专利名称：一种一步酶法分离培养猪精原干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及细胞分离培养领域，具体涉及一种一步酶法分离培养猪精原干细胞的方法。
背景技术：
精原干细胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是哺乳类动物雄性成体内唯一可将遗传信息传递给下一代的干细胞，它具有多潜能性，能被诱导分化成多种类型的细胞， 在一定情况下它还能生成拟胚体，是一种天然不用转基因就能得到IPS细胞良好材料，而且它生成精子，完成基因的传递，伴随着转基因技术的兴起，它成为一种新的转基因途径。精子发生是一个复杂的过程，是维持雄性生殖能力和生命延续的前提。深入了解精子发生的分子和细胞机理，保护濒危动物物种以及治疗人类因化疗和放疗引起的内源性 SSCs损伤和恢复男性生育能力。精原干细胞技术与动物选种工作相结合，将会大规模的生产出优良家畜。SSCs具有多潜能性并分化为来源于三胚层的多种组织细胞，精原干细胞为今后细胞替代疗法和组织器官移植的来源成为可能。其在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的运用提供了研究基础，对临床医学有较大应用价值。精原干细胞不仅对生物学、生物学技术、医学和发育学等方面的研究具有特殊的价值，使其成为近年来国内外的研究热点。目前研究主要SSCs的分离方法主要集中在机械法和两步酶法消化；而纯化方法主要有差速贴壁法，percoll密度梯度离心法，自然重力沉降法，流式细胞术分选以及免疫磁珠等分选等方法，各种方法都存在着优缺点，根据需要来选择。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的细胞分离培养中存在的不足，提供一种获得细胞容易，培养时间短，细胞增殖快、状态好且操作简便，实验成本低的分离培养猪精原干细胞的方法。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现一种一步酶法分离培养猪精原干细胞的方法，包括如下步骤
(1)将仔猪的睾丸放入盛有PBS的容器中，用PBS洗涤2 3次，去除血污；
(2)去掉睾丸白膜和结缔组织，将剩下的睾丸组织剪成小块，转移到培养皿中；
(3)加入10倍体积的PBS，用吸管吹打，静置，待睾丸组织沉到底部后，弃上清；
(4)重复步骤(3)2 3次；
(5)加入10倍体积的胶原酶消化，于37！的水浴锅100 rpm，然后用吸管吹打，直到看不到组织块；
(6)加入5 10ml的PBS，吹打，在16 °C >600 rpm离心5 min，弃上清，收集底部细胞；
(7)用差异贴壁培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5XIO6个/ml，接种到事先用0. 1 %
3明胶包被的培养瓶中，在无菌培养箱中培养。作为一种优选方案，上述方法中，所述细胞培养箱的培养条件为37 5 % CO2,饱和湿度。通过MTT法对比三种培养基，DMEM、DMEM-Fl2, α -MEM以及血清浓度5 %，10 %，15 %三种浓度培养效果，得出了 DMEM、15 %血清浓度最为适合猪SSCs的增殖培养。根据文献报道，添加非必需氨基酸；β -巯基乙醇，L-谷氨酰胺等是培养细胞基础，起到了营养，抗氧化和能量物质的作用。如表一所示
表1不同培养基和血清浓度对猪SSCs增殖率的影响
权利要求
1.一种一步酶法分离培养猪精原干细胞的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将仔猪的睾丸放入盛有PBS的容器中，用PBS洗涤2 3次，去除血污；(2)去掉睾丸白膜和结缔组织，将剩下的睾丸组织剪成小块，转移到培养皿中；(3)加入10倍体积的PBS，用吸管吹打，静置，待睾丸组织沉到底部后，弃上清；(4)重复步骤(3)2 3次；(5)加入10倍体积的胶原酶消化，于37！的水浴锅100 rpm，然后用吸管吹打，直到看不到组织块；(6)加入5 10ml的PBS，吹打，在16 °C >600 rpm离心5 min，弃上清，收集底部细胞；(7)用差异贴壁培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5XIO6个/ml，接种到事先用0. 1 % 明胶包被的培养瓶中，在无菌培养箱中培养。
2.根据权利要求1所述的一步酶法分离培养猪精原干细胞的方法，其特征在于所述细胞培养箱的培养条件为37 5 % CO2，饱和湿度。
3.根据权利要求1所述的一步酶法分离培养猪精原干细胞的方法，其特征在于所述用于培养细胞的培养液主要成分为=DMEM 83 %，L-谷氨酰胺1 %，非必需氨基酸1 %，β-巯基乙醇55 μ Μ，胎牛血清15%。
全文摘要
本发明公开了一种一步酶法分离培养猪精原干细胞的方法以及培养体系。本发明方法通过采用一步酶法来分离消化猪精原干细胞，替代目前主要采用的两步酶消化方法，该方法获得细胞容易，培养时间短，细胞增殖快、状态好。通过本发明方法，解决了目前精原干细胞分离难、数量少、增殖慢、培养要求高的问题，为快速获取大量猪精原干细胞提供了一种新的方法。而且本方法操作简便，实验成本低，降低了实验失败的风险，易于推广应用。
文档编号C12N5/076GK102417893SQ20111027292
公开日2012年4月18日 申请日期2011年9月15日 优先权日2011年9月15日
发明者张守全, 白银山 申请人:华南农业大学