专利名称：家蚕中肠特异高量表达启动子p2及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程，特别涉及家蚕基因启动子。。
背景技术：
家蚕是一种具有重要经济价值的昆虫，作为鳞翅目的模式生物，家蚕在理论研究和生产应用方面都具有重要作用。中肠是家蚕的一个重要免疫组织器官，很多病原都可以经口食下感染家蚕，当家蚕食下这些病原以后，中肠将是第一个被侵染的组织器官，同时也是家蚕的第一道防线。目前对家蚕中肠的研究比较少，主要原因是可以利用的研究手段有限。随着家蚕基因组框架图和精细图谱绘制工作的相继完成，人类对家蚕的研究和认识已经进入后基因组时代，随着家蚕转基因技术的突破和完善，转基因已经成为家蚕研究基因和利用基因的强有力工具，但转基因技术也需要其他研究工具的配合才能更好的发挥功效。很多家蚕中肠特异表达基因不仅只在中肠表达而且非常高量的在中肠表达，根据信息分析的结果发现，这些中肠特异高量表达的基因可能具有非常重要的作用，其中也包括不少和家蚕免疫抗性相关的基因，要通过转基因来研究和利用这些家蚕中肠特异高量表达的基因就需要有一个家蚕中肠特异高量表达的启动子，但目前没有家蚕中肠特异高量表达启动子的相关报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种启动子，其在家蚕中肠中能特异高量表达。为实现上述目的，本发明的技术方案为
家蚕中肠特异启动子P2，家蚕中肠特异启动子P2含有如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。进一步，家蚕中肠特异启动子P2如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。本发明的目的之二在于提供一种重组载体，其含有家蚕中肠特异启动子P2，该重组载体能保证在家蚕中肠特异性表达。为实现上述目的，本发明的技术方案为 含有所述的家蚕中肠特异启动子P2的重组载体。进一步，所述重组载体为重组表达载体P2-EGFP-SV40-1180，其中P2代表启动子 P2,所述启动子P2上下游分别含有Sal I和BamH I酶切位点，EGFP-SV40-1180具体为含有EGFP T克隆和SV40终止子的pSLfallSOfa载体，所述EGFP T克隆上下游分别含有 BamH I和Not I酶切位点，所述SV40终止子上下游分别含有Not I和HindIII酶切位点。进一步，所述重组载体为重组表达载体pBaC[P2-EGFP-SV40-3XP3-DSRed af]，所述重组表达载体由P2-EGFP-SV40和pBac[3XP3_DsRed af]连接而成，所述P2-EGFP-SV40 为用限制性内切酶Asc I酶切P2-EGFP-SV40-1180所得，所述pBac[3XP3-DsRed af]为经 Asc I酶切后5’端去磷酸化线性片段。
本发明的目的之三在于提供启动子P2的应用，该应用为家蚕中肠外源蛋白的表达提供了新思路。所述的家蚕中肠特异启动子P2在家蚕中肠特异性表达外源蛋白的应用。上述技术方案是通过以下技术路线进行的筛选出家蚕中肠特异高量表达的基因 BGIBMGA014298基因，取该基因ATG前1080bp的基因组序列进行分析，得如SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，上述序列中含有家蚕中肠特异启动子P2 ；制备表达载体 pBac [P2-EGFP-SV40-3 XP3-DsRed af]，并通过显微注射于蚕卵中，并孵化、饲养至化蛾，用荧光显微镜观察仅中肠有强烈的绿色荧光，经过RT-PCR和荧光定量PCR检测仅中肠检测到高表达量的EGFP。本发明的有益效果在于通过信息分析、RT-PCR、荧光定量PCR、蚕卵胚胎显微注射和显微镜荧光观察等实验手段相结合，首次利用转基因克隆鉴定了一个家蚕中肠特异高量表达启动子。本启动子可以特异性的在家蚕中肠高量表达，为研究和利用家蚕中肠特异基因，特别是中肠特异高量表达的免疫抗性相关基因提供了有力的工具；同时也能在家蚕中肠特异高量表达外源基因，具有良好的应用前景。
图1为经显微注射的转基因家蚕和阴性对照家蚕的显微镜下照片，其中A为转基因家蚕明场下照片，B为阴性对照家蚕明场下照片，C为转基因家蚕明场下照片，D为转基因家蚕在GFP激发光下照片。图2为经显微注射的解剖转基因家蚕和解剖阴性对照家蚕的显微镜下照片，其中 A为解剖转基因家蚕明场下照片，B为解剖阴性对照家蚕明场下照片，C为解剖转基因家蚕在GFP激发光下照片，D为解剖阴性对照家蚕在GFP激发光下照片。图3为经显微注射的转基因家蚕的中肠和阴性对照家蚕的中肠显微镜下照片，其中，A为阴性对照家蚕显微镜明场下照片，B为阴性对照家蚕显微镜GFP激发光下照片，C为转基因家蚕的中肠显微镜明场下照片，D为转基因家蚕的中肠显微镜GFP激发光下照片。图4为RT-PCR图，图A为转基因家蚕，图B为阴性对照家蚕，其中，1代表血液，2 代表脂肪体，3代表中肠。上述附图中，转基因家蚕是指经显微注射pBac[P2-EGFP-SV40-3XP3-DsRed af] 成功的家蚕，阴性对照家蚕是指未经任何处理的家蚕。
