专利名称：一种提高阿维拉霉素发酵产量的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用不同营养因子添加到阿维拉霉素发酵培养基并提高其产量的方法。阿维拉霉素属于正糖霉素族的寡糖类抗生素，由绿色产绿链霉菌(Mi^ptomyces viridochromogenes)发酵产生的二氯异扁枝衣酸酯，是一种新型兽用消化促进剂和代谢调节剂。阿维拉霉素最先由美国礼来公司研制开发，在欧盟、日本、巴西、泰国等世界主要养殖业国家，均被广泛应用于畜禽饲料中，效果显著，是欧盟国家允许使用的兽用抗生素之一。尽管阿维拉霉素产品已在我国已上市，但由于阿维拉霉素生物合成与代谢调控的复杂， 在高单位的阿维拉霉素菌种选育及工艺研究上没有取得实质性突破，目前仍处于开发阶段。阿维拉霉素是以糖为骨架的低聚糖抗生素，其结构由末端的双氯晚霉素酸分子 (残基A)连接一个七糖链组成，分子结构如下。阿维拉霉素有多个活性组分，其中以阿维拉霉素A为主要组分。在阿维拉霉素生物合成中，其合成单元主要来源与糖代谢、磷酸戊糖等途径的单糖衍生物，但对于氨基酸、 以及富含不同氨基酸的有机氮源对阿维拉霉素生产菌的生长及产物合成的影响，还缺乏深入研究。氨基酸不仅能作为外源游离氨基酸被微生物直接吸收，以满足蛋白质等物质的生物合成，同时氨基酸还可以影响微生物初级代谢和次级代谢的代谢流分布情况。本实验对不同氨基酸、以及富含氨基酸的有机氮源进行筛选，获得一批明显促进阿维拉霉素合成的营养因子，可用于添加到发酵培养基中提高阿维拉霉素发酵产量。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提出一种应用不同氨基酸或富含不同氨基酸的有机氮源添加在发酵培养基中提高阿维拉霉素发酵产量的方法。用于实现本发明目的的具体技术解决方案如下
本发明使用的菌种为绿色产色链霉菌(^&印如耶⑶^ viridochromogenes Tii-57或 Streptomyces viridochromogenes NRRL2860)。本发明使用的发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖20，玉米淀粉40，豆油5，NaCl
背景技术：
LCaCO3 5, NaNO3 5，CaCl2 10，MgSO4 0. 04，CuSO4 0. 03, (NH4)2SO4 2，加自来水至 1L，消后 pH 控制在7.(Γ7.2，灭菌温度115 121°C，灭菌时间30 min。在发酵初始培养基中添加质量浓度为0. 051%的氨基酸或富含氨基酸的有机氮源。发酵工艺采用摇瓶发酵工艺，500mL摇瓶装液量50 mL,摇床转速180140 r/min，接种量为5 15%，培养温度为^ 30°C。其中氨基酸选自脯氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺的一种或多种组合，富含氨基酸的有机氮源为鱼粉、大豆蛋白胨、黄豆粉、麦芽浸粉的一种或多种组合。发酵培养6-10天后，取发酵液5ml，加丙酮5_20ml超声10_30min (19KHz, 200W, 5min)，离心，0. 44μ m滤膜过滤，用C18柱，以乙腈0.洲磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值为3) =51 49为流动相，波长为214nm检测阿维拉霉素产物A组分的产量。本发明所具有的优点
本发明结合阿维拉霉素生物合成代谢调控的特点，从氮调控的角度，筛选得到与阿维拉霉素合成有关的氨基酸以及富含氨基酸的有机氮源，在初始培养基中添加一定浓度的氨基酸或有机氮源，可以大幅度提高阿维拉霉素的发酵水平。本发明具有目的明确、发酵成本低等优点，可以应用于阿维拉霉素的发酵生产，以及用于大规模工业化生产。
具体实施例方式实施例1 发酵培养基成分为葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5g ,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自来水至 1L，消后 pH 控制在7. 0 7· 2，灭菌温度115 121 °C，灭菌时间30 min。在发酵培养基中添加质量浓度为0. 1%的脯氨酸。发酵工艺采用摇瓶发酵工艺， 500mL摇瓶装液量50 mL,摇床转速220 r/min，以“&卬如历凡然viridochromogenes NRRL 2860培养种子液，接种量为10%，培养温度为30°C。发酵培养8天后，取发酵液5ml，加丙酮IOml超声15 min (19KHz, 200W, 5min), 离心，0. 44 4!11滤膜过滤，用(18柱，以乙腈0.洲磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值为3) =51 49为流动相，波长为214nm检测阿维拉霉素产物A组分的产量达到0. 97g/l，阿维拉霉素A组分发酵产量比对照组提高了 4. 