专利名称：一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pi1、Pi2的检测方法
技术领域：
本发明属于分子育种技术领域，涉及分子标记辅助选择双基因的检测方法，特别是一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pil、Pi2的检测方法。
背景技术：
稻瘟病是全世界范围内影响水稻生产的重要病害之一，全世界已有80多个国家报道此病害发生，每年造成的粮食损失近1000万吨，我国每年由此造成的稻谷损失也达上亿公斤，培育和种植抗病品种是防治稻瘟病最有效和最安全的措施。但是，传统的抗病育种，需要大量的田间工作，周期长，同时对育种目标的选择受到很多因素的干扰，而新育成的品种在连续多代种植之后，品种的抗性因稻瘟病菌的生理小种变异而很快损失，抗稻瘟病能力往往表现衰退，因而培育具有持久抗性的水稻新品种成为水稻科研的重要课题。而近年来迅速发展起来的分子标记辅助选择技术(M/^)可弥补传统育种选择技术准确率低的缺点来加快育种进程，同时又选择抗谱较广、具持久抗性的抗病基因作为抗源来培育新品种，从而延长抗稻瘟病品种的寿命。至今水稻中已经有80多个抗稻瘟病基因被标记定位，其中13个已经克隆。被鉴定的广谱抗性基因包括Pil、Pi2、 Pi3、Piz、Pi9、Piz-t、Pi33、Pigm等。近年来，抗病基因在水稻抗病分子育种中有较多应用， Hittalmani等将Pil、Piz5和Pita基因聚合到水稻品系BL125中；Narayanan等将Pil、 Piz5聚合到C039中；陈学伟等将Pidl、Pib和Pita聚合到G46B中等。实践证明，利用分子标记辅助选择技术，将不同的抗稻瘟病基因聚合到一个品种中可有效增强水稻品种的持久抗瘟性。分子标记辅助选择技术(MAS)虽然已应用于育种实践，但仍需要解决的问题之一是减少标记基因型的检测成本，从而能使其大范围、规模化地运用于商业化的育种程序中去。然而，常规的DNA检测程序，其DNA的提取过程复杂，费时费力；PCR反应体系耗费的试剂量大且反应时间长；也不能对同一个体中的多个标记位点进行同步检测。因此，对大的育种群体而言，其标记基因型检测耗时长，成本也相对较高。本发明的目的在于提供一种在水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种过程中，能够对抗稻瘟病双基因Pil和Pi2进行快捷、准确、稳定检测的方法，以适用于规模化、产业化的分子标记辅助育种的需要。其技术方案是一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pil、Ρ 2的检测方法，其特征在于其具体步骤是1) DNA 提取取单株叶片l.OcmX 1.0cm左右大小的样品，放入96孔PCR管中，加入NaOH溶液， 在沸水中煮45sec后加入Tris-HCI，在沸水中煮沸^iin后置冰上冷却待用；2) PCR 反应在PCR反应管中分别加入样品DNA提取液、Buffer、dNTP、引物PI、引物P2、ddH20和Taq酶；先94°C预变性4'；再94°C变性15〃，55°C退火15〃，72°C延伸30"，35个循环; 72°C延伸7'；反应完成后，加入6XLoading buffer终止反应，置4°C环境下保存备用；3)聚丙烯酰胺凝胶电泳将分离胶缓慢注入两玻璃板之间，静置凝固半小时以上；将玻璃板装上电泳槽， 2000V,90ff预热半小时；插梳子，点样；2000V，85W条件下电泳；下胶后，将胶板用清水漂洗 15"；放入染色液盆中染色8'；取出胶板，用清水漂洗25"；放入显影液中显影至DNA带清晰，再水洗1 ‘；待胶板晾干后于读X光片的灯箱下观察记录结果；4)结果分析用上述方法分别获取抗稻瘟病基因供体亲本、受体亲本以及两者的杂交或回交后代的电泳谱带，对比各种基因型谱带，找出杂交或回交后代群体中具体导入Pil和Pi2两个抗稻瘟病基因单株的情况，以便指导育种程序中下一步的杂交选配和目的材料的筛选。其技术效果是本发明采用快速DNA提取法提取植株的DNA，利用两对SSR标记 Pl (与抗稻瘟病基因Pil紧密连锁)和P2(与抗稻瘟病基因Pi2紧密连锁)对抗稻瘟病基因的供体亲本(同时含有Pil和Pi2抗稻瘟病基因)、受体亲本(不含有Pil或Pi2抗稻瘟病基因)以及两者的杂交或回交后代的基因组DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，同步检测各单株在两个抗病基因位点上的基因型，通过各种基因型的比对，找出杂交或回交后代群体中导入了单个或同时导入了两个抗稻瘟病基因的单株，指导育种程序中下一步的杂交选配和目的材料的筛选。其检测效率较常规的CTAB法提取DNA，以及单标记逐一检测单株在两个抗病位点的基因型有了显著的提高，同时成本也得到了较大程度的减少， 适用于规模化、产业化的分子标记辅助育种(详见附表1)。附表1本发明检测方法与常规检测方法在时间与试剂耗材成本上的对照表
权利要求
