，接着将每一 DNA标签连接一段通用序列， 最后对连有通用序列的每一 DNA标签进行扩增，得到待测的基因片段库。在另一实施例中， 若最初获取的生物样品已经是经过提取、转录合成得到的初始DNA片段，那么体系制备模块401则控制文库制备组件将初始DNA片段结合到微珠上，再将结合在微珠上的多个初始 DNA片段酶切成长度相等的多个DNA标签，接着将每一 DNA标签连接一段通用序列，最后对连有通用序列的每一 DNA标签进行扩增，得到待测的基因片段库。上述(b)中，油包水反应体系的制备有多种方式。在一个实施例中，体系制备模块 401首先控制反应体系制备组件建立包含修饰后的微珠在内的PCRmix水相体系，例如建立如下水相体系(I)IOXPCR buffer, 15 μ L ； (2) dNTP，3 μ L ； (3)DNA 模板，2 μ L ； (4)引物结合后的微珠，5 μ L ； (5) Taq 酶，9 μ L ； (6)Mg2+，3 μ L ； (7) ddH20，114 μ L ； (8)在水相体系中优选加入能够加快反应启动速度的一对小引物，上、下游两端各0.75 μ L。体系制备模块401 然后控制反应体系制备组件建立油脂类溶液构成的油相体系，然后将水相体系注入到油相体系，在一定条件下震荡混勻成为乳浊液。该条件例如，震荡频率15ΗΖ，时间15s。上述油包水反应体系可在多种容器中制备，例如试管中。(2)上样控制模块402将反应体系设置到基因测序仪中。
以图2中描述的基因测序仪组件的情形为例，该设置过程是利用上样控制模块 402对基因测序仪中的机械手进行控制，将反应体系设置到基因测序仪中的可活动组件中。 在一个实施例中，上样控制模块402发送指令给机械手，将前述的试管中的油包水反应体系导入一反应小室，再将反应小室安装到样品台的特定位置。至此，完成了自动化的样品制备及上样操作，则可以开始进行测序。图4示出了图2中的反应控制单元100在一个实施例中的结构，包括试剂控制模块101、温控模块102。其中(1)试剂控制模块101用于控制基因测序仪对试剂进行选择，并吸取对应的试剂， 导入反应体系。以图2中描述的基因测序仪组件的情形为例，试剂控制模块101的具体控制过程是通过串口通信方式来实现的，具体过程是试剂控制模块101确定不同阶段所需取用的试剂类型，发送指令到机械手，控制机械手移动到试剂台上对应的试剂位置，并将固定于机械手上的软管插入试剂中；试剂控制模块101发送指令到泵，控制泵运转从而吸取试剂；试剂控制模块101吸取到所需的试剂后，发送指令到泵，继续控制泵运转将试剂打入反应小室。(2)温控模块102用于将反应体系的温度控制在反应所需的温度。以图2中描述的基因测序仪组件的情形为例，温控模块102的具体控制过程是通过串口通信方式来实现的，具体过程是温控模块102发送指令给温度传感器，控制温度传感器对反应小室的温度进行检测，并读取温度检测结果t ；温控模块102中设置了不同反应阶段的温度值T，当其获得温度检测结果t后，则将其与设置的温度值T进行对比；温控模块102进一步根据对比结果进行处理，若t < T，温控模块102发送指令给温控器中的升温装置，控制温控器中的升温装置启动，给反应小室加热，若t ^ T，则不需启动升温装置加热，升温装置通过外部环境自动冷却到温度T。对于其他情形下的基因测序仪组件，控制原理一致，具体过程可能存在差异。例如，在另一种情形下的基因测序仪组件中，相比于图2中描述的情形，温控器除了包括用于检测反应小室温度的温度传感器、给反应小室加热的升温装置，还包括给反应小室制冷的降温装置。那么在这种情形下，温控模块102的具体控制过程为温控模块102发送指令给温度传感器，控制温度传感器对反应小室的温度进行检测，并读取温度检测结果t ；温控模块102中设置了不同反应阶段的温度值T，当其获得温度检测结果t后，则将其与设置的温度值T进行对比；温控模块102进一步根据对比结果进行处理，若t < T，温控模块102发送指令给温控器中的升温装置，控制温控器中的升温装置启动，给反应小室加热，若t彡T， 温控模块102发送指令给温控器中的降温装置，控制温控器中的降温装置启动，对反应小室制冷。