具体实施例方式实施例1 构建P2介导的EGFP表达载体P2-PR
(1)利用家蚕基因组数据库中的家蚕芯片数据(http //silkworm, swu. edu. cn/ silkdb/)，筛选出家蚕中肠特异表达的基因，然后选择表达量最高的前5个基因，在家蚕基因组数据库中下载这5个基因各自的⑶S序列和ETS序列，利用软件I^rimer Premier 5. 0 分别设计特异检测引物。用大造5龄3天各组织cDNA模板进行RT-PCR检测，PCR扩增条件为94°C预变性4分钟，94°C变性40秒、55°C退火40秒、72°C延伸20秒，共30个循环， 最后72°C延伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，发现BGIBMGA014298基因(该基因全长672bp，包含7个外显子和6个内含子)确实是在家蚕中肠特异高量表达。检测引物 BGIBMGA014298 F: 5’ GATTTGAACCACCGCAGTAT 3，， BGIBMGA014298 (SEQ ID NO:3) R: 5，CGTTGACGGCGACAGAAG3’ (SEQ ID N0:4)；
(2)在家蚕基因组数据库中，该基因的翻译起始位点ATG位于SCaffoldll48的第 1081位碱基，所以选取该基因ATG前IOSObp的基因组序列进行分析，经过网站预测发现 (http://www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html),在这段序列中有典型的启动子结构区域，所以设计特异引物(P2 F: 5’ ACGCGTCGACGTCCCCCATCCAGCAGTC 3’ (SEQ ID N0:5) P2 R: 5，cgGGATCCTTTTTTGCTGAAAGAAACGTACA 3，(SEQ ID N0:6),克隆这 1080bp 的序列P2，以大造基因组为模板，用P2引物进行PCR扩增，获得了目的条带，PCR产物回收后与PMD19-T Simple载体连接，转化DH5 α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海Sangon 测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致；
上述方法获得的家蚕中肠特异表达启动子Ρ2的序列为，如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。 gtcccccatccagcagtcctggtcggtggggacgaagtacggctccgcagcgacagcgacgtcgattga ccactccgccatggtgtggacgaggagatcctgtgccctggcggagtggttcaaattactttgaaggaagcgatgga cacaacccattacggggctacatccatcgctccctcgtctgttccgccctgcggctcgacaacagccgcggcgggaa ctgactcgccggctgcccttgttgcagccggcttctttttctttccgcccctcctcgtgtttgtagaggagggggcg gacttgcacgccgggcccccggcccggtggtcagccttccttttagccgcgtcgcacaagacgcagtgcggcgcggc tgcggtgcaggaggctgccttgtgccccggttggccgcagcggaagcacaggttgctgcggtccccgatagctgttg tcctatccaattccatttttttttcaagtaagccaaatttggagtatgacaacgtattaagactaaataatttcagg catcttgaagtaatgccatacatgtattaaagaacagttcaaaaacatttcatgaatcttgacataataaatatatc tttaatgtcttaaatgaactcatcacgaaaatgaacgaaaactctgcaataaggatgataatatttacttctttgtt tcagtaatattttccaaatttatcaccaatctatcgatttcgtgattatcacgtctcaatttaattttgttttcact