79%。实施例2 发酵培养基成分为葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5 g,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自来水至 1L，消后 pH 控制在7. 0 7· 2，灭菌温度115 121 °C，灭菌时间30 min。灭菌时间30 min，在发酵初始培养基中添加质量浓度为0.1%的苯丙氨酸。发酵工艺采用摇瓶发酵工艺，500mL摇瓶装液量50 mL,摇床转速220 r/min，以 viridochromogenes NRRI^860培养种子液，接种量为10%，培养温度为30°C。发酵培养9天后，取发酵液5ml，加丙酮20ml超声30 min (19KHz, 200W, 5min), 离心，0. 44 4!11滤膜过滤，用(18柱，以乙腈0.洲磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值为3) =51 49为流动相，波长为214nm检测阿维拉霉素产物A组分的产量达到1. 03 g/Ι，阿维拉霉素A组分发酵产量比对照组提高了 10. 95%。实施例3 发酵培养基成分为葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5g ,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自来水至 1L，消后 pH 控制在7. 0 7· 2，灭菌温度115 121 °C，灭菌时间30 min。
在发酵初始培养基中添加质量浓度为0. 1%的谷氨酰胺。发酵工艺采用摇瓶发酵工艺，500mL摇瓶装液量 50 mL,摇床转速 220 r/min,以viridochromogenes NRRL2860培养种子液，接种量为10%，培养温度为30°C。发酵培养8天后，取发酵液5ml，加丙酮15 ml超声20 min (19KHz, 200W, 5min)，离心，0. 44 μ m滤膜过滤，用C18柱，以乙腈0. 2%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值为3)=51 :49为流动相，波长为214nm检测阿维拉霉素产物A组分的产量达到0.95 g/Ι，阿维拉霉素A组分发酵产量比对照组提高了 2.58 %。实施例4:发酵培养基成分为葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5g ,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自来水至 1L，消后 pH 控制在7. 0 7· 2，灭菌温度115 121 °C，灭菌时间30 min。在发酵初始培养基中添加质量浓度为1. 5%的黄豆饼粉。发酵工艺采用摇瓶发酵工艺，500mL摇瓶装液量 50 mL,摇床转速 220 r/min,以viridochromogenes NRRL观60培养种子液，接种量为10%，培养温度为30°C。发酵培养7天后，取发酵液5ml，加丙酮10 ml超声15 min (19KHz, 200W, 5min)，离心，0. 44 μ m滤膜过滤，用C18柱，以乙腈0. 2%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值为3)=51 :49为流动相，波长为214nm检测阿维拉霉素产物A组分的产量达到0.5 g/Ι，阿维拉霉素A组分发酵产量比对照组提高了 26. 87%。实施例5 发酵培养基成分为葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5g ,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自来水至 1L，消后 pH 控制在7. 0 7· 2，灭菌温度115 121 °C，灭菌时间30 min。在发酵初始培养基中添加质量浓度为1.5%的大豆蛋白胨。发酵工艺采用摇瓶发酵工艺，500mL摇瓶装液量50 mL, 摇床转速220 r/min,以Sti^ptomyces viridochromogenes NRRI^860培养种子液，接种量为10%，培养温度为30°C。发酵培养8天后，取发酵液5ml，加丙酮20ml超声20 min (19KHz, 200W, 5min)， 离心，0. 44 μ m滤膜过滤，用C18柱，以乙腈0. 2%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值为3) =51 :49为流动相，波长为214nm检测阿维拉霉素产物A组分的产量达到0.41 g/Ι，阿维拉霉素A组分发酵产量比对照组提高了 49. 66%。