由上可知，试剂控制模块101可对试剂类型、试剂剂量、试剂传输速度等进行精确的控制，温控模块102可对温度检测、温度设置、加热、制冷等进行严格控制，从而保证了反应体系的生化反应过程顺利进行，也因此提高了整个测序过程的稳定性、效率及准确性。图5示出了图2中的定位控制单元200在一个实施例中的结构，包括位移模块 201、聚焦模块202。其中(1)位移模块201用于检测反应体系在基因测序仪中的当前位置，并控制其移动到其所在平面上的目标位置。本发明中，位移模块201可通过多种方式控制反应体系的移动。在一个实施例中，基因测序仪中与定位控制单元200对应的组件为前述图2中描述的情形，位移模块201的具体控制过程是通过串口通信方式来实现的位移模块201首先发送指令给样品台，读取样品台在其所在平面上的初始位置坐标，例如为(Xtl, Y0)；确定反应体系在其所在平面上的目的坐标(X，Y)后，位移模块201再发送指令给样品台，控制样品台从(X。，Y0)平移到目的坐标(X，Y)。(2)聚焦模块202用于控制基因测序仪的焦距调节，确定反应体系的采图位置。本发明中，聚焦模块202可通过多种方式确定反应体系的采图位置，下面以图2中描述的基因测序仪组件的情形为例进行说明。在一个实施例中，聚焦模块202的具体控制过程是通过串口通信方式来实现的 聚焦模块202首先发送指令给显微镜，控制显微镜在与样品台垂直方向上移动，通过调节显微镜与反应小室之间的距离，将清晰度最佳的位置确定为采图位置。在另一实施例中，聚焦模块202发送指令给样品台，控制样品台在其所在平面的垂直方向上移动，通过调节反应小室与显微镜之间的距离，将清晰度最佳的位置确定为采图位置。在上述两个实施例中，聚焦模块202可通过多种方式确定图像清晰度最佳的位置。例如，可通过显微镜镜头观察对比的方式确定图像清晰度最佳的位置，或者利用算法计算图像清晰度、利用算法自动调节图像清晰度，等等。由上可知，位移模块201可对微纳米级的位移进行精确的自动控制，聚焦模块202 可对聚焦调节、清晰度判断等进行精确的自动控制，从而能快速、准确地确定最佳的采图位置，也因此提高了测序过程的稳定性、效率及准确性。图6示出了图2中的采图控制单元300在一个实施例中的结构，包括激发模块 301、拍照模块302、图像存取模块303。其中(1)激发模块301用于控制特定波长的激发光照射反应体系，使反应体系中核苷酸携带的标记物发光。在本发明中，激发模块301可通过多种方式使标记物发光。在一个实施例中，基因测序仪中与采图控制单元300对应的组件为前述图2中描述的情形，那么激发模块301发送指令给激发光源，启动激发光源发光，使光线照射到样品台上的反应小室。在本实施例中，反应体系中微珠上核苷酸携带的标记物为荧光标记物，其受到特定波长的光源激发后就可发出荧光。(2)拍照模块302确定曝光时间，并采用所述曝光时间对反应体系拍照，获取图像信号。在本发明中，拍照模块302可通过多种方式获取图像信号。在一个实施例中，基因测序仪中与采图控制单元300对应的组件为前述图2中描述的情形，那么拍照模块302首先确定合适的曝光时间值，然后发送指令给(XD，控制CXD按照该曝光时间值拍摄荧光图。本发明的拍照模块302可通过多种方式确定合适的曝光时间值，例如根据情况进行人为设置，或者设置为多次测序过程累积的曝光时间经验值，或者通过算法计算出合适的曝光时间值，等等。在此前现有技术的基因测序控制系统中，大部分采用了人为设置的方式，本发明则具有多种可选模式，旨在根据不同的情况确定最佳的曝光时间值，从而提高图像信号的质量。(3)图像存取模块303与拍照模块302进行通信，用于保存获取的图像信号。本发明中图像存取模块303可采用多种格式存储图像信号。在前述实施例中，拍照模块302控制CCD拍摄荧光图后，发送给图像存取模块303，图像存取模块303可以采用特殊的高保真图像存储格式保存荧光图，也可以采用普通的图像存储格式，例如TIFF、EPS、PNG、PSD格式等。本发明的保护范围不应受到图像存储格式的限制。