ttgaaatgtaataatatacacatttcaatcagataatcttgatcaagattgttttaatgtacgtcagctaatagaga atacgttatcagcttaagcgtaggaaacagTATAAAtaccgaatgaaaattcaataaatcGtacacatttatttggt gaggtaagagcatttgtgtttctcagggaaacactgaaaattacataaattttaacttctgttctctctatcaaaac aatttcaaatcataccagtttaaatcgcaggtgccaagtaacatttatacttcattattgtacgtttctttcagcaa aaaatcgacaATG
其中，G表示转录起始位点；ATG表示翻译起始位点，TATAAA表示TATA盒。则家蚕中肠特异启动子P2含有如SEQ ID No 1所示的核苷酸序列
gtcccccatccagcagtcctggtcggtggggacgaagtacggctccgcagcgacagcgacgtcgattgacca ctccgccatggtgtggacgaggagatcctgtgccctggcggagtggttcaaattactttgaaggaagcgatggacac aacccattacggggctacatccatcgctccctcgtctgttccgccctgcggctcgacaacagccgcggcgggaactg actcgccggctgcccttgttgcagccggcttctttttctttccgcccctcctcgtgtttgtagaggagggggcggac ttgcacgccgggcccccggcccggtggtcagccttccttttagccgcgtcgcacaagacgcagtgcggcgcggctgc ggtgcaggaggctgccttgtgccccggttggccgcagcggaagcacaggttgctgcggtccccgatagctgttgtcc tatccaattccatttttttttcaagtaagccaaatttggagtatgacaacgtattaagactaaataatttcaggcat cttgaagtaatgccatacatgtattaaagaacagttcaaaaacatttcatgaatcttgacataataaatatatcttt aatgtcttaaatgaactcatcacgaaaatgaacgaaaactctgcaataaggatgataatatttacttctttgtttcagtaatattttccaaatttatcaccaatctatcgatttcgtgattatcacgtctcaatttaattttgttttcactttg aaatgtaataatatacacatttcaatcagataatcttgatcaagattgttttaatgtacgtcagctaatagagaata cgttatcagcttaagcgtaggaaacagtataaataccgaatgaaaattcaataaatc 实施例2含有家蚕中肠特异启动子P2的重组载体
将实施例1所述的如SEQ ID N0:2的家蚕中肠特异启动子P2 T克隆上下游分别含有Sal I和BamH I酶切位点，利用已经构建好的载体1180-EGFP-SV40 (分别把上下游各含有BamH I和Not I酶切位点的EGFP T克隆和上下游各含有Not I和Hind III 酶切位点的SV40终止信号序列加到pSLfall80fa载体上)，构建P2介导的EGFP表达载体 P2-EGFP-SV40-1180。然后用限制性内切酶Asc I分别酶切P2-EGFP-SV40-1180和pBac[3XP3_DsRed af]，由于pSLfallSOfa载体骨架在多克隆位点两端都含有一个Asc I位点，切下的EGFP表达骨架结构便可与经Asc I酶切后5’端去磷酸化的pBac[3XP3-DSRed af]线性片段连接，形成最终的P2介导的EGFP转基因表达载体pBac[P2-EGFP-SV40-3XP3-DsRed af]。实施例3启动子功能验证
将实施例2所得重组表达载体pBac [P2-EGFP-SV40-3 X P3-DsRed af]作为显微注射载体，进行家蚕中肠特异表达启动子P2的功能验证。将家蚕大造品种蚕卵浸酸解除滞育以后，放于15°C和80%湿度的黑暗环境中催青直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养(温度25°C，湿度80%)，化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4小时，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射；