1.一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pil、Pi2的检测方法，其特征在于其具体步骤是1)DNA提取取单株叶片1. OcmX 1. Ocm左右大小的样品，放入96孔PCR管中，加入NaOH溶液，在沸水中煮45sec后加入Tris-HCI，在沸水中煮沸^iin后置冰上冷却待用；2)PCR反应在PCR反应管中分别加入样品DNA提取液、Buffer、dNTP、引物P1、引物P2、ddH20和Taq 酶；先94°C预变性4'；再94°C变性15〃，55°C退火15〃，72°C延伸30〃，；35个循环；72°C 延伸T ；反应完成后，加入6 X Loading buffer终止反应，置4°C环境下保存备用；3)聚丙烯酰胺凝胶电泳将分离胶缓慢注入两玻璃板之间，静置凝固半小时以上；将玻璃板装上电泳槽，2000V， 90W预热半小时；插梳子，点样；2000V，85W条件下电泳；下胶后，将胶板用清水漂洗15“；放入染色液盆中染色8'；取出胶板，用清水漂洗25"；放入显影液中显影至DNA带清晰，再水洗1 ‘；待胶板晾干后于读X光片的灯箱下观察记录结果；4)结果分析用上述方法分别获取抗稻瘟病基因供体亲本、受体亲本以及两者的杂交或回交后代的电泳谱带，对比各种基因型谱带，找出杂交或回交后代群体中具体导入Pil和Pi2两个抗稻瘟病基因单株的情况，以便指导育种程序中下一步的杂交选配和目的材料的筛选。
2.根据权利要求1所述的一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pil、Ρ 2的检测方法，其特征在于所述样品DNA提取液中NaOH溶液与Tris-HCI溶液的体积比为1 1。
3.根据权利要求1所述的一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pil、Ρ 2的检测方法，其特征在于所述PCR反应中加入的Pl和P2两对引物，其中，引物Pl序列为，PlF 5，-GTGCATGAGTCCAGCTCGCA-3',PlR :5，-GTGTACTCCCATGGCTGCTC-3，；引物 P2 序列为，P2F 5’ -ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC-3’，P2R5’ -AAGTGGAGGCAGTTCACCAC-3 ’。
4.根据权利要求1所述的一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pil、Ρ 2的检测方法，其特征在于所述PCR反应中样品DNA提取液、Buffer、dNTP、引物PI、引物P2、Taq酶和 ddH20 的体积比为1. 0 1. 0 0. 4 0. 25 0. 25 0. 1 7. 0。
5.根据权利要求1所述的一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pil、Ρ 2的检测方法，其特征在于所述PCR反应的程序是先94°C预变性4'；再94°C变性15"，55°C退火 15"，72°C延伸 30"，35 个循环；72°C延伸 7'。
6.根据权利要求1所述的一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pil、Ρ 2的检测方法，其特征在于所述分离胶由浓度4%的聚丙烯酰胺、浓度10%的过硫酸铵和N，N, N'， N'-四甲基乙二胺混合而成，其混合体积比为65 0.4 0.04。
7.根据权利要求1所述的一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pil、Ρ 2的检测方法，其特征在于所述聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，是在2000V，85W条件下，每电泳15分钟后重复点样一次，重复点样2 4次，且每次点样的样品不同。
全文摘要
本发明公开了一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pi1、Pi2的检测方法，其采用植株提取DNA，利用分别与抗稻瘟病基因Pi1和Pi2紧密连锁的P1和P2两对S SR标记，对抗稻瘟病基因的供体亲本、受体亲本以及两者的杂交或回交后代的基因组DNA进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，同步检测各单株在两个抗病基因位点上的基因型，并通过基因型的比对，找出杂交或回交后代群体中导入抗稻瘟病基因单株的情况，以便指导育种程序中下一步的杂交选配和目的材料的筛选。其检测效率较常规的CTAB法提取DNA，以及单标记逐一检测单株在两个抗病位点的基因型有了显著的提高，同时成本也有较大程度的减少，适用于规模化、产业化的分子标记辅助育种的需要。
文档编号C12Q1/68GK102312000SQ201110263420
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者周桂林, 徐继萍, 王兆贤, 陈会中, 陈庆全, 高前宝 申请人:合肥丰乐种业股份有限公司, 安徽农业大学