由上可知，激发模块301可对激发光源的发光光路等进行精确控制，拍照模块302 可对曝光时间值的确定、图像拍摄等进行精确控制，图像存取模块303可采用最佳的图像格式存储图像信号，从而保证了所获取的图像信号的质量，极大地提高了测序结果的准确性，且该自动化控制方式也提高了测序过程的稳定性和效率。本发明对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法流程基于图1所示的系统， 该系统包括控制系统1，和与其相连的至少一台基因测序仪。具体内容参考前述图1中的表述，此处不再赘述。该方法流程包括如下步骤控制系统1控制基因测序仪将试剂导入反应体系，并调节反应体系的温度；控制系统1控制反应体系在基因测序仪中的移动，并确定采图位置；控制系统1激发反应体系中核苷酸携带的标记物发光，并在采图位置获取图像信号。图7示出了本发明一个实施例中对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法流程，该方法流程基于前述图2所示的系统。该系统包括控制系统1，和与其相连的至少一台基因测序仪，具体内容此处不再赘述。图7所示的方法流程包括以下步骤步骤S0，控制生物样品的制备，生成反应体系并将其设置到基因测序仪中。关于步骤Sl的具体内容，将在其后的实施例中详细阐述。步骤Si，控制系统1利用其反应控制单元100控制基因测序仪将试剂导入反应体系，并调节反应体系的温度。关于步骤Sl的具体内容，将在其后的实施例中详细阐述。步骤S2，控制系统1利用其定位控制单元200控制反应体系在基因测序仪中的移动，并确定采图位置。关于步骤S2的具体内容，将在其后的实施例中详细阐述。步骤S3，控制系统1利用其采图控制单元300激发反应体系中核苷酸携带的标记物发光，并在采图位置获取图像信号。关于步骤S3的具体内容，将在其后的实施例中详细阐述。在具体应用中，图7所示的上述方法对基因测序仪中对应的各组件分别进行自动化操作，且能对不同组件进行有效的协调。更为重要的是，每项操作均充分考虑了基因测序各阶段的技术特点，包括步骤Sl对试剂剂量及类型、反应温度、时间、洁净度等的控制，步骤S2对纳米级位移、聚焦调节等的控制，步骤S3对发光强度、光路调节、曝光时间计算、图像拍摄等的控制，均按照严格指标进行精确的操作。因此上述方法能大幅度提高测序过程的稳定性和效率，以及测序结果的准确性。图8示出了图7中步骤SO在一个实施例中的方法流程，包括步骤S01，根据生物样品制备待测的基因片段库，并生成测序所需的反应体系。在本发明中，反应体系的样品制备过程是通过一个油包水的单分子DNA片段扩增体系来实现的。在油包水的体系中包含大量相互独立的反应滴，每个反应滴包含一个微珠，其上结合有待测的DNA片段。通过对油包水的体系进行PCR扩增，每一个磁珠将结合扩增后的多个拷贝数目的DNA片段，而这些片段均来自于同一个待测DNA模板。当然，本发明也可以不经过 PCR扩增，针对单分子也可以进行后续操作，只是经PCR扩增后可以增强测序信号，提高测
序质量。在一个实施例中，以图2中描述的基因测序仪组件的情形为例，步骤SOl具体包括(a)体系制备模块401发送指令给文库制备组件，控制该组件在不同的实验条件下对生物样品进行一系列处理，使得生物样品完成几个阶段的转变，得到待测的基因片段库。需说明的是，(b)体系制备模块401发送指令给反应体系制备组件，控制该组件进行油相、水相的混合，在一定条件下生成油包水的反应体系。上述(a)中，若最初获取的生物样品的类型、所处阶段不同，体系制备模块401就会对应多种不同的处理方式。在一个实施例中，若最初获取的生物样品是组织细胞、细菌等，那么体系制备模块401将首先控制文库制备组件从这些组织细胞、细菌中提取RNA，并转录合成得到初始DNA片段。然后将初始DNA片段结合到微珠上，再将结合在微珠上的多个初始DNA片段酶切成长度相等的多个DNA标签，接着将每一 DNA标签连接一段通用序列， 最后对连有通用序列的每一 DNA标签进行扩增，得到待测的基因片段库。在另一实施例中， 若最初获取的生物样品已经是经过提取、转录合成得到的初始DNA片段，那么体系制备模块401则控制文库制备组件将初始DNA片段结合到微珠上，再将结合在微珠上的多个初始 DNA片段酶切成长度相等的多个DNA标签，接着将每一 DNA标签连接一段通用序列，最后对连有通用序列的每一 DNA标签进行扩增，得到待测的基因片段库。