实施例6 发酵培养基成分为葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5g ,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自来水至 1L，消后 pH 控制在7. 0 7· 2，灭菌温度115 121 °C，灭菌时间30 min。在发酵初始培养基中添加质量浓度为1. 5%的麦芽浸粉。发酵工艺采用摇瓶发酵工艺，500mL摇瓶装液量 50 mL,摇床转速 220 r/min,以viridochromogenes NRRL观60培养种子液，接种量为10%，培养温度为30°C。发酵培养8天后，取发酵液5ml，加丙酮10 ml超声10 min (19KHz, 200W, 5min)，离心，0. 44 μ m滤膜过滤，用C18柱，以乙腈0. 2%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值为3)=51 :49为流动相，波长为214nm检测阿维拉霉素产物A组分的产量达到0.38 g/Ι，阿维拉霉素A组分发酵产量比对照组提高了 38. 29%0实施例7 发酵培养基成分为葡萄糖20g，玉米淀粉40g，豆油5g ,NaCl lg, CaCO3 5g，NaNO3 5g，CaCl2 10g，MgSO4 0. 04g，CuSO4 0. 03g, (NH4)2SO4 2g，加自来水至 1L，消后 pH
5控制在7. 0 7· 2，灭菌温度115 121 °C，灭菌时间30 min。在发酵初始培养基中添加质量浓度为0. 5%的大豆蛋白胨和1%的麦芽浸粉。发酵工艺采用摇瓶发酵工艺，500mL摇瓶装液量50 mL,摇床转速220 r/min，以 viridochromogenes Tii-57 (制备见参考文献(Journal of Bacteriology, 1997, 179 (20) 6271-6278)培养种子液，接种量为10%，培养温度为30°C。发酵培养7天后，取发酵液5ml，加丙酮15 ml超声15 min (19KHz, 200W, 5min)，离心，0. 44 μ m滤膜过滤，用C18柱，以乙腈0. 2%磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值为3)=51 :49为流动相，波长为214nm检测阿维拉霉素产物A组分的产量达到O.Mg/Ι，阿维拉霉素A组分发酵产量比对照组提高了 50%。
权利要求
1.一种提高阿维拉霉素发酵产量的方法，其特征在于所述方法使用的菌种为绿色产Streptomyces viridochromogenes Tii-57 ^Streptomyces viridochromogenes NRRL2860;所述方法使用的发酵培养基成分为g/L:葡萄糖20，玉米淀粉40，豆油5 ,NaCl LCaCO3 5, NaNO3 5，CaCl2 10，MgSO4 0. 04，CuSO4 0. 03, (NH4)2SO4 2，加自来水至 1L，消后 pH 控制在7.CT7.2，灭菌温度115 121°C，灭菌时间30 min ；在所述发酵培养基中添加质量浓度为0. 05 2%的氨基酸或富含氨基酸的有机氮源；发酵工艺采用摇瓶发酵工艺，500mL摇瓶装液量50 mL,摇床转速180 240 r/min，接种量为5 15%，培养温度为28 30°C。
2.根据权利要求1所述的提高阿维拉霉素发酵产量的方法，其特征在于所述方法中的氨基酸选自脯氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺的一种或多种组合。
3.根据权利要求1所述的提高阿维拉霉素发酵产量的方法，其特征在于所述方法中富含氨基酸的有机氮源为鱼粉、大豆蛋白胨、黄豆粉、麦芽浸粉的一种或多种组合。
全文摘要
本发明提出一种提高阿维拉霉素发酵产量的方法，其菌种为绿色产绿链霉菌StreptomycesviridochromogenesTü-57或StreptomycesviridochromogenesNRRL2860。其使用的发酵培养基成分为g/L葡萄糖20，玉米淀粉40，豆油5，NaCl1，CaCO35，NaNO35，CaCl210，MgSO40.04，CuSO40.03，(NH4)2SO42，加自来水至1L，消后pH控制在7.0~7.2，灭菌温度115~121℃，灭菌时间30min；在发酵培养基中添加质量浓度为0.05~2%的氨基酸或富含氨基酸的有机氮源；发酵工艺采用摇瓶发酵工艺，500mL摇瓶装液量50mL，摇床转速180~240r/min，接种量为5~15%，培养温度为28~30℃。本发明从氮调控的角度，筛选得到与阿维拉霉素合成有关的氨基酸以及富含氨基酸的有机氮源，在初始培养基中添加一定浓度的氨基酸或有机氮源，可以大幅度提高阿维拉霉素的发酵水平。
文档编号C12P19/60GK102321709SQ20111026942
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月13日 优先权日2011年9月13日
发明者刘芳, 李晓荣, 邹祥 申请人:西南大学