将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2小时用Eppendorf显微注射仪将P2-PR和辅助质粒A3H，一起注射进205粒大造蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于 25°C、相对湿度80%的环境中催青孵化，将孵化的139头GO代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾 (详见图1)，GO代蚕蛾通过自交或回交共获得四蛾圈Gl代蚕卵，用Olympus 电动宏观荧光显微镜观察筛选并获得5个阳性蛾圈，转化效率为17. 20%。将获得的阳性蛾圈各自单蛾圈饲养，继代扩大得到5个P2转基因系统，随机选择2 个转基因系统(P2-1，P2-2)进行荧光观察。在荧光显微镜下面甚至可以透过P2的血液和表皮观察到中肠的绿色荧光(结果如图2所示)；用剪刀自家蚕幼虫尾角沿背中线向头部将体壁剪开，打开体腔，用大头针斜插而将两侧体壁固定于蜡盘中，由图3所示在P2转基因系统中肠有强烈的绿色荧光，其他组织没有绿色荧光。取P2-1的中肠、脂肪体和血液等组织材料，提取RNA，反转录成cDNA。利用EGFP 的特异引物进行RT-PCR检测，PCR扩增条件为94°C预变性4分钟，94°C变性40秒、57°C退火40秒、72°C延伸10秒，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图4所示，发现只在中肠检测到EGFP的表达而且表达量很高，说明P2确实是家蚕中肠特异高量表达启动子。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.家蚕中肠特异启动子P2，其特征在于，家蚕中肠特异启动子P2含有如SEQID NO=I 所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的家蚕中肠特异启动子P2，其特征在于，家蚕中肠特异启动子 P2如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。
3.含有权利要求1或2所述的家蚕中肠特异启动子P2的重组载体。
4.根据权利要求3所述的家蚕中肠特异启动子P2的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组表达载体P2-EGFP-SV40-1180，其中P2代表启动子P2，所述启动子P2上下游分别含有Sal I和BamH I酶切位点，EGFP-SV40-1180具体为含有EGFP TA克隆和SV40 终止子的pSLfall80fa载体，所述EGFP T克隆上下游分别含有BamH I和Not I酶切位点，所述SV40终止子上下游分别含有Not I和Hind III酶切位点。
5.根据权利要求3所述的家蚕中肠特异启动子P2的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组表达载体PBac [P2-EGFP-SV40-3 X P3-DsRed af]，所述重组表达载体由EGFP和pBac [3 X P3-DsRed af]连接而成，所述EGFP为用限制性内切酶Asc I酶切 P2-EGFP-SV40-1180所得，所述pBac[3XP3-DsRed af]为经Asc I酶切后5，端去磷酸化线性片段。
6.权利要求1或2所述的家蚕中肠特异启动子P2在家蚕中肠特异性表达外源蛋白的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程，特别涉及家蚕基因启动子，具体为家蚕中肠特异启动子P2，如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，其在家蚕中肠特异性表达外源蛋白的应用，本发明还涉及家蚕中肠特异启动子P2的重组载体及其制备方法；本启动子可以特异性地启动下游基因在家蚕中肠高量表达，为研究和利用家蚕中肠特异基因，特别是中肠特异高量表达的免疫抗性相关基因提供了有力的工具；同时也能在家蚕中肠特异高量表达外源基因，具有良好的应用前景。
文档编号C12N15/63GK102296070SQ20111027339
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月15日 优先权日2011年9月15日
发明者夏庆友, 徐汉福, 王根洪, 程廷才, 蒋亮, 金盛凯, 陆改 申请人:西南大学