上述(b)中，油包水反应体系的制备有多种方式。在一个实施例中，体系制备模块 401首先控制反应体系制备组件建立包含修饰后的微珠在内的PCRmix水相体系，例如建立如下水相体系(I)IOXPCR buffer, 15 μ L ； (2) dNTP，3 μ L ； (3)DNA 模板，2 μ L ； (4)引物结合后的微珠，5 μ L ； (5) Taq 酶，9 μ L ； (6)Mg2+，3 μ L ； (7) ddH20，114 μ L ； (8)在水相体系中优选加入能够加快反应启动速度的一对小引物，上、下游两端各0.75 μ L。体系制备模块401 然后控制反应体系制备组件建立油脂类溶液构成的油相体系，然后将水相体系注入到油相体系，在一定条件下震荡混勻成为乳浊液。该条件例如，震荡频率15ΗΖ，时间15s。上述油包水反应体系可以在多种容器中制备，例如试管中。(2)上样控制模块402将反应体系设置到基因测序仪中。以图2中描述的基因测序仪组件的情形为例，该设置过程是利用上样控制模块 402对基因测序仪中的机械手进行控制，将反应体系设置到基因测序仪中的可活动组件中。 在一个实施例中，上样控制模块402发送指令给机械手，将前述的试管中的油包水反应体系导入一反应小室，再将反应小室安装到样品台的特定位置。至此，完成了自动化的样品制备及上样操作，则可以开始进行测序。图9示出了图7中步骤Sl在一个实施例中的方法流程，该方法流程基于图1、图2 所示的系统。在该系统中，反应控制单元100包括试剂控制模块101、温控模块102。步骤 Sl包括步骤S11，试剂控制模块101控制基因测序仪对试剂进行选择，并吸取对应的试剂，导入反应体系。本发明中步骤Sll存在多种具体实现方式，若基因测序仪中与反应控制单元100对应的组件为前述图2中描述的情形，则其控制过程是试剂控制模块101确定不同阶段所需取用的试剂类型，发送指令到机械手，控制机械手移动到试剂台上对应的试剂位置，并将固定于机械手上的软管插入试剂中；试剂控制模块101发送指令到泵，控制泵运转从而吸取试剂；试剂控制模块101吸取到所需的试剂后，发送指令到泵，继续控制泵运转将试剂打入反应小室。步骤S12，温控模块102将反应体系的温度控制在反应所需的温度。本发明中步骤 S12存在多种具体实现方式，下面将通过不同的实施例进行详细阐述。在一个实施例中，以图2中描述的基因测序仪组件的情形为例，步骤S12通过串口通信方式实现，具体过程是温控模块102发送指令给温度传感器，控制温度传感器对反应小室的温度进行检测，并读取温度检测结果t ；温控模块102中设置了不同反应阶段的温度值T，当其获得温度检测结果t后，则将其与设置的温度值T进行对比；温控模块102进一步根据对比结果进行处理，若t < T，温控模块102发送指令给温控器中的升温装置，控制温控器中的升温装置启动，给反应小室加热，若t ^ T，则不需启动升温装置加热，升温装置通过外部环境自动冷却到温度T。对于其他情形下的基因测序仪组件，控制原理一致，具体过程可能存在差异。例如，在另一实施例中，若基因测序仪组件与图2中描述的情形相比，温控器除了包括用于检测反应小室温度的温度传感器、给反应小室加热的升温装置，还包括给反应小室制冷的降温装置。那么在这种情形下，步骤S12的实现过程为温控模块102发送指令给温度传感器，控制温度传感器对反应小室的温度进行检测，并读取温度检测结果t ；温控模块102中设置了不同反应阶段的温度值T，当其获得温度检测结果t后，则将其与设置的温度值T进行对比；温控模块102进一步根据对比结果进行处理，若t < T，温控模块102发送指令给温控器中的升温装置，控制温控器中的升温装置启动，给反应小室加热，若t ^ T，温控模块 102发送指令给温控器中的降温装置，控制温控器中的降温装置启动，对反应小室制冷。由图9可知，步骤S11可对试剂类型、试剂剂量、吸取速度、打出速度等进行精确的控制，步骤S12可对温度检测、温度设置、加热、制冷等进行严格控制，从而保证了反应体系的生化反应过程顺利进行，也因此提高了整个测序过程的稳定性、效率及准确性。图10示出了图7中步骤S2在一个实施例中的方法流程。步骤S21，检测反应体系在基因测序仪中的当前位置，并控制其移动到其所在平面上的目标位置。本发明中，步骤S21可通过多种方式控制反应体系的移动。在一个实施例中，基因测序仪中与定位控制单元200对应的组件为前述图2中描述的情形，步骤S21是通过串口通信方式来实现的位移模块201首先发送指令给样品台， 读取样品台在其所在平面上的初始位置坐标，例如为(Xci, Y0)；确定反应体系在其所在平面上的目的坐标(Χ，Υ)后，位移模块201再发送指令给样品台，控制样品台从(H)平移到目的坐标(Χ，Υ)。步骤S22，控制基因测序仪的焦距调节，确定反应体系的采图位置。本发明中，步骤S22可通过多种方式确定反应体系的采图位置，下面以图2中描述的基因测序仪组件的情形为例进行说明。在一个实施例中，步骤S22是通过串口通信方式来实现的聚焦模块202首先发送指令给显微镜，控制显微镜在与样品台垂直方向上移动，通过调节显微镜与反应小室之间的距离，将清晰度最佳的位置确定为采图位置。
在另一实施例中，步骤S22仍然是通过串口通信方式来实现的聚焦模块202发送指令给样品台，控制样品台在其所在平面的垂直方向上移动，通过调节反应小室与显微镜之间的距离，将清晰度最佳的位置确定为采图位置。在上述两个实施例中，步骤S22可通过多种方式确定图像清晰度最佳的位置。例如，可通过显微镜镜头观察对比的方式确定图像清晰度最佳的位置，或者利用算法计算图像清晰度、利用算法自动调节图像清晰度，等等。由上可知，步骤S21可对微纳米级的位移进行精确的自动控制，步骤S22可对聚焦调节、清晰度判断等进行精确的自动控制，从而能快速、准确地确定最佳的采图位置，也因此提高了测序过程的稳定性、效率及准确性。图11示出了图7中步骤S3在一个实施例中的方法流程。步骤S31，控制特定波长的激发光照射反应体系，使反应体系中核苷酸携带的标记物发光。在本发明中，步骤S31可通过多种方式实现。在一个实施例中，基因测序仪中与采图控制单元300对应的组件为前述图2中描述的情形，那么步骤S31的实现过程是激发模块301发送指令给激发光源，启动激发光源发光，使光线照射到样品台上的反应小室。在本实施例中，反应体系中微珠上核苷酸携带的标记物为荧光标记物，其受到特定波长的光源激发后就可发出荧光。步骤S32，确定曝光时间，并采用该曝光时间对反应体系拍照，获取图像信号。在本发明中，步骤S32可通过多种方式实现。继续在前述步骤S31的实施例中，基因测序仪中与采图控制单元300对应的组件为前述图2中描述的情形，那么在步骤S32中，首先由拍照模块302确定合适的曝光时间值，然后发送指令给CCD，控制CCD按照该曝光时间值拍摄荧光图。本发明的步骤S32可通过多种方式确定合适的曝光时间值，例如根据情况进行人为设置，或者设置为多次测序过程累积的曝光时间经验值，或者通过算法计算出合适的曝光时间值，等等。在此前现有技术的基因测序控制系统中，大部分采用了人为设置的方式， 本发明则具有多种可选模式，旨在根据不同的情况确定最佳的曝光时间值，从而提高图像信号的质量。步骤S33，保存获取的图像信号。本发明中图像存取模块303可采用多种格式存储图像信号。步骤S33可通过多种方式实现。继续在前述步骤S31、S32的实施例中，步骤S33的实现方式是拍照模块302将 CCD拍摄的荧光图发送给图像存取模块303，图像存取模块303可以采用特殊的高保真图像存储格式保存荧光图，也可以采用普通的图像存储格式，例如TIFF、EPS、PNG、PSD格式等。由上可知，步骤S31可对激发光源的发光光路等进行精确控制，步骤S32可对曝光时间值的确定、图像拍摄等进行精确控制，步骤S33可采用最佳的图像格式存储图像信号， 从而保证了所获取的图像信号的质量，极大地提高了测序结果的准确性，且该自动化控制方式也提高了测序过程的稳定性和效率。为了更加清楚地阐释本发明，申请人将以一个具体的实验过程为例说明一个公知的生物样品处理并进行基因测序的全过程。该应用场景是采用某种公知的测序方法对DNA 进行测序(1)从所获取的细菌样品中提取RNA，转录合成得到初始DNA片段。
(2)将初始DNA片段结合到微珠上，再将结合在微珠上的多个初始DNA片段酶切成长度相等的多个DNA标签，接着将每一 DNA标签连接一段通用序列。(3)对连有通用序列的每一 DNA标签进行扩增，得到待测的基因片段库。(4)将待测基因片段上3’端修饰的微珠沉积于上样玻片，在沉积过程中可对微珠密度进行调节，以达到最大通量。(5)向反应体系中加入DNA连接酶、通用测序引物η和具有3’-XXrmnZZZ-5’结构的八聚核苷酸。在这个八聚核苷酸中，第1和第2位(XX)上的碱基是确定的，并根据种类的不同在第6-8位(ΖΖΖ)上加了不同的荧光标记。这种由两个碱基决定的测序方法被称为两碱基测序(two base encoding)。(6)当八聚核苷酸由于第1和第2位配对而被连接酶连接上时，经特定波长的光激发，会发出荧光。(7)在记录下荧光信息后，通过化学方法在第5和第6位之间进行切割，淬灭荧光信号，以进行下个位置的测序。通过这种方法，每次测序的位置都相差五位，即第一次测第1和第2位，第二次测
第6和第7位......在测到末尾后，将新合成的链变性、洗脱。而后用通用测序引物n-1进
行第二轮测序。通用测序引物n-1与通用测序引物η的差别是，二者在与接头配对的位置上相差一个碱基，即通用测序引物n-1在通用测序引物η配对位置上向3’端移动了一个碱基。
因此在加入DNA连接酶和八聚核苷酸后，可以测定第0和第1位、第5和第6位......第二
轮测序完成后，接下来再分别加入通用测序引物η-2、通用测序引物η-3、通用测序引物η-4 进行第三轮、第四轮、第五轮测序，最终可以完成全部位置的测定。上述的测序过程，每一轮都涉及多次试剂取用、温度调控、时间控制等，不论是单纯的人工操作，还是人工控制仪器操作，均无法充分保证实验的稳定性、效率及准确性。而利用本发明的控制方法及系统，只需把制备好的反应体系设置在基因测序仪中，选择针对不同样品的测序模式，就可以使基因测序仪自动运行上述各个步骤，无需手工操作。若基于图2所示的系统及图7所示的方法，上样后经过基因测序仪的自动测序过程，可快速采集到图像信号；若基于图3所示的系统及图8所示的方法，上样后经过基因测序仪的自动测序过程，可直接得到基因序列信息，例如碱基排列顺序、致病基因位点等。应当说明的是，本发明的方法及系统适用于对各种类型的生物样品进行处理，并在此基础上对基因测序仪的测序过程进行自动化控制。即便不同类型的生物样品在处理方式上可能存在差异，或者不同类型的基因测序仪在具体内部结构上可能存在差异，但上述的控制系统及控制方法在根本原理上是一致或类似的，因此本发明的保护范围不应受到不同类型的生物样品，或者不同类型的基因测序仪的内部结构的限制。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种对生物样品处理及测序进行自动化控制的系统，其特征在于，所述系统包括样品控制单元、反应控制单元、定位控制单元、采图控制单元；所述样品控制单元用于控制生物样品的制备，生成反应体系并将其设置到基因测序仪中；所述反应控制单元用于控制基因测序仪将试剂导入反应体系，并在测序过程中调节反应体系的温度；所述定位控制单元用于控制反应体系在基因测序仪中的移动，并确定采图位置； 所述采图控制单元用于激发反应体系中核苷酸携带的标记物发光，并在所述采图位置获取图像信号。
2.根据权利要求1所述的对生物样品处理及测序进行自动化控制的系统，其特征在于，所述样品控制单元包括体系制备模块、上样控制模块；所述体系制备模块根据生物样品制备待测的基因片段库，并处理成测序所需的反应体系；所述上样控制模块将反应体系设置到基因测序仪中的确定位置。
3.根据权利要求1所述的对生物样品处理及测序进行自动化控制的系统，其特征在于，所述反应控制单元包括试剂控制模块、温控模块；所述试剂控制模块用于控制基因测序仪对试剂进行选择，并吸取对应的试剂，导入反应体系；所述温控模块用于将反应体系的温度控制在反应所需的温度。
4.根据权利要求1所述的对生物样品处理及测序进行自动化控制的系统，其特征在于，所述定位控制单元包括位移模块、聚焦模块；所述位移模块用于检测反应体系在基因测序仪中的当前位置，并控制其移动到其所在平面上的目标位置；所述聚焦模块用于控制基因测序仪的焦距调节，确定反应体系的采图位置。
5.根据权利要求4所述的对生物样品处理及测序进行自动化控制的系统，其特征在于，所述聚焦模块通过调节显微镜与反应小室之间的距离，将清晰度最佳的位置确定为采图位置。
6.根据权利要求1所述的对生物样品处理及测序进行自动化控制的系统，其特征在于，所述采图控制单元包括激发模块、拍照模块、图像存取模块；所述激发模块用于控制特定波长的激发光照射反应体系，使反应体系中核苷酸携带的标记物发光；所述拍照模块确定曝光时间，并采用所述曝光时间对反应体系拍照，获取图像信号； 所述图像存取模块与拍照模块进行通信，用于保存获取的图像信号。
7.一种根据权利要求1所述系统对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤A.控制生物样品的制备，生成反应体系并将其设置到基因测序仪中；B.控制基因测序仪将试剂导入反应体系，并调节反应体系的温度；C.控制反应体系在基因测序仪中的移动，并确定采图位置；D.激发反应体系中核苷酸携带的标记物发光，并在所述采图位置获取图像信号。
8.根据权利要求7所述的对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法，其特征在于，所述步骤A包括Al.根据生物样品制备待测的基因片段库，并处理成测序所需的反应体系；A2.将所述反应体系设置到基因测序仪中的确定位置。
9.根据权利要求7所述的对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法，其特征在于，所述步骤B包括B 1.控制基因测序仪对试剂进行选择，并吸取对应的试剂，导入反应体系；B2.将反应体系的温度控制在反应所需的温度。
10.根据权利要求7所述的对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法，其特征在于，所述步骤C包括Cl.检测反应体系在基因测序仪中的当前位置，并控制其移动到其所在平面上的目标位置；C2.控制基因测序仪的焦距调节，确定反应体系的采图位置。
11.根据权利要求10所述的对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法，其特征在于，所述步骤C2包括通过调节显微镜与反应小室之间的距离，将清晰度最佳的位置确定为采图位置。
12.根据权利要求7所述的对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法，其特征在于，所述步骤D包括Dl.控制特定波长的激发光照射反应体系，使反应体系中核苷酸携带的标记物发光；D2.确定曝光时间，并采用所述曝光时间对反应体系拍照，获取图像信号；D3.保存获取的图像信号。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，提供了一种对生物样品处理及测序进行自动化控制的方法及系统。所述方法包括以下步骤A.控制生物样品的制备，生成反应体系并将其设置到基因测序仪中；B.控制基因测序仪将试剂导入反应体系，并调节反应体系的温度；C.控制反应体系在基因测序仪中的移动，并确定采图位置；D.激发反应体系中核苷酸携带的标记物发光，并在所述采图位置获取图像信号。所述系统包括样品控制单元、反应控制单元、定位控制单元、采图控制单元，分别用于执行上述方法中的各步骤。本发明通过对生物样品的制备及上样进行自动化控制，以及对基因测序的测序过程进行自动化控制，不仅提高了测序过程的稳定性和效率，而且提高了测序结果的准确性。
文档编号C12M1/38GK102321535SQ201110258910
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月1日 优先权日2011年9月1日
发明者盛司潼 申